تتطور الكينازات البروتينية بشكل كبير الإنزيمات والسقالات التي هي حاسمة لانتشار إشارة بين الخلايا وداخل الخلايا. نقدم بروتوكول لقياس نشاط كيناز من خلال استخدام أدينوسين ثلاثي الفوسفات راديولبلد ([γ- 32 P] أتب)، وهي طريقة موثوق بها للمساعدة في توضيح تنظيم الإشارات الخلوية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
فحص البروتين كيناس النشاط مع راديولابيلد أتب
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
البروتينات كيناسس هي قادرة على التحكم في التغيرات الخلوية واسعة النطاق ردا على صفيفات معقدة من المحفزات، وقد وجه الكثير من الجهد للكشف عن تفاصيل مؤكدة لتنظيمها. وتشتمل كيناسيس على شبكات تشوير تكون عيوبها في كثير من الأحيان سمات لأشكال متعددة من السرطان والأمراض ذات الصلة، مما يجعل من منصة فحص قابلة للتلاعب في العوامل التنظيمية المنبع والتحقق من متطلبات رد الفعل الحرجة في البحث عن العلاجات المحسنة. هنا، نحن تصف مقايسة كيناز الأساسية التي يمكن تكييفها بسهولة لتتناسب مع أسئلة تجريبية محددة بما في ذلك ولكن لا تقتصر على اختبار آثار العوامل البيوكيميائية والدوائية، والتلاعب الجيني مثل الطفرة والحذف، وكذلك ظروف زراعة الخلايا والعلاجات للتحقيق آليات تشوير الخلية. هذا الاختبار يستخدم راديولبلد [γ- 32 P] أتب، والذي يسمح للمقارنات الكمية وتصور واضح من النتائج، ويمكن أن يكون وزارة الدفاعإفيد للاستخدام مع إمونوبريسيبيتاتد أو كيناز المؤتلف، ركائز محددة أو مكتوبة، في جميع أنحاء مجموعة واسعة من ظروف التفاعل.
المقدمة
بروتينات كيناز هي إنزيمات متطورة حرجة لنقل الإشارات الخلوية إلى ردود مناسبة 1 . ونظرا لأدوارهم في الحفاظ على التوازن والوقاية أو تعزيز حالات المرض 2 ، وأساليب الكيمياء الحيوية لتقييم نشاط كيناز لا تزال أدوات قوية لتحديد معالم الإشارات حقيقية النواة 3 . على الرغم من أن استراتيجيات استخدام الأجسام المضادة الفوسفو محددة كانت مفيدة للغاية من حيث قياس آثار ظروف العلاج المختلفة على حالة الخلية إشارة 4 ، فحص كيناز يسمح لقياس آثار ظروف العلاج المختلفة مباشرة من حيث النشاط الأنزيمي من كيناز من فائدة. في حين أن هناك العديد من الخيارات لفحوصات مماثلة التي لا تستخدم المواد المشعة 5 ، ونحن لا نزال نعتمد على هذه الطريقة لكمية قوية من النتائج. هناكهي اثنين من التطبيقات النموذجية لهذا الفحص، على حد سواء قيمة لأسباب مختلفة: إمونوبريسيبيتاتد (إب) فحص كيناز ( الشكل 1 ) وفحص البروتين كيناز المؤتلف ( الشكل 2 ).
مقايسة كيناز إب مفيدة بشكل كبير لتحديد العوامل القادرة على تفعيل كينازات بروتين معينة وكذلك قياس ظروف العلاج المثبطة. وباختصار، يتم نقل كيناز الممزوجة حاتمة من الفائدة إلى خلايا حقيقية النواة مثقف، يتعرض لمجموعة متنوعة من العلاجات، إمونوبريسيبيتاتد، ومعاير للقدرة على دمج الفوسفات راديولبلد في ركيزة نموذج (على سبيل المثال الميالين البروتين الأساسي (مب)). ويمكن أيضا إجراء فحص كيناز إب دون اللجوء إلى أوفيركسريسيون، إما عن طريق إمونوبريسيانتاتيون من البروتين الذاتية أو أي عدد من تقنيات تحرير الجينوم. لأن العلاجات تدار في الثقافة، وهذا الأسلوب يمكن الكشف عن التحفيز تنتقل من خلال عوامل متعددة المنبعأو مسارات موازية من خلال قراءة في المختبر . ميزة رئيسية واحدة من هذا الأسلوب هو أنه لا يتطلب معرفة مسبقة من العوامل المباشرة المنبع أو المصب أو مواقع الفسفرة فيه. وعلاوة على ذلك، مرة واحدة وقد تم تحديد ركائز محددة لكيناز من الفائدة، ويمكن استخدام نفس بروتوكول فحص كيناز مع مكونات المؤتلف لقياس نشاط معين نحو ركائز الطبيعية وتحديد مواقع فسفرة معينة عندما يقترن تحليل الطيف الكتلي. المواقع التي تم التعرف عليها بهذه الطريقة يمكن التحقق من صحة مزيد من المقايسات مع كيناز استخدام المسوخ الركيزة. وأخيرا، يمكن أيضا أن تستخدم هذه الطريقة للكشف وقياس أوتوفوسفوريلاتيون.
بروتوكول المقدمة هنا يفترض إما مخطط تنقية البروتين الأمثل أو طريقة ترنسفكأيشن للتعبير عن كيناز تقارب الموسومة من الفائدة في الخلايا المستزرعة. لمعارض أكثر تفصيلا من ترنسفكأيشن، تحلل، إمونوبرسيبيتاتيون، والبروتين بروتين تنقيةأوكولس، نقترح الإشارة إلى البروتوكولات كولد سبرينغ هاربور 6 . لمزيد من المعلومات حول تطوير مقايسة وتعديل، يرجى الرجوع إلى البروتين الفسفرة: طرق مختارة في الإنزيمية 7 .
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. كيناز تنقية الموارد و إمونوبريسيبيتاتيون خط أنابيب
ملاحظة: كيناسيس للاستخدام مع هذا الفحص قد تكون مصدرها إمونوبريسيبيتاتس من الخلايا المستزرعة أو وسائل المؤتلف مثل تنقية تقارب الموسومة 6 . وفيما يلي بروتوكول عام للعلم الموسومة مناعي التي قد تضطر إلى تعديل اعتمادا على كيناز الفائدة. يجب حفظ كل شيء على الجليد عند الإمكان.
- إضافة 2 ميكرولتر من 1 ملغ / مل الأجسام المضادة إلى 200 ميكرولتر من ليسيتس الخلية (عادة ~ 1 ملغ / مل تركيز البروتين الكلي) واحتضان عند 4 درجات مئوية لمدة 1 ساعة بينما هزاز.
- غسل البروتين وحبات سيفاروس 2-3 مرات مع العازلة تحلل (انظر أدناه) عن طريق الغزل لفترة وجيزة في 4 درجات مئوية لمدة 30 ثانية إلى 1 دقيقة في 5000 x ج ("تدور اللمس")، وإزالة طاف مع ماصة، وإعادة تعليق الخرز في المخزن المؤقت .
- إعداد تحلل العازلة: 50 ملي هيبيس الرقم الهيدروجيني 7.7، 150 ملي كلوريد الصوديوم، 1.5 ملي مغكل 2، 1 ملي إغتا، 10٪ الجلسرين، 0.2 ملي أورثوفاناديت الصوديوم، 100 ملي فلوريد الصوديوم، 50 ملي β- غليسيروفوسفهات، 0.1٪ تريتون X 100 أو 0.1٪ نب-40.
- إضافة 30 ميكرولتر من الطين 50٪ من البروتين A الخرز سيفاروس في تحلل العازلة إلى ليسيتس؛ احتضان في 4 درجات مئوية لمدة 1 ساعة بينما هزاز.
- لمس تدور في 4 درجات مئوية لبيليه الخرز وإزالة طاف.
- غسل 3 مرات مع 1 مل من حبة غسل العازلة (1 M كلوريد الصوديوم، 20 ملي تريس درجة الحموضة 7.4).
- يغسل مرة واحدة مع 1X كيناز رد فعل العازلة (10 ملي هيبيس درجة الحموضة 8.0، 10 ملي مغكل 2 ). إزالة أكبر قدر ممكن من المخزن المؤقت دون إزالة الخرز.
2. إنيتياليزينغ كيناس ردود الفعل
ملاحظة: لفحوصات كيناز إب، ~ 15 ميكرولتر من الخرز غير معلق هو نموذج البداية نموذجية. بالنسبة لفحوصات كيناز البروتين المؤتلف، تتراوح كميات البداية النموذجية من 0.1-1.0 ميكروغرام في 1-10 لأحجام التفاعل النهائية 25-50 ميكرولتر. ضبط وحدات التخزين من عينة البروتين المؤتلفs لتكون متساوية مع المخزن المؤقت يتم تخزينها في قبل تهيئة الفحص. عند استخدام كميات عالية من كيناز، وتشمل بروتين الناقل مثل بسا للمساعدة في الحفاظ على استقرار البروتين لمدة الفحص.
- إعداد 5X كيناز رد فعل العازلة الواردة أدناه:
50 ملي هيبيس الرقم الهيدروجيني 8.0
50 ملي مغكل 2
50 ملي بنزاميدين (مثبط البروتياز)
50 ملي دت (عامل تخفيض)
250 ميكرومتر أتب (غير المسماة، أو "الباردة") - الحفاظ على عينات كيناز على الجليد في أنابيب 1.5 مل. إعداد خليط التفاعل التالي في منفصلة، المبردة 1.5 مل أنابيب:
21 ميكرولتر H 2 O
6 ميكرولتر 5X كيناز رد فعل العازلة
1 ميكرولتر راديولبلد ("الساخنة") أتب
2 الركيزة ميكرولتر (~ 5 ملغ / مل)
ملاحظة: لفحوصات كيناز المؤتلف، قد يتم تعديل حجم لاستيعاب البروتين المنقى. حساب مثل هذا الحجم التفاعلي النهائي هو 30 ميكرولتر. استخدام هذه الوصفة لإعداد سيدمزج. عند استلام أتب المسمى، مخفف الأسهم في H 2 O إلى نشاط محدد من 0.01 ميسي / ميكرولتر قبل إضافة إلى خليط التفاعل. - لتهيئة الفحص، إضافة خليط التفاعل الكامل إلى عينة كيناز واحتضان رد فعل في 30 درجة مئوية لمدة 5 دقائق إلى 1 ساعة اعتمادا على نشاط كيناز يجري مقايسة.
ملاحظة: عند العمل مع كيناز الذي لم يتم تقييم نشاط سابقا، إجراء دورة الوقت من النشاط كيناز مع فترات 5 دقائق بين نقاط الوقت.
3. رد الفعل إنهاء و سدز-بادج
- وقف رد فعل من خلال وضع على الجليد وإضافة 7.5 ميكرولتر 5X العازلة عينة ليملي 6 .
- الحرارة عند 100 درجة مئوية لمدة 30 ثانية إلى 2 دقيقة في كتلة الحرارة.
- اللمس تدور وتحميل 20 ميكرولتر لكل بئر على 10-15٪ سدز-بادج هلام. تشغيل هلام طويلة بما فيه الكفاية لفصل كيناز والركيزة (عادة 1 ساعة في قوة ثابتة من 5 W) تأكد من الحفاظ على جهاز هلام محمية للحد من التعرض ل 32 P.
- هنا، استخدام أجهزة هلام محلية الصنع، ولكن القياسية المتاحة تجاريا مصغرة هلام هي مناسبة تماما. استخدم الأبعاد كما يلي:
المواد الهلامية: 8 سم العرض، 5.5 سم طول (حل)، سمك 1.5 مم.
أمشاط: 15 بئرا، سمك 1.5 مم، عرض 2.9 مم، عمق 16 ملم
- هنا، استخدام أجهزة هلام محلية الصنع، ولكن القياسية المتاحة تجاريا مصغرة هلام هي مناسبة تماما. استخدم الأبعاد كما يلي:
4. جل تلطيخ والتجفيف
تنبیھ: یجب أن تکون جمیع الخطوات مؤکدة للحد من التعرض الشخصي ل 32 P باستخدام التدریع المشع وارتداء معدات الوقایة الشخصیة. لمزيد من المعلومات حول خطوات محددة يتم تضمين بعض المراجع المفيدة.
- إزالة هلام من الزجاج / الألومينا لوحات ومكان في 50 مل كوماسي وصمة عار (10٪ حمض الخليك الجليدي، 50٪ الميثانول، 0.25٪ R-250 صبغ) لمدة 1 ساعة على شاكر المداري تعيين إلى 50 دورة في الدقيقة. لهذه الخطوة استخدام حاوية أكبر قليلا من هلام نفسها. 8
- نقل هلام من وصمة عار لإصلاح الحل (10٪ جلي الخليك أسيد، 20٪ الميثانول) من أجل إزالة وصمة عار. روك الهلام في 600-700 مل من حل تحديد بين عشية وضحاها على شاكر المداري في 50 دورة في الدقيقة. مكان قطع من رغوة أو معقود مناديل مختبر في الحاوية مع هلام لامتصاص صبغ كوماسي 8 ، 9 .
- إزالة هلام من تحديد الحل ونقع في 200 مل الميثانول لمدة 1-2 دقيقة مع التحريض لطيف حتى هلام يتحول الأبيض حليبي. وهذا سوف يساعد على منع تكسير خلال خطوة التجفيف.
- الرطب 14 سم × 14 سم قطعة من ورقة مرشح النوعي مع الميثانول ومكان على بلاطة هلام فراغ بلاطة. وضع هلام أسفل على الجانب الأمامي ورقة مرشح مواجهة.
- تغطية هلام مع التفاف البلاستيك بعناية لتجنب التجاعيد والهواء فقاعات. تشغيل مجفف لمدة 1.5 ساعة عند 80 درجة مئوية. بعد أن تم تحقيق الفراغ فتح الغطاء ولف أي فقاعات الهواء إذا لزم الأمر مع لينة المطاط المطاط.
5. أوتوراديوغرام والتلألؤ التهم
- إزالة دريهلام إد وإرفاق علامة أوتوراد، حاكم الفسفورية أو النقاط إلى ورقة الترشيح على جانب هلام. إذا كنت تستخدم النقاط تأكد من أنها في نمط غير المتماثلة. هذا سوف محاذاة هلام مع الفيلم بعد التعرض والتنمية.
- استخدام عداد جيجر للتحقق من شدة الإشارة. لتعرض الإشارات الأضعف في -70 درجة مئوية إلى -80 درجة مئوية مع شاشة تكثيف زيادة كثافة الفرقة الفيلم.
- في غرفة مظلمة وضعت هلام المجففة في فيلم كاسيت مع فيلم وشاشة تكثيف في الترتيب التالي من أعلى إلى أسفل: هلام، فيلم، وتكثيف الشاشة.
- إرفاق الشاشة المكثفة لغطاء الكاسيت والشريط هلام في مكان لجعل هذه الخطوة أسهل. تنبعث الشاشة المكثفة الضوء عندما تشعع جزيئات بيتا من 32 P. هذه الانبعاثات الخفيفة تخترق الفيلم أكثر كفاءة من جزيئات بيتا.
- تأكد من أن طول الموجة المنبعثة من تكثيف الشاشةالبرك إلى الطول الموجي الفيلم هو الأكثر حساسية ل.
- استخدام عداد جيجر لتحديد كم من الوقت لتترك التعرض ل: إذا كان عدد كيم ~ 100 أو أقل، حاول بين عشية وضحاها في -70 درجة مئوية. إذا العد هو ~ 10،000، تبدأ مع التعرض 1 ساعة وتحسين من هناك.
- في ختام التعرض إزالة الفيلم وتطوير في المعالج الطبي / الأشعة السينية فيلم. إذا تم إجراء التعرض في -70 إلى -80 درجة مئوية، إما السماح كاسيت لتدفئة إلى درجة حرارة الغرفة لتقليل التكثيف على الفيلم أو إزالة الفيلم مباشرة قبل التكثيف أشكال 10 .
- وضع الفيلم على ورقة هلام / مرشح المجففة ومحاذاة صورة علامة / النقاط مع علامات / النقاط على هلام المجففة. علامة على الفيلم العصابات المقابلة لمعايير البروتين. تسمية معايير البروتين والتي يمر ردود الفعل هي للرجوع إليها في المستقبل.
- استئصال العصابات من هلام التي تتوافق مع فرق من الفائدة على الفيلم ووضعهافي 7 مل قوارير التلألؤ. إضافة 4 مل من سائل التلألؤ والعد مع عداد التلألؤ السائل. تأكد من ضبط العداد لمراقبة نافذة طيف الطاقة الصحيحة ل 32 ص.
ملاحظة: تأكد من أيضا مكوس الفرقة المقابلة للركيزة من حارة التحكم لا كيناز. سيتم استخدام هذا لحساب الإشعاع الخلفية التي سيتم طرحها من جميع التهم التلألؤ عينة.
6. تحليل النتائج
ملاحظة: يوفر أوتوراديوغرام التصور النوعي للنتائج. ولقياس الكميات الدقيقة، يمكن قياس التضمين 32 P بواسطة عداد التلألؤ. يتم التعبير عن البيانات عادة من حيث النشاط النسبي، كما هو مبين في الشكل 1B . وطالما تم الحفاظ على ظروف موحدة لجميع العينات، والقياسات النسبية لنشاط معين كافية لمقارنة العلاجات.
- عند حساب قيم النشاط المحدد المطلق، قم بإجراء الدقةأوس الأمثل لجميع ظروف التفاعل، بما في ذلك كيناز، الركيزة، وتركيزات أتب الباردة، من أجل ضمان نطاق خطي من النشاط على مدى دورة الزمن (على سبيل المثال 2 × [كيناز] = 2 × نشاط معين). ل كيناسيس مع نشاط معين عالية، إجراء المقايسات مع زيادة تركيز الركيزة في حالة النشاط كيناز محدودة بمقدار الركيزة.
- حساب النشاط المحدد للكيناز من الفائدة في وحدات من نانوموليز الفوسفات نقلها في الدقيقة لكل كيناز ملغ.
- اطرح الفراغات من التكلفة لكل ألف ظهور في النطاقات المحسوبة.
- احسب تسوس أتب الساخن: [(1/2) ^ (t / t 1/2 )] x 0.95 حيث t هو عدد الأيام منذ تاريخ المرجعية (يجب أن يوفرها البائع)، t 1/2 هو نصف عمر 32 P، وهو 14.3 يوما، و 0.95 يعكس كفاءة عداد التلألؤ. مثال: إذا كان استخدام أتب الساخن الذي هو 28 يوما من العمر، يجب أن تكون قيمة الاضمحلال 0.245.
- احسب(بمول) من مجموع أتب في الفحص (عادة هذا يساوي كمية أتب الباردة في رد الفعل): حجم الفحص (ميكرولتر) × [أتب الباردة] (ميكرومتر) = إجمالي أتب (بمولس). مثال: 30 ميكرولتر × 50 ميكرومتر = 1500 بمول
- حساب كيم / بمول أتب: [ميكرولتر من أتب الساخنة × (2.2 × 10 7 ) عامل تسوس] / بمول من أتب الباردة.
ملاحظة: قيمة 2.2 × 10 7 تحويل 0.01 مسي / ميكرولتر من أتب إلى كيم. - حساب كمية كيناز في الفحص في ملغ. لكل من كيناز المؤتلف و كيناسس إمونوبريسيبيتاتد، أساليب قياسية مثل المقايسات بكا هي مناسبة لتحديد تركيزات البداية. مثال: wtERK2 0.0002 ميكروغرام / ميكرولتر في رد فعل كيناز 50 ميكرولتر هو 0.01 ميكروغرام، أو 1 × 10 -5 ملغ.
- حساب إجمالي التكلفة لكل ألف ظهور في الفحص. تجميع 30 ميكرولتر ردود الفعل وتشغيل 20 ميكرولتر من كل رد فعل على هلام. ضرب عد في الدقيقة (بعد الطرح فارغة) من خلال عامل من إجمالي حجم الفحص / حجم تحميلها. الاستمرار في ما سبقعلى سبيل المثال، ضرب كل التهم بمقدار 1.5، أو 30/20.
- حساب النشاط المحدد من كيناز أكيد:
مجموع كيم في مقايسة) / (كيم / بمول أتب) / (فحص الوقت بالدقائق) / (كمية كيناز في ملغ)
ملاحظة: تقسيم القيمة أعلاه بنسبة 1،000 ينتج النشاط المحدد في نانوموليز / دقيقة / ملغ
- حساب عدد مولز الفوسفات تدرج في الركيزة (طالما وزنه الجزيئي هو معروف). ويستخدم هذا لتحديد عدد الفوسفوسايت على بروتين معين مرة واحدة وقد ذهب رد الفعل إلى الانتهاء.
إجمالي قيمة النقرة في الفحص) / (كيم / بمول أتب)] / (كمية الركيزة في بمولس)
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
WNK1 إب المقايسات كيناز
تم ترانزفكتد ميك الموسومة WNK1 إلى خلايا HEK293 و إمونوبريسيبيتاتد مع الأجسام المضادة لمكافحة ميك 11 . و إيمونوبريسيبيتات عرض نشاط كيناز نحو الركيزة نموذج مب وكذلك نحو نفسها ( الشكل 1A ). ثم تم اختبار المسوخ WNK1 لنشاط كيناز نحو مب من نفس الطريقة، وهذه المرة توظيف يبني غست الموسومة (
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
كيناسس هي عائلة متنوعة من البروتينات التي تطورت وظائف واسعة في سياقات عديدة، وكانت مقايسات كيناز مفيدة بشكل لا يصدق في دراسة عدة بروتينات التشوير وساهمت بشكل كبير في فهمنا الحالي للاتصالات الخلوية. ومن الجدير بالذكر أن نفس المقايسة الأساسية استخدمت في تمييز كينازين متباينين على الرغم من الاختلافات الرئيسية في الهيكل والنشاط. يحتوي كيناز WNK1 على جيب حفاز غير نمطي حيث تحولت ليسين الحرجة إلى موقف فريد ومن المعروف أن تلعب الأدوار في تنظيم كوتراتيون كلوريد كوترانسبورترز من خلال كل م...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
شكر وتقدير
يشكر المؤلفون جميع الأعضاء الحاليين والسابقين في مختبر كوب على العمل والمناقشات القيمة، وديون وير للمساعدة الإدارية. وقد دعمت هذه الدراسات من قبل المعاهد الوطنية للصحة منحة R37 DK34128 و مؤسسة ولش منحة I1243 إلى مهك
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| البروتين أ Sepharose CL-4B | GE Healthcare Life Sciences | 17-0963-03 | |
| Radiolabeled [γ-32P] ATP | Perkin Elmer | NEG035C010MC | |
| Laemmli Buffer | Bio-Rad | # 1610737 | |
| منتجات أبحاث التدريع | المشع الدولية | BR-006 | |
| R-250 صبغة (كوماسي) | Thermo Fisher | 20278 | |
| Whatman Grade 3 ورق ترشيح نوعي | Whatman | 1003-917 | |
| بلاطة جل فراغ مجفف | Bio-Rad | موديل 583 جل مجفف #1651745 | |
| علامة Autorad | Agilent Technologies | 420201 | |
| مسطرة الفوسفور | Sigma Aldrich | R8133 | |
| النقاط الفوسفورية | Sigma Aldrich | L5149 | |
| Geiger counter | Ludlum | Model 3 مع كاشف | |
| كاسيت BioMax 8 × 10 " | Carestream Health | 107 2263 | |
| BioMax MS Film 8 × 10 " | Carestream Health | 829 4985 | |
| BioMax MS Intensifying Screen 8" × 10" | Carestream Health | 851 8706 | |
| معالج أفلام طبي / بالأشعة | السينية Konica Minolta | SRX-101A | |
| قوارير التلألؤ | منتجات البحوث الدولية | 125500 | |
| سائل التلألؤ | MP Biomedicals | 188245305 | |
| بيكمان LS 6500 عداد الوميض | بيكمان | LS 6500 |
المراجع
- Raman, M., Chen, W., Cobb, M. H. Differential regulation and properties of MAPKs. Oncogene. 26 (22), 3100-3112 (2007).
- Wellbrock, C., Arozarena, I. The Complexity of the ERK/MAP-Kinase Pathway and the Treatment of Melanoma Skin Cancer. Front Cell Dev Biol. 4, 33(2016).
- Yang, T., Terman, J. R. Characterizing PKA-Mediated Phosphorylation of Plexin Using Purified Proteins. Methods Mol Biol. 1493, 147-159 (2017).
- Ross, H., Armstrong, C. G., Cohen, P. A non-radioactive method for the assay of many serine/threonine-specific protein kinases. Biochem J. 366 (Pt 3), 977-981 (2002).
- Akita, S., Umezawa, N., Kato, N., Higuchi, T. Array-based fluorescence assay for serine/threonine kinases using specific chemical reaction. Bioorg Med Chem. 16 (16), 7788-7794 (2008).
- Cold Spring Harbor Protocols. , Available from: http://cshprotocols.cshlp.org/ (2016).
- Dalby, K. N. Protein Phosphorylation: Selected Methods in Enzymology. J Am Chem Soc. 121 (51), 12215(1999).
- Roland, J. Coomassie Staining and Destaining. , Available from: http://www.cytographica.com/lab/protocols/gel_destain.html (2007).
- Autoradiography. , Available from: https://www.nationaldiagnostics.com/electrophoresis/article/autoradiography (2011).
- Walker, J. M. The Protein Protocols Handbook. , 3 edn, Humana Press. (2009).
- Xu, B. WNK1, a novel mammalian serine/threonine protein kinase lacking the catalytic lysine in subdomain II. J Biol Chem. 275 (22), 16795-16801 (2000).
- McReynolds, A. C. Phosphorylation or Mutation of the ERK2 Activation Loop Alters Oligonucleotide Binding. Biochemistry. 55 (12), 1909-1917 (2016).
- Carlson, S. M. Large-scale discovery of ERK2 substrates identifies ERK-mediated transcriptional regulation by ETV3. Sci Signal. 4 (196), rs11(2011).
- Courcelles, M. Phosphoproteome dynamics reveal novel ERK1/2 MAP kinase substrates with broad spectrum of functions. Mol Syst Biol. 9, 669(2013).
- Myers, S. M. High-Throughput Screening and Hit Validation of Extracellular-Related Kinase 5 (ERK5) Inhibitors. ACS Comb Sci. 18 (8), 444-455 (2016).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
