Method Article

على طريقة تجميع خلية فعالة ومرنة ل3D كروي الإنتاج

DOI:

10.3791/55544

⸱

March 27th, 2017

 ,  , 
1Division of Cancer Biology and Genetics, Queen's University Cancer Research Institute, 2Department of Pathology and Molecular Medicine, Queen's University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نصف بروتوكولا سريعا ومرنا لتكوين كرويات الخلايا ثلاثية الأبعاد من خلال تجميع الخلايا. يمكن تكييف هذا بسهولة مع أنواع متعددة من الخلايا وهو مناسب للاستخدام في مجموعة متنوعة من التطبيقات بما في ذلك هجرة الخلايا أو الغزو أو فحوصات anoikis ، ولتصوير وقياس تفاعلات مصفوفة الخلية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ثقافة الخلية أحادي الطبقة لا نموذجا كاف السلوك في الجسم الحي من الأنسجة، الذي ينطوي على خلية خلية وخلية مصفوفة التفاعلات المعقدة. ثلاثي الأبعاد تقنيات زراعة (3D) الخلية هي ابتكار حديث وضعت لمعالجة أوجه القصور في زراعة الخلايا الملتصقة. بينما العديد من التقنيات لتوليد نظائرها الأنسجة في المختبر تم وضعها، وهذه الأساليب هي في كثير من الأحيان معقدة ومكلفة لتأسيس، تتطلب معدات متخصصة، وتقتصر عموما التوافق مع فقط أنواع الخلايا معينة. هنا، نحن تصف بروتوكول سريع ومرن لتجميع الخلايا في الأجسام الشبه الكروية 3D متعددة الخلايا من حجم ثابت متوافق مع نمو مجموعة متنوعة من الأورام وخطوط الخلايا العادية. نحن نستخدم تركيزات مختلفة من المصل وميثيل السليلوز (MC) لتشجيع جيل كروي مستقل مرسى ومنع تشكيل الطبقات الوحيدة الخلية بطريقة استنساخه للغاية. الظروف المثلى لالكلاسيكي فرديخطوط الخلايا idual لا يمكن أن يتحقق من خلال تعديل MC أو تركيزات مصل في المتوسط ​​تشكيل كروي. الأجسام الشبه الكروية 3D المتولدة يمكن جمعها لاستخدامها في مجموعة واسعة من التطبيقات، بما في ذلك إشارات الخلية أو دراسات التعبير الجيني، مرشح فحص المخدرات، أو في دراسة العمليات الخلوية مثل غزو الخلايا السرطانية والهجرة. كما تكييف بروتوكول بسهولة لتوليد الأجسام الشبه الكروية نسيلي من الخلايا واحدة، ويمكن تكييفها لتقييم النمو المستقل مرسى وanoikis المقاومة. وعموما، يوفر بروتوكول لدينا وسيلة للتعديل بسهولة لتوليد واستخدام الكروية خلية 3D من أجل تلخيص المكروية 3D الأنسجة ونموذج للنمو في الجسم الحي من الخلايا الطبيعية والسرطانية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقييم بيولوجيا السلوك الخلايا السرطانية يتحدى باستخدام ثنائي الأبعاد (2D) منهجيات زراعة الخلايا التقليدية، في جزء منه لأن هذه لا تعكس بشكل كاف المكروية الخلايا الموجودة في الجسم الحي. النهج البديلة تتضمن مكونات المصفوفة خارج الخلية في الثقافة (على سبيل المثال، بويدن المقايسات غرفة) هي ممثلة أكثر من الناحية الفسيولوجية للفي الجسم الحي بيئة الأنسجة. ومع ذلك، فإنها يمكن أن تقتصر على تقييم سلوك الخلية الفردية، وليس تلخيص مجمع في مجموعات المجراة من خلية مصفوفة وخلية خلية التفاعلات التي تساهم في الأنسجة أو الورم النمو 1، 2، 3.

استخدام الكروية المتعددة الخلايا هو نهج مؤخرا أن يستنسخ أكثر دقة الهندسة المعمارية المدمجة في الجسم الحي نمو الخلايا 1،4. الكروية يمكن استخدامها لتحقيق التفاعلات خلية مصفوفة من الخلايا الطبيعية، ولكن يمكن أن تعمل أيضا نظائرها ورم لنموذج خصائص تطور الورم، مثل النمو المتنقل أو المقاومة للأدوية (4).

ويمكن تشكيل الأجسام الشبه الكروية من انتشار الخلايا واحد جزءا لا يتجزأ من مصفوفة 5 أو أكثر بسرعة، من خلال تشجيع تجميع خلايا متعددة لتشكيل كتلة خلية واحدة (على سبيل المثال، والشنق قطرة، وأساليب الطرد المركزي) 6 و 7. قد تتطلب تقنيات خلية تجميع القائمة مواد مكلفة أو المعدات المتخصصة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن هذه الأجسام الشبه الكروية لديها مجموعة واسعة من الأحجام والأشكال التضاريسية وقد يكون من الصعب إنتاج بكميات كبيرة، مما يجعل المقارنات بين ظروف النمو أو العلاجات الصعبة. وأخيرا، يمكن الكروية التي تولدها هذه الأساليب يكون من الصعب عزل من extracel البروتينيةمصفوفة lular التي هي جزء لا يتجزأ من أجل الاستخدام في تطبيقات أخرى.

هنا، نحن تصف منهجية خلية تجميع قوية وسهولة التعديل على الإسراع في تشكيل الأجسام الشبه الكروية خلية الحجم باستمرار باستخدام لوحات المتاحة تجاريا U-أسفل الخلية طارد ومصفوفة تعزيز التصاق الخاملة، ميثيل السليلوز. تشكلت مرة واحدة، يتم عزل هذه الأجسام الشبه الكروية المتعددة الخلايا بسهولة لاستخدامها في مجموعة واسعة من التطبيقات. كما تكييفها بروتوكول بسهولة لتوليد الأجسام الشبه الكروية من خلال تكاثر الخلايا، والتي يمكن استخدامها لتقييم عمليات الخلايا الأخرى. هنا، وتبين لنا المقايسات غزو الخلايا، كميا عن طريق تلطيخ المناعي، وفحص anoikis، كمثال تطبيقات هذين مختلف البروتوكولات تشكيل كروي.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم سرد كافة الكواشف والمواد الاستهلاكية في قائمة المواد: ملاحظة.

1. إنتاج كروي من قبل تجميع الخلية

  1. الميثيل السليلوز الحل: إعداد 100 مل من 100 ملغ / مل السليلوز الميثيل.
    1. الحرارة 50 مل عالى النقاء H 2 O إلى 80 درجة مئوية. إضافة 10 غرام من مسحوق السليلوز الميثيل وتستنهض الهمم حتى فرقت الجسيمات بالتساوي.
    2. جلب إلى الحجم النهائي مع عالى النقاء البارد H 2 O ويقلب في 4 درجات مئوية حتى يصبح حل واضح والقش الملون، ويحتوي على أي مواد صلبة واضحة.
    3. تمر من خلال مرشح 0.45 ميكرون لإزالة المواد الصلبة غير منحل. يمكن aliquoted الحل استعداد وتخزينها في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 12 شهرا.
      يخدم الميثيل السلولوز كمجموعة غير السامة للخلايا، خامل تعليق وكيل، لتعزيز التصاق الخلية خلية وتثبيط تشكيل أحادي الطبقة خلية ملتصقة: ملاحظة. الميثيل السليلوز هو للذوبان في الماء، ويمكن أن جرفت التالية spherجيل OID.
  2. متوسطة تشكيل كروي
    ملاحظة: إعداد المتوسطة تشكيل كروي فورا قبل الاستخدام. لا تخزن.
    1. تمييع الميثيل حل السليلوز إلى 1-5 ملغ / مل في مستنبت المناسبة.
    2. تمر من خلال مرشح 0.22 ميكرون لتعقيم وإزالة المواد الصلبة غير منحل.
  3. الفوسفات مخزنة المالحة Dulbecco و(PBS)
    1. تمييع ل1x أخرى ويمر عبر مرشح 0.45 ميكرون قبل الاستخدام. قد تكون مخزنة حل استعداد إلى أجل غير مسمى في درجة حرارة الغرفة.
  4. إنتاج كروي الخلية (الشكل 1)
    ملاحظة: إعداد جميع الكواشف مقدما. من المهم تجنب التلوث من الحلول من خلال الغبار والألياف أو جزيئات غير قابلة للذوبان الأخرى. إن وجود هذه الملوثات تؤثر سلبا على تشكيل كروي. يجب أن يتم تمرير ثقافة المتوسطة وغيرها من الحلول من خلال مرشح 0.45 ميكرون لإزالة هذه الجزيئات عند نقاط البيعsible. تجنب استخدام ماصات تصفيتها القطن عند نقل الحلول وهذه يمكن أن إدخال الألياف إضافية.
    1. الطبقات الوحيدة الخلية الثقافة إلى 70٪ التقاء في الثقافة المناسبة تستكمل المتوسطة مع 10٪ مصل. نضح مستنبت وشطف مع برنامج تلفزيوني 1X لإزالة الأنقاض. إضافة 3 مل من التربسين-EDTA (0.05٪ التربسين) عازلة التفكك إلى صحن 10 سم ثقافة الخلية، واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
    2. تفقد الخلايا تحت المجهر في 10X التكبير لتأكيد انفصال. تحييد عازلة التفكك مع 7 مل من مستنبت تستكمل المصل.
    3. تعليق خلية الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 10 دقيقة إلى خلايا بيليه بلطف.
    4. إزالة طاف. بيليه الخلية resuspend في 1 مل تشكيل كروي المتوسطة باستخدام ماصة P1000 مع الفلتر.
      ملاحظة: يجب أن يكون التعليق الخلية خالية من كتل.
      1. ليسحن بيليه الخلية، اضغط على طرف ماصة ضد الجزء السفلي من أنبوب في زاوية طفيف في حينpipetting لللقص بيليه الخلية. تجنب الطحن أكثر من 3-5 مرات وهذا يمكن أن يؤدي إلى تلف الخلايا. ماصة ببطء وعدم طرد محتويات طرف ماصة لتجنب خلق فقاعات.
    5. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات وتمييع تعليق خلية إلى 1 × 10 4 خلية / مل.
      ملاحظة: يمكن أن يكون الأمثل وعدد الخلايا لتوليد الأجسام الشبه الكروية من أحجام مختلفة. التريبان تلطيخ الأزرق من الخلايا التالفة يمكن أن تستخدم لتأكيد بقاء الخلايا معلق.
    6. تعليق خلية نقل إلى العقيمة، خالية من الغبار ماصة الأقنية الخزان واستخدام النصائح مرشح للاستغناء 100 ميكرولتر في كل بئر من جيد 96 U-أسفل لوحة خلايا طارد.
      1. خزان شطف مع تصفيتها عالى النقاء H 2 O لإزالة الغبار والألياف.
      2. مزيج تعليق خلية دوري بينما البذر لمنع الخلايا من تسوية في الجزء السفلي من الخزان. لتجنب خلق فقاعات، واستخدام تقنية pipetting لعكس حين خلط وdispensinز.
    7. لوحات نقل إلى نسيج الثقافة الحاضنة (37 درجة مئوية و 5٪ CO 2) وتفقد يوميا لتشكيل كروي. يجب أن الخلايا تستقر في الجزء السفلي من كل بئر في 6 ساعات وتجميع عموما إلى كروي ضمن 24-48 ساعة (الشكل 2).
    8. لتأكيد تشكيل كروي ناجح، استخدم طرف P10 وبلطف ماصة المتوسطة على كروي مع مراعاة تحت المجهر في التكبير 10x. صحيح الكروية شكلت سوف تخفف من لوحة ولفة، مؤكدا هيكل 3D الخاصة بهم.
      وينبغي أن تحدد ميثيل السليلوز ومصل تركيزات من قبل المعايرة لكل خط الخلية لانتاج تشكيل كروي واحد لكل بئر: ملاحظة. وأظهرت الظروف الأمثل في هذا الطريق لخطوط الخلية المحددة في الجدول رقم 1، وأمثلة من الكروية تشكلت في الشكل 2B. قد نمت الكروية لفترة أطول مما هو مذكور ولكن عندما تصبح أكبر عندما يكبرون تدريجيا أكثر صعوبةللتعامل مع دون تجزئة. إذا تشكل خلايا أحادي الطبقة، الكروية الأقمار الصناعية، أو تفشل في تستقر في قاع البئر، قد تحتاج إلى مزيد من التعديل لتكوين كروي الأمثل (الشكل 3B) تركيز ميثيل السليلوز ومصل الدم. لا تستخدم الكروية التي تحتوي على ملوثات مثل الألياف أو الغبار (الشكل 3A). الكروية قبل تشكيلها يمكن علاجها مع المركبات ذات الأهمية مثل عوامل النمو والبقع الخلية الحية، أو مثبطات للتحليل.

2. الجسم الشبه الكروي الغزو الفحص (الشكل 4)

  1. الكولاجين تحييد
    1. تبريد جميع السوائل إلى 4 درجات مئوية، وعقد على الجليد عند العمل مع الكولاجين لمنع البلمرة غير المرغوب فيها.
    2. إعداد الطازجة 0.1 م و 0.01 م حلول من هيدروكسيد الصوديوم والطازجة 0.1 M حمض الهيدروكلوريك في عالى النقاء H 2 O. ممر جميع الحلول من خلال 0.22 ميكرون مرشحات.
    3. مزيج نوع البقري 1 الكولاجين (3.1 ملغ / مل الأسهم)، 0.01 M هيدروكسيد الصوديوم و 10x برنامج تلفزيوني (8: 1: 1 نسبة من حيث الحجم) والتكيف مع درجة الحموضة 7.4 باستخدام البارد 0.1 M هيدروكسيد الصوديوم وحمض الهيدروكلوريك. التركيز النهائي من الكولاجين هو 2.5 ملغ / مل.
    4. إعداد ما يكفي من الكولاجين تحييد لملء وعاء التصوير على عمق 2-3 ملم. مطلوب ما لا يقل عن 100 ميكرولتر لكل بئر من 8 جيدا زراعة الأنسجة الشرائح غرفة المدرجة في قائمة المواد.
  2. تضمين الكروية في الكولاجين (الشكل 4)
    1. معطف أسفل كل بئر من شريحة 8 جيدا غرفة زراعة الأنسجة مع ما لا يقل عن 50 ميكرولتر تحييد الكولاجين.
      1. استخدام تقنية pipetting لالعكسي لتجنب خلق فقاعات في الكولاجين. استخدام غيض ماصة لنشر الكولاجين بالتساوي على السطح جيدا.
        ملاحظة: هذه الطبقة قاعدة الكولاجين عقد الكروية في تعليق وهو عادة 1-2 مم. طبقة الأساس يقلل من تشكيل الغضروف المفصلي على طبقة الكولاجين العليا. إذا كانت طبقة الأساس هي رقيقة جدا، قد الكروية اجراء اتصالات مع الجزء السفلي من الشريحة الغرفة وتشكيل أحادي الطبقة الخلية.
    2. ضع الشريحة الغرفة، و35 مم طبق زراعة الأنسجة مليئة عالى النقاء H 2 O، في صحن 10 سم زراعة الأنسجة. احتضان عند 37 درجة مئوية حتى تتم بلمرة الكولاجين، عادة 1 ساعة. متجر المتبقية تحييد الكولاجين على الجليد.
      ملاحظة: إن طبق مملوء بالمياه 35 ملم توفر الرطوبة ومنع الجفاف. يجب أن تبقى الشريحة الغرفة في هذه القاعة الرطوبة في جميع أنحاء فحص. طبقة الأساس الكولاجين قد يكون غادر لبلمرة بين عشية وضحاها. حضانات أطول يؤدي عادة في هلام أكثر جمودا.
    3. باستخدام p1،000 مرشح طرف، وجمع الكروية شكلت قبل (الخطوة 1.4.7) من لوحة الخلية طارد 96-جيدا U-السفلى في 1.5 مل المفاجئة أعلى الأنابيب. ماصة ببطء وتجنب تكرار أو pipetting لقوي للحد من السوائل القص من الكروية. قد تكون مجمعة الكروية متعددة في أنبوب واحد لنقلها إلى بئر واحدة من 8 جيدا زراعة الأنسجة الشرائح الغرفة.
    4. الطرد المركزي الكروية التي تم جمعها في طبلETOP microcentrifuge في 2000 x ج لمدة 2-5 الصورة وإزالة طاف باستخدام ماصة P200. تجنب الطرد المركزي لمدة أطول من اللازم، لأن هذا قد يسبب الكروية إلى التفكك أو تتجمع معا.
      ملاحظة: بعد pipetting لمن أكثر من طاف، قد تكون معكوسة أنبوب بعناية على منشفة ورقية نظيفة لذبالة بعيدا السوائل الزائدة. لا تسمح الكروية لتجف.
    5. باستخدام واسعة تتحمل P200 طرف، و resuspend بلطف الكروية في 50 ميكرولتر تحييد الكولاجين. هل كل هذا لأنبوب الكروية التي جمعت قبل نقل أي الكروية في الشريحة الغرفة. الحفاظ الكروية التي تم معلق في الكولاجين تحييد على الجليد حتى جاهزة للنقل إلى الشرائح غرفة.
    6. إزالة الشرائح الغرفة من الحاضنة وماصة بعناية خليط كروي الكولاجين فوق طبقة الأساس الكولاجين. احتضان عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 حتى تتم بلمرة الكولاجين.
      1. لا تستغني عن محتويات ماصة لتجنب خلق فقاعات. Dropwايسي pipetting ليقلل من فرص إزعاج طبقة قاعدة الكولاجين.
    7. ببطء إضافة ما لا يقل عن 100 ميكرولتر حرارة متوسطة الثقافة التي تحتوي على chemoattractants المطلوب، مثبطات، أو العلاجات الأخرى إلى كل بئر من الشريحة الغرفة. قد يمزق تحتوي الكروية طبقة الكولاجين إذا كان pipetted السائل على ذلك بقوة أيضا. مستنبت يمكن الاستغناء ببطء أسفل الجانب من بئر لتجنب إزعاج الكولاجين.
    8. احتضان شريحة الغرفة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 للسماح للغزو الخلايا. غزو ​​الخلايا في الكولاجين المحيطة قد يكون بسبب brightfield أو مضان التصوير وكميا من قبل مجموعة متنوعة من أساليب استخدام epifluorescence، متحد أو ضوء المجهر ورقة.

3. الكمي من الغزو: Brightfield المجهر

  1. في فترات زمنية محددة، الصورة الكروية الكولاجين جزءا لا يتجزأ من في 10X التكبير باستخدام المجهر brightfield (الخطوة 2.2.8).
    ملاحظة: للحصول علىالتجارب الخلية الحية على المدى الطويل، مرحلة المجهر ساخنة وCO 2 تنظم غرفة يمكن استخدامها للحفاظ الكروية عند 37 درجة مئوية وCO 2 في حين التصوير 5٪.
  2. تحديد الغازية باستخدام برنامج مثل يماغيج لقياس عدد الخلايا الغازية في الكولاجين المحيطة ومتوسط ​​المسافة غزا في كل نقطة زمنية.

4. الكمي من الغزو: الإسفار المجهري مع وصمة عار خلايا الحية

  1. الخطوة التالية 2.2.8، تكملة المتوسطة في الشرائح غرفة مع وصمة الفلورسنت مثل دابي، Calcein صباحا، أو غيرها من المركبات تتبع الخلية المناسب للخط الخلوي وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
    ملاحظة: للحصول على القياس الكمي للغزو، وتلطيخ متجانس في جميع أنحاء كروي ليست ضرورية. للتطبيقات التي تتطلب اختراق أعمق من وصمة عار، حضانات أطول (> 3 ح) قد يكون ضروريا.
  2. إزالة وصمة عار واستبدالها مع 500 ميكرولتر دافئ برنامج تلفزيوني 1X. فيcubate عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة لإزالة وصمة عار الزائدة. أكرر ما لا يقل عن مرتين.
  3. باستخدام المجهر مضان، والحصول على المقاطع البصرية من خلال الكروية الغازية.
    وينبغي التقليل من التعرض المديد لضوء الليزر أثناء التصوير المتكرر للحد من الضيائية وphotobleaching من: ملاحظة.
  4. استخدام برامج مثل يماغيج لتوليد Z-الإسقاط، والتي يمكن استخدامها لتحديد المساحة الإجمالية للكروي، أرقام غزو الخلايا، والمسافات غزت في مصفوفة الكولاجين.
  5. وكمثال على ذلك، لتحديد الغزو، وضبط عتبة الصورة لاستبعاد الخلفية، وتسليط الضوء فقط كروي والخلايا الغازية، وقياس منطقتهم. مجال كروي الأصلي يمكن أن تقلل من هذا المجموع لتحديد الغازية.

5. الكمي من الغزو: المناعي

ملاحظة: يجب أن يتم تمرير جميع الحلول والمخازن من خلال مرشح 0.45 ميكرون قبل استخدامها لريمولقد الحطام، والتي يمكن أن تؤثر سلبا على تلطيخ.

  1. إعداد العازلة يغسل PBS +. إعداد برنامج تلفزيوني 1X وإضافة CaCl 2 و MgCl 2 إلى تركيز النهائي من 0.1 ملم. لا الأوتوكلاف عازلة بعد تضاف CaCl 2 و MgCl 2. قد يكون الحل وتخزينها في درجة حرارة الغرفة فلتر تعقيم.
  2. إعداد محايد عازلة تثبيت مخزنة الفورمالين (NBF). إضافة 5 قطرات من 1 M هيدروكسيد الصوديوم إلى 0.6 غرام امتصاص العرق. جلب إلى 20 مل مع برنامج تلفزيوني + واحتضان عند 60 درجة مئوية حتى يذوب امتصاص العرق (حوالي 1 ساعة). تبرد لدرجة حرارة الغرفة، وضبط درجة الحموضة إلى 7.4 مع 1 M حمض الهيدروكلوريك.
    ملاحظة: يجب أن تكون على استعداد عازلة تثبيت بنك الفجيرة الوطني مباشرة قبل الاستعمال.
  3. إعداد ألبومين المصل البقري (BSA) حظر العازلة. حل جيش صرب البوسنة في برنامج تلفزيوني + في 3٪ ث / ت. الحل قد يكون تصفية تعقيم وتخزين عند 4 درجات مئوية لعدة أيام ولكن من الأفضل إعداد الطازجة. لا تسخن.
  4. إعداد Permeabilization العازلة. تمييع تريتون X-100إلى 0.2٪ ت / ت في برنامج تلفزيوني +.
    ملاحظة: Permeabilization عازلة ينبغي إعداد مباشرة قبل الاستعمال.
  5. اختياريا، وإعداد MOWIOL المتوسطة المتزايدة. الجمع بين 2.4 ز MOWIOL، 6 ز الجلسرين، و 6 مل عالى النقاء H 2 O. ميكس لمدة 3 ساعات في المدورة في درجة حرارة الغرفة. إضافة 12 مل 0.2 M تريس الكلورين (درجة الحموضة 8.5). احتضان مع خلط عند 50 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
    1. أجهزة الطرد المركزي في 5000 x ج لمدة 15 دقيقة لتكوير المواد غير القابلة للذوبان. إضافة مادة مضادة للتبيض، مثل 2.5٪ DABCO. مخزن في 500 مكل في -20 درجة مئوية.
  6. المناعي تلطيخ الكروية (الشكل 5)
    ملاحظة: استخدام ماصة لإضافة ببطء أو إزالة السوائل من الشرائح الغرفة. تجنب استخدام الشافطة، لأن هذا قد يعطل طبقة الكولاجين.
    1. إعداد الكروية وتضمينها في الشرائح غرفة مليئة الكولاجين، كما هو موضح في الأقسام 1-2.
      ملاحظة: الكولاجين تألق ذاتي يمكن التقليل باستخدام طبقات رقيقة أو كميات صغيرة من جollagen.
    2. إزالة الكثير من مستنبت ممكن من كل شريحة الغرفة.
    3. لفترة وجيزة شطف طبقة الكولاجين مع 500 ميكرولتر غسل العازلة في برنامج تلفزيوني + لإزالة المتوسطة المتبقية.
    4. إضافة 500 ميكرولتر الطازجة PBS + غسل العازلة إلى كل بئر واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لغسل الكروية. كرر مرتين.
    5. استبدال برنامج تلفزيوني + غسل العازلة مع 500 العازلة تثبيت ميكرولتر بنك الفجيرة الوطني. يحضن في درجة حرارة الغرفة ل20-25 دقيقة.
    6. إزالة عازلة تثبيت بنك الفجيرة الوطني وشطف مع 500 ميكرولتر غسل العازلة في برنامج تلفزيوني +. يغسل لمدة 5 دقائق مع برنامج تلفزيوني جديد + العازلة غسل ما لا يقل عن 3 مرات.
      ويمكن تخزين الثابتة الكروية في 4 درجات مئوية في + غسل العازلة جديدة في برنامج تلفزيوني لعدة أيام: ملاحظة. ويمكن إضافة 0.01٪ أزيد الصوديوم لغسل العازلة لمنع نمو الجراثيم أثناء التخزين.
    7. استبدال برنامج تلفزيوني + غسل العازلة مع 500 العازلة permeabilization ميكرولتر. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 10-15 دقيقة.
    8. استبدال العازلة permeabilization مع 500 ميكرولتر BSA عازلة تمنع ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
      1. اختياريا، وإزالة BSA عازلة الحجب. باستخدام مشرط أو مقص، الكروية المكوس والمحيطة 3 مم منطقة × 3 مم من طبقة الكولاجين. باستخدام واسعة تتحمل P1000 طرف، إزاحة كتلة رفعه من الكولاجين من قبل الشطف بلطف مع العازلة BSA حجب الطازجة. نقل كتلة الكولاجين لأنبوب 1.5 مل.
      2. أجهزة الطرد المركزي في 2000 x ج لمدة 2 دقيقة وإزالة طاف. أنبوب يمكن مقلوب بعناية على منشفة ورقية نظيفة لذبالة بعيدا السوائل الزائدة.
    9. إضافة إلى الأجسام المضادة الأولية الكروية ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة. إضافة كمية كافية من الأجسام المضادة الأولية مثل أن طبقة الكولاجين بأكملها غارقة بالتساوي. الخطوات اختياري فوق (5.6.8.1-5.6.8.2) تسمح عادة استخدام كميات أصغر من الأجسام المضادة.
    10. غمر الشرائح الغرفة في وعاء مع لا يقل عن 10 مل برنامج تلفزيوني + غسل BUFفر لمدة 10 دقيقة لغسل. أكرر ما لا يقل عن مرتين.
      1. اختياري، إذا ما تم رفعه الكروية من طبقة الكولاجين سابقا (الخطوة 5.6.8.1)، إضافة ما لا يقل عن 1 مل PBS + غسل العازلة إلى أنبوب 1.5 مل وتستنهض الهمم بلطف. السماح لينقع لمدة لا تقل عن 10 دقيقة.
      2. إزالة أكبر قدر من برنامج تلفزيوني + غسل العازلة ممكن، وتكرار الغسيل مع برنامج تلفزيوني + غسل العازلة ما لا يقل عن مرتين. أجهزة الطرد المركزي في 2000 x ج لمدة عدة دقائق لتكوير كتلة الكولاجين.
        ملاحظة: الأسطح الخارجية النظيفة من الشريحة الغرفة عن طريق المسح مع الايثانول 70٪ قبل غمر في غسل العازلة.
    11. كرر الخطوات 5.6.9-5.6.10 باستخدام الأجسام المضادة الثانوية المناسب.
      ملاحظة: إذا كانت ملطخة الكروية مباشرة في وعاء التصوير، انتقل إلى الخطوة 5.6.13.
    12. اختياري، إذا ما تم رفعه الكروية من طبقة الكولاجين سابقا (الخطوة 5.6.8.1)، شرائح زجاجية نظيفة وcoverslips المجهر متوافق مبائر مع 70٪ من الإيثانول.
      1. إزالة أكبر قدر من غسل العازلة ممكن من كتلة الكولاجين وresuspend في عالى النقاء H 2 O. تنفيذ هذه الخطوة على الفور قبل التركيب. لا تترك كتل الملون النقع في الماء.
      2. باستخدام ملقط يميل غرامة، فهم حافة كتلة الكولاجين ونقل إلى شريحة زجاجية.
      3. باستخدام ملقط لعقد الكولاجين في المكان، واستخدام ممسحة قطنية نظيفة لذبالة السائل الزائد من كتلة الكولاجين، والتأكد من عدم لمس الكولاجين مباشرة.
        ملاحظة: إذا أصبح الكولاجين عالقا على مسحة القطن ويمكن إزالته بلطف إما باستخدام ملقط، أو عن طريق غمر في الماء.
    13. باستخدام تقنية pipetting لالعكسي، الاستغناء عن 100 ميكرولتر MOWIOL المتوسطة المتزايدة على كتلة الكولاجين ومكان ساترة فوق العينة.
      1. استخدام قطعة من القطن أو منشفة ورقية لالفتيل MOWIOL الزائد تصاعد المتوسطة والماء من تحت ساترة.
      2. السماح MOWIOL المتوسطة المتزايدة لتتصلب بين عشية وضحاها في 4 درجاتحواف جيم ختم ساترة مع طلاء الأظافر.
    14. صورة الكروية الملون باستخدام متحد البؤر أو مضان المجهر لمراقبة توطين البروتينات من الفائدة، وتشكيل الهياكل الغازية، وما إلى ذلك (أرقام 5B، 5C).
      ملاحظة: يجب أن تكون ملطخة الكروية محمية من الضوء لمنع photobleaching من.

6. Anoikis الفحص

ملاحظة: يتم تكييف بروتوكول تكوين كروي بسهولة لقياس النمو المستقل مرسى والمقاومة anoikis في مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا.

  1. بذر خلايا لanoikis فحص (الشكل 6)
    1. اتبع الإرشادات لإنتاج كروي في القسم 1.4 ولكن استخدام ما لا يقل عن 30 ملغ / مل ميثيل السليلوز لإعداد المتوسطة تشكيل كروي.
      ملاحظة: عند درجة حرارة، يجب أن 30 ملغ / مل السليلوز الميثيل تنتج مادة هلامية سميكة الذي يحمل الخلايا في تعليق.
    2. احتضان الخلايا لعدة أيام إلى أسابيع وفيSPECT بانتظام في 10X التكبير باستخدام المجهر. يجب أن الخلايا التي تقاوم anoikis تتكاثر وتشكل المستعمرات.
    3. تحديد anoikis عن طريق قياس عدد وحجم المستعمرات التي شكلت في كل بئر.
      ملاحظة: عندما يتم تشكيل المستعمرات، يمكن غسلها لإزالة ميثيل السليلوز وتستخدم لفحوصات على أساس كروي، كما هو موضح.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن تصف طريقة مرنة وفعالة لتوليد الأجسام الشبه الكروية منفصلة باستخدام ألواح الخلايا طارد وسائل الإعلام تشكيل كروي تستكمل مع MC. في ظل الظروف المناسبة من مولودية ومصل الدم، والخلايا الفردية تسوية والالتزام معا في مركز البئر لتشكيل الأجسام الشبه الكروية مع التزام الحد الأدنى من أسفل جيدا. باستخدام هذا البروتوكول، تم إنشاؤها الكروية من مجموعة متنوعة من خطوط الخلايا (الشكل 2B). مطلوب المعايرة مولودية وتركيزات مصل لكل خط الخلية لتحديد ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم طريقة سريعة ومرنة لإنتاج الأجسام الشبه الكروية خلية 3D في تصميم نموذج لهندسة الأنسجة في الجسم الحي باستخدام الكواشف مكلفة ومتاحة على نطاق واسع. بروتوكول لدينا يستغل الخصائص غير السامة للخلايا وتعزيز التصاق MC 8 و 9 للتوسط تجميع الخلايا وتقليل تكوين خلايا أحادي الطبقة. وخلافا للمصفوفات البروتين على أساس معزولة من مصادر حيوانية، MC غير خامل، لا تحتوي على عوامل النمو، وإزالتها بسهولة عن طريق الغسيل، مما يسمح للع...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يشكر المؤلفون M. Gordon من مركز التصوير الطبي الحيوي بجامعة كوينز على المساعدة. تم دعم هذا العمل من خلال المنح التشغيلية من جمعية أبحاث السرطان الكندية (19439) والمعاهد الكندية للبحوث الصحية (MOP-142303) (LMM) ، والمنح الدراسية للخريجين في أونتاريو والمنح الدراسية من برنامج التدريب التابع لمعهد تيري فوكس للأبحاث في أبحاث السرطان متعدد التخصصات (SMM ، EYL) ، ومن خلال منحة كريج الصيفية للجنة التحكيم (SMM).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
<قوي> مخازن مؤقتة
10x فوسفات مخزن محلول ملحيThermo Fisher Scientific AM9625
محلول كلوريد الكالسيومسيجما ألدريتش21114يستخدم في PBS < sup > + < / sup> الغسيل العازلة ؛ لا تقم بالأوتوكلاف PBS + < / sup> المخزن المؤقت للغسيل عند إضافة محلول كلوريد
المغنيسيومكلوريد الكالسيوم Sigma-AldrichM1028المستخدم في PBS+< / sup> المخزن المؤقت للغسيل ؛ لا تقم بتعقيم PBS + < / sup> المخزن المؤقت للغسيل عند إضافة كلوريد المغنيسيوم
<قوي>الاسم < / قوي ><قوي>الشركة< / strong> رقم الكتالوج< / strong>تعليقات< strong>
لتكوين كروي< / قوي>
96-well U-bottom لوحة طارد الخلاياGreiner Bio-One650970
Dulbecco's Modified Eagle's MediumSigma-AldrichD5546لزراعة خطوط خلايا SH-SY5Y و PANC-1 و TPC-1
F12KMedium Thermo FisherScientific 2112722لزراعة خط خلايا TT
مصل الأبقار الجنينيSigma-AldrichF1051مرشح قبل الاستخدام لإزالة ملوثات الجسيمات
ميثيل السليلوزSigma-AldrichM7027تحضير في الماء إلى 100 مجم / مل
معهد روزويل بارك التذكاري متوسطسيجما-ألدريتشR8758لزراعة HCT-116 ، خطوط خلايا BxPC-3
TrypLE ExpressThermo Fisher Scientific12605028Dissociation
bufferNameCompany catalog numberComments
For Invasion Assay
Bovine Type I CollagenCorning Incorporated354231مخزون 3.1 ملغم/مل ؛ الحفاظ على الجليد عند الاستخدام
DMEM Phenol Red Free Low Glucose  Thermo Fisher Scientific11054-20مضان خلفية أقل مقارنة ب Phenol Red المكمل
بخط الخلايا الدبقية المتوسطة المشتق من عامل التغذية العصبيةPeprotech450-10Chemoattractant
NameCompany Catalog numberComments
<قوي>للفحص المجهري المناعي الفلوري< / قوي> #
1.5 علومالمجهر الإلكترونيالزجاجي 72225-01لتركيب السكوير المستأصل
Alexa-Fluor 488 PhalloidinThermo Fisher ScientificA12379يستخدم لتلطيخ الأكتين عند 1: 200
Bovine Serum AlbuminBioshop Canada IncorporatedALB001المستخدمة في مخزن مؤقت حجب BSA
Dabco 33-LVSigma-Aldrich290734Antifade
Glycerol Bioshop Canada IncorporatedGLY001المستخدمة في MOWIOL تصاعد متوسط
ImageJ SoftwareFreeware,NIH-تستخدملتحليل الصور 
MicroslidesVWR International48312-024لتركيب الكرات المستقرة
MOWIOL 4-88EMD-Millipore475904تستخدم في MOWIOL تركيب متوسط
Paraformaldehyde   ؛EMD-MilliporePX0055-3تستخدم في التثبيت المؤقت
Triton X-100Bioshop Canada IncorporatedTRX777المستخدمة في المخزن المؤقت للنفاذية
للغطاء

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zimmermann, M., Box, C., Eccles, S. A. Two-dimensional vs. three-dimensional in vitro tumor migration and invasion assays. Methods Mol Biol. 986 (986), 227-252 (2013).
  2. Albini, A., Noonan, D. M. The 'chemoinvasion' assay, 25 years and still going strong: the use of reconstituted basement membranes to study cell invasion and angiogenesis. Curr Opin Cell Biol. 22 (5), 677-689 (2010).
  3. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8 (10), 839-845 (2007).
  4. Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends Biotechnol. 31 (2), 108-115 (2013).
  5. Carletti, E., Motta, A., Migliaresi, C. Scaffolds for tissue engineering and 3D cell culture. Methods Mol Biol. 695, 17-39 (2011).
  6. Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. J Vis Exp. (51), (2011).
  7. Handschel, J. G., et al. Prospects of micromass culture technology in tissue engineering. Head Face Med. 3, 4(2007).
  8. Stuckhoff, A. P., DelValle, L. Neuronal Cell Culture Methods and Protocols Vol. 1078 Methods in Molecular Biology. Amini, S., White, M. K. 1078, Humana Press. 119-132 (2013).
  9. Stewart, G. J., Wang, Y., Niewiarowski, S. Methylcellulose protects the ability of anchorage-dependent cells to adhere following isolation and holding in suspension. Biotechniques. 19 (4), 598-604 (1995).
  10. Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC Biol. 10, 29(2012).
  11. Nagelkerke, A., Bussink, J., Sweep, F. C. G. J., Span, P. N. Generation of multicellular tumor spheroids of breast cancer cells: How to go three-dimensional. Anal. Biochem. 437 (1), 17-19 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

3D Spheroid ProductionCell Aggregation MethodMethylcellulose MediumSerum ConcentrationU bottom PlatesCollagen EmbeddingSpheroid FormationAnchorage independent GrowthCell Line CompatibilityTumor Cell Invasion

Related Articles