يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

الصغيرة RNA ترنسفكأيشن في الخلايا الأولية Th17 الإنسان من قبل الجيل القادم Electroporation لل

7.4K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/55546

⸱

أبريل 13, 2017

 , 
1Department of Microbiology & Immunology, Sandler Asthma Basic Research Center, University of California, San Francisco

في هذه المقالة

ملخص

الجيل التالي من التثقيب الكهربائي هو طريقة فعالة لنقل خلايا Th17 البشرية باستخدام الحمض النووي الريبي الصغير لتغيير التعبير الجيني وسلوك الخلية.

الملخص

يمكن أن تتمايز الخلايا التائية

CD4 + إلى عدة مجموعات فرعية من الخلايا التائية المساعدة المستجيب اعتمادا على بيئة السيتوكين المحيطة. يمكن إنشاء خلايا Th17 من خلايا CD4 + T الساذجة في المختبر عن طريق تنشيطها في وجود السيتوكينات المستقطبة IL-1β و IL-6 و IL-23 و TGFβ. تنسق خلايا Th17 المناعة ضد البكتيريا والفطريات خارج الخلية ، ولكن نشاطها الشاذ ارتبط أيضا بالعديد من أمراض المناعة الذاتية والالتهابات. يتم تحديد خلايا Th17 بواسطة مستقبلات الكيموكين CCR6 ويتم تحديدها بواسطة عامل النسخ الرئيسي ، RORγt ، والسيتوكين المستجيب المميز ، IL-17A. تسهل ظروف الثقافة المحسنة لتمايز خلايا Th17 الدراسات الميكانيكية لبيولوجيا الخلايا التائية البشرية في بيئة خاضعة للرقابة. كما أنها توفر إعدادا لدراسة أهمية جينات معينة وبرامج التعبير الجيني من خلال تداخل الحمض النووي الريبي أو إدخال تقليد أو مثبطات الحمض النووي الريبي الميكروي (miRNA). يوفر هذا البروتوكول طريقة سهلة الاستخدام وقابلة للتكرار وعالية الكفاءة للتعداء العابر لخلايا Th17 البشرية الأولية المتمايزة باستخدام الحمض النووي الريبي الصغير باستخدام جهاز التثقيب الكهربائي من الجيل التالي.

المقدمة

خلايا CD4 + T هي منسقين حاسم للاستجابة المناعية التكيفية. السذاجة خلايا CD4 + T قادرة على التطور إلى عدة خلايا التائية المستجيب مختلفة (على سبيل المثال TH1، TH2، Th17، وما إلى ذلك)، ولكل منها مجموعة خاصة بهم من السيتوكينات المميزة وعوامل النسخ، وهذا يتوقف على المكروية المحلية 1. القرارات النسب التي تجعل خلايا T حاسمة لكلا مناعة وقائية والتسامح في تقرير المصير. خلايا Th17 هي مجموعة فرعية واحدة من خلايا T المعروف لمكافحة البكتيريا خارج الخلية والفطريات، ولكن وتورط ردودهم غير لائقة أيضا في التسبب في أمراض المناعة الذاتية والتهابات متعددة مثل التصلب المتعدد والصدفية 2 و 3. خلايا Th17 الإنسان يمكن أن تتولد من خلايا CD4 + T ساذجة في المختبر عن طريق تزويدهم بيئة الاستقطاب المناسبة 4. فاريو لنا مزيج من السيتوكينات IL-1β، IL-23، وقد استخدمت TGFβ، وIL-6 لتطوير خلايا Th17 الإنسان. خلايا Th17 الإنسان تعبر عن CCR6، مستقبلات chemokine التي يشيع استخدامها لتحديد هذه الفئة من السكان الخلية ويتم تحديدها من خلال التعبير عن عامل من النسخ الرئيسي، RORγt (المشفرة بواسطة RORC) 5، 6. خلايا Th17 لديها القدرة على التعبير عن السيتوكينات متعددة، ولكن IL-17A هو المستجيب خلوى-تحديد النسب التي تنتجها هذه الخلايا. درسنا التعبير عن كل علامات المصاحب Th17 الثلاثة (CCR6، RORγt، IL-17A) لتقييم متانة لدينا البشري Th17 في المختبر التمايز الفحص. بالإضافة إلى ذلك، نحن مثقف خلايا CD4 + T البشر في ظل ظروف غير الاستقطاب، حيث تم إضافة أي السيتوكينات أو الأجسام المضادة ومنع وسائل الإعلام ثقافة لاستخدامه كقاعدة سيطرة سلبية منذ تعبير عن هذه العلامات Th17 يجب أن تكون منخفضة جدا أو غير موجودة.

ve_content "> طريقة واحدة لدراسة طبيعية تطوير خلية T الإنسان وعلم الأحياء هو التلاعب التعبير الجيني خلال تنميتها. قصيرة التدخل RNA (سيرنا) هي الاصطناعية جزيئات الحمض النووي الريبي الصغيرة التي تستهدف من mRNAs تشفير البروتين ويمكن استخدامها للحد من التعبير الجيني المحدد . MicroRNAs (miRNAs) هي الذاتية غير الترميز الرنا الصغيرة المعروفة لتعديل التعبير الجيني آخر ما بعد transcriptionally. وقد ثبت miRNAs للعب دورا هاما في كل من الفئران وبيولوجيا الخلايا T الإنسان، بما في ذلك خلايا Th17 7، 8، 9، و أمر حاسم لدينا وسائل موثوق بها من التلاعب النشاط RNA الصغيرة في خلايا T الإنسان لدراسة آثارها على التعبير الجيني وفي نهاية المطاف على بيولوجيا الخلايا T البشري. هنا، نحن تصف بروتوكول سهل الاستخدام، بما يتفق وموثوق بها التي قمنا بتطويرها لإدخال الرنا صغيرة الاصطناعية والأحماض النووية مقفل (LNAs، تعديل كيميائيا الأحماض النووية مع زيادة الاستقرار)في الخلايا المناعية، وعلى وجه التحديد إلى خلايا Th17 الإنسان.

هناك عدة طرق بديلة لإدخال الرنا صغيرة في خلايا الثدييات، التي تقع عادة في فئات الكيميائية والبيولوجية، أو الفيزيائية (10). الطرق الكيميائية التي يشيع استخدامها، بما في ذلك تعداء القائم على الدهون وتعداء الكالسيوم فوسفات، تعتمد على خلق المجمعات الكيميائية DNA التي تؤخذ بشكل أكثر كفاءة من قبل الخلايا. بشكل عام، الطرق الكيميائية ليست كما فعالة لترنسفكأيشن من خلايا T الابتدائية. طريقة البيولوجي الأكثر شيوعا هو استخدام ناقلات فيروسية (مثل الفيروس الارتجاعي أو الفيروسة البطيئة)، الذي يدرج مباشرة RNA الأجانب إلى مجموعة كجزء من دورة تكرار الطبيعية. تنبيغ الفيروسية عادة ما يستغرق وقتا أطول لاستكمال، وخصوصا عندما العوامل واحد في الوقت المناسب لاستنساخ الجزيئي للالبلازميدات proviral. بالإضافة إلى ذلك، يمكن للناقلات تنبيغ الفيروسية يحتمل أن تكون ضارة للباحثين البشري. Electroporation للهو م البدنيethod على إحداث غشاء permeabilization بإخضاع الخلايا لنبضات الجهد العالي، مما يسمح الأحماض النووية لدخول عابر في الخلية حيث يمكن أن تعمل على هدفهم. وكانت الأدوات Electroporation للالتقليدية غير فعالة لtransfecting الخلايا الليمفاوية الأولية. ومع ذلك، فقد ثبت الأمثل Electroporation للجيل القادم لتكون قادرة على transfecting خلايا T في كفاءة عالية جدا، وخصوصا عندما المواد التي سيتم transfected هو RNA الصغيرة. يستخدم الجيل القادم مصطلح فضفاض إلى التفريق بين أحدث منصات (على سبيل المثال، النيون، Amaxa) من آلات Electroporation للالتقليدية. بالإضافة إلى ذلك، وهذه الطريقة قابلة بسهولة للشاشات الإنتاجية المعتدلة مع ما يصل إلى ما يقرب من 120 الرنا صغيرة في تجربة واحدة، وغالبا ما تستخدم المواد الكيميائية الاصطناعية التحقق من صحتها. الأهم من ذلك، تعداء الناجح لا يمكن أن يتحقق في اقل من 16 ساعة بعد تفعيل الخلايا التائية. وعيب هذه الطريقة، ومع ذلك، هو أنه لا يؤدي إلى incorporati الجينومية مستقرةعلى، وبالتالي فهو عابر. وبالتالي، فإن الأمر يستحق مزيدا من الجهد لخلق بناء التعبير مستقرة والتي يمكن تعبئتها في ناقلات فيروسية وأعرب بنجاح في خلايا T في الحالات التي تتطلب التعبير على المدى الطويل من الحمض النووي الريبي الصغيرة.

لقد استخدمت ترنسفكأيشن الجيل القادم (على سبيل المثال، النيون) لتسليم متنوعة RNA أو قليل النوكليوتيد LNA أدوات احدة أو المزدوج تقطعت بهم السبل الاصطناعية لأغراض مختلفة 11 و 12 و 13. تدخل RNA كفاءة يمكن أن يتسبب في الماوس الأساسي وخلايا T الإنسان باستخدام RNA المزدوج تقطعت بهم السبل التدخل القصير (سيرنا). يصف هذا البروتوكول الظروف الأمثل لاستخدام هذه التقنية في خلايا Th17 الإنسان. بالإضافة إلى الرناوات siRNAs، وهي متاحة تجاريا يحاكي ميرنا الاصطناعية ومثبطات يمكن استخدامها لدراسة مكاسب ميرنا وفقدان الوظيفة. يحاكي ميرنا هي المزدوج تقطعت بهم السبل جزيئات الحمض النووي الريبي مشابهة جدا لالرناوات siRNAs، ولكن المصممد مع تسلسل miRNAs ناضجة الذاتية. مثبطات ميرنا وكيميائيا تعديل-RNA و / أو LNA أساس أليغنوكليوتيد واحدة الذين تقطعت بهم السبل التي تربط لmiRNAs الأم واستعداء وظيفتها. لقد وجدنا أن جميع هذه الأدوات يمكن استخدامها بشكل فعال في الخلايا الليمفاوية T الأساسي مثقف، بما في ذلك ولكن لا تقتصر على خلايا Th17 الإنسان.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

يلتزم هذا البروتوكول إلى المبادئ التوجيهية UCSF لأخلاقيات البحث الإنسان.

1. إعداد T الثقافة الخليوي، عزل خلايا CD4 + T، وTh17 الاستقطاب

  1. في اليوم 0، معطف 6-جيدا لوحات زراعة الأنسجة مع 1.5 مل لكل بئر من مكافحة الإنسان CD3 (2 ميكروغرام / مل) وCD28 مكافحة الإنسان (4 ميكروغرام / مل) في برنامج تلفزيوني مع الكالسيوم والمغنيسيوم لمدة 2 ساعة على الأقل في 37 ° C.
    1. بدلا من ذلك، معطف لوحات بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. التفاف لوحات في بارافيلم.
  2. إعداد الخلايا وحيدة النواة دم الحبل السري (CBMCs) من خلال التدرج الكثافة الطرد المركزي في تعليمات الشركة الصانعة.
    تنبيه: العمل بعناية وضمان معدات الوقاية الشخصية المناسبة (PPE) يتم ارتداؤها عند التعامل مع الدم البشري لتجنب أي خطر من التعرض لمسببات الأمراض التي تنتقل عن طريق الدم.
  3. مرة واحدة وقد تم عزل الخلايا وحيدة النواة وغسلها، نفذ الإنسان CD4 + T العزلة الخلية سيلي السلبيةction استخدام عدة خلايا CD4 + T الإنسان التجارية.
    ملاحظة: إذا كان هناك أحمر تلوث خلايا الدم بعد عزل الخلايا وحيدة النواة، يمكن إجراء اختياري الأحمر تحلل خلايا الدم قبل الخطوات عزل خلايا CD4 + T. Resuspend الخلايا وحيدة النواة في 1 مل من العازلة العزلة (2٪ FBS في PBS). إضافة 5 مل من 1X حل الناشر. احتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم يضاف 5 مل من العازلة العزل والطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية لخلايا بيليه.
    1. Resuspend الخلايا وحيدة النواة في مناطق ذات كثافة من 50 × 10 6 في 500 ميكرولتر في المخزن المؤقت العزلة في جديد 5 مل أنبوب.
    2. إضافة 100 ميكرولتر من FBS و 100 ميكرولتر من مزيج الأجسام المضادة في أنبوب ثم احتضان كل أنبوب في 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة على شاكر المداري لتخلط جيدا.
    3. بعد الحضانة، إضافة 3-4 مل من العازلة العزلة لغسل الخلايا. الطرد المركزي الخلايا في 300 x ج لمدة 8 دقائق في 4 درجات مئوية لخلايا بيليه. نضح بعناية سوبrnatant.
    4. أثناء هذا الدوران، قبل غسل حبات مغناطيسية. تحويل المبلغ المطلوب من حبات مغناطيسية في أنبوب جديد (المستخدمة في 1: 1 مع الخلايا) وإضافة حجم مساو من العازلة العزلة لتغسل حبات. تخلط جيدا باستخدام micropipette 1 مل ثم وضع أنبوب في المغناطيس لا يقل عن 1 دقيقة. نضح بعناية طاف. إعادة تعليق الخرز المغناطيسي في نفس حجم نقل في البداية قبل الغسيل.
    5. إعادة تعليق الخلايا في كل أنبوب مع 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت العزلة وإضافة 500 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي قبل غسلها.
    6. احتضان الخلايا مع حبات مغناطيسية لمدة 15 دقيقة على شاكر المداري في درجة حرارة الغرفة (18 ° C إلى 25 ° C) إلى المزيج جيدا.
    7. بعد الحضانة، الماصة بدقة الخلايا باستخدام micropipette 1 مل 10 مرات على الأقل. ثم إضافة 3-4 مل من العازلة العزل ووضع كل أنبوب في المغناطيس لمدة 2 دقيقة.
    8. بعناية نقل الخلايا CD4 + T مختارة سلبا التي هي فيطاف لأنبوب جديد.
  4. بمجرد الانتهاء من CD4 + T العزلة الخلية، عد الخلايا مع عدادة الكريات والحفاظ على الخلايا على الجليد.
  5. تغسل الصحون المغلفة الأجسام المضادة مرتين مع برنامج تلفزيوني. ثم يضاف 1.5 مل من 2X مزيج من Th17-استقطاب وسائل الإعلام إلى كل بئر: IFNγ مكافحة الإنسان (20 ميكروغرام / مل)، ومكافحة البشري IL-4 (20 ميكروغرام / مل)، والإنسان TGFβ (10 نانوغرام / مل) والبشرية IL-1β (40 نانوغرام / مل)، والإنسان IL-23 (40 نانوغرام / مل)، والإنسان IL-6 (50 نانوغرام / مل) كل تضعف في وسائل الإعلام قاعدة خالية من المصل (تستكمل مع 2 مم L-الجلوتامين، 100 U / مل البنسلين، 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين، 10 ملي HEPES، 1 ملم الصوديوم البيروفات و 100 ميكرومتر 2-المركابتويثانول).
    ملاحظة: ترنسفكأيشن والتدخل RNA يفعل العمل في وسائل الإعلام التي تحتوي على مصل. الغرض من استخدام وسائل الإعلام الحرة المصل مع هذا البروتوكول هو تحقيق أفضل إنتاج IL-17A.
  6. الطرد المركزي الخلايا CD4 + T الإنسان في 500 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية لتكوير الخلايا. نضح بعناية supernatالنمل. ثم resuspend الخلايا في وسائل الإعلام قاعدة خالية من المصل ولوحة الخلايا في مناطق ذات كثافة من 3 × 10 6 في 1.5 مل لكل بئر بحيث الحجم النهائي هو 3 مل لكل بئر والسيتوكينات استقطاب الآن بتركيز نهائي 1X.
    1. وضع لوحات في 5٪ CO 2، 37 ° C الحاضنة لمدة يومين.

2. خلايا Electroporation للفي المختبر الاستقطاب Th17 الإنسان

  1. في يوم 2، ومعطف 48-جيدا لوحات زراعة الأنسجة مع 250 ميكرولتر لكل بئر من مكافحة الإنسان CD3 (2 ميكروغرام / مل) وCD28 مكافحة الإنسان (4 ميكروغرام / مل) في برنامج تلفزيوني مع الكالسيوم والمغنيسيوم لمدة 2 ساعة على الأقل في 37 ° C.
    1. بدلا من ذلك، معطف لوحات بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. التفاف لوحات في بارافيلم.
  2. إعداد الرنا صغيرة لترنسفكأيشن. لكل ترنسفكأيشن، قسامة 1 ميكرولتر من 5 ميكرومتر حل سهم سيرنا في أنبوب مل microcentrifuge 1.5. تشمل المناسب المطابقة الكيمياء صغير مقاولات RNAرأ. منع جميع أنابيب على الجليد.
  3. تغسل الصحون المغلفة الأجسام المضادة مرتين مع برنامج تلفزيوني. ثم إضافة 500 ميكرولتر من 1X Th17-استقطاب وسائل الإعلام إلى كل بئر: IFNγ مكافحة الإنسان (10 ميكروغرام / مل)، ومكافحة البشري IL-4 (10 ميكروغرام / مل)، TGFβ البشري (5 نانوغرام / مل)، ايل الإنسان 1β (20 نانوغرام / مل)، والإنسان IL-23 (20 نانوغرام / مل)، والإنسان IL-6 (25 نانوغرام / مل) كل تضعف في وسائل الإعلام قاعدة خالية من المصل (تستكمل مع 2 مم L-الجلوتامين، و 100 U / مل البنسلين، 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين، 10 ملي HEPES، 1 ملم البيروفات الصوديوم و 100 ميكرومتر 2-المركابتويثانول).
  4. بعد إعداد لوحات ثقافة والكواشف ترنسفكأيشن، resuspend الخلايا مع 1 مل micropipette، pipetting بلطف ولكن التأكد من أن جميع الخلايا وفصل من الجزء السفلي من الآبار. تجميع خلايا في أنبوب مخروطي الشكل والطرد المركزي في 500 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: للحصول على فترات أطول من ثقافة البروتوكول لمدة أربعة أيام المقدمة هنا، ينبغي transfected الخلايا تقريبا كل 3 أيام باستخدام هذا البروتوكول نفسه. الخطوة 20.4 يجب أن يتم تعديل ذلك منذ الخلايا تعامل مع الرنا صغيرة مختلفة لا ينبغي المجمعة. جميع الشروط التي يجري اختبارها يجب جمعها وعدها، وtransfected بشكل منفصل.
  5. نضح بعناية طاف، ومن ثم إعادة تعليق الخلايا في لا يقل عن 1 مل من برنامج تلفزيوني لغسل. عد الخلايا الحية Th17 (على سبيل المثال مع عدادة الكريات باستخدام استبعاد التريبان الأزرق لتقييم جدوى) ثم نقل الخلايا إلى أنبوب microcentrifuge.
  6. أجهزة الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة لخلايا بيليه.
  7. نضح بعناية طاف، ومن ثم إعادة تعليق الخلايا باستخدام المخزن المؤقت إعادة تعليق المقدمة من عدة ميكرولتر نظام ترنسفكأيشن 10 في مناطق ذات كثافة من 2،5-4 × 10 7 خلايا لكل مليلتر. حفاظ على الخلايا في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: كما توجيهي، في محاولة لإعداد فقط العديد من الخلايا كما يمكن transfected في غضون 30 دقيقة. ويمكن مقارنة دفعات متعددة.
  8. إضافة 9 ميكرولتر من الخلايا إلى 1 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي الصغيرة في كل microcأنبوب entrifuge. الماصة مرة واحدة لمزج الخلايا والرنا صغيرة لترنسفكأيشن ثم تحميل في المقدمة طرف ماصة الكهربائي.
    ملاحظة: عادة، إضافة 9.5 ميكرولتر من تعليق خلية لضمان وجود ما يكفي من الخليط لمنع خلق فقاعات في الماصة القطب غيض قبل ترنسفكأيشن.
  9. ملء كفيت المقدمة مع 3 مل من درجة حرارة الغرفة العازلة كهربائيا E. مكان كفيت داخل محطة ماصة ثم ضع ماصة في الموقف داخل كفيت.
  10. على الفور electroporate كل مزيج 10 ميكرولتر من الخلايا والحمض النووي الريبي الصغيرة باستخدام المعلمات التالية: نبض الجهد 1،500-1،550 V، عرض النبض 10 مللي، ومجموع 3 البقول على الجهاز ترنسفكأيشن.
  11. بعد Electroporation للاكتمال، إضافة مباشر على خليط الخلية إلى 500 ميكرولتر من 1X Th17-استقطاب وسائل الإعلام في الآبار المعدة لوحة الثقافة. لوحات مكان في 5٪ CO 2، 37 ° C الحاضنة لمدة يومين آخرين.
    ملاحظة: غسل طرف ماصة الكهربائي من قبل pipettingصعودا وهبوطا في برنامج تلفزيوني بين كل ترنسفكأيشن.

3. خلايا حصاد Th17 الإنسان

  1. Resuspend الخلايا في وسائل الإعلام والثقافة مع micropipette، pipetting بلطف ولكن التأكد من أن جميع الخلايا وفصل من الجزء السفلي من الآبار. إعداد الخلايا لفحوصات التعبير وظيفية و / أو الجينات.
    ملاحظة: بشكل روتيني، وحقق ما يكفي من الخلايا من بئر واحدة من خلايا Th17 transfected لاستخدامها لتحليل تدفق cytometric من علامة السطحية والخلايا خلوى وعامل النسخ تلطيخ أو لإعداد RNA لتحليل التعبير الجيني.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

وكانت الخطوة الأولى لوضع نظام فعال للelectroporating خلايا Th17 الإنسان بنجاح لتوليد قوة في المختبر متباينة الثقافات خلية Th17 الإنسان. أعربت T الخلايا المستزرعة تحت ظروف Th17-استقطاب مستقبلات chemokine CCR6 وعامل النسخ RORγt (الشكل 1A، يسار). لم التعبير عن هذه العلامات عندما مثقف خلايا T في ظل ظروف غير الاستقطاب (THN) (الشكل 1A، يمين). T الخلايا المستزرعة تحت ظروف Th17-استقطاب تنتج أيضا IL-17A على restimu...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يوفر هذا البروتوكول وسيلة إيجابية للتسليم الرنا صغيرة إلى خلايا Th17 الإنسان. رغم استخدام خلايا Th17 الإنسان هنا، وهذه الطريقة من Electroporation للمع الرنا صغيرة يمكن استخدامها مع غيرها من مجموعات فرعية المساعد الإنسان الأساسي T، مثل TH1، TH2، وTregs. لم يعمل جيدا لخلايا CD4 + T السذاجة بحيث يجب تنشيط الخلايا في الثقافة قبل ترنسفكأيشن. لهذا البروتوكول، ونحن أول الأمثل في المختبر نظام ثقافة لأفضل إنتاج IL-17A. وكان أكبر عامل وسائل الإعلام القاعدة. لقد وجدنا أن ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من قبل منح المعاهد الوطنية الأمريكية للصحة (R01HL109102 ، P01HL107202 ، U19CA179512 ، F31HL131361) ، وجائزة باحث جمعية سرطان الدم والأورام اللمفاوية (KMA) ، وبرنامج تدريب العلماء الطبيين التابع للمعهد الوطني للعلوم الطبية العامة (NIGMS) (Grant #T32GM007618) (M.M.).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مكافحة الإنسان IL-17A PEebioscience12-7179-42 استنساخ: eBio64DEC17
مكافحة الإنسان IFNg FITCebioscience11-7319-82استنساخ: 4S. B3
مضاد للإنسان CD4 eVolve605ebioscience83-0047-42استنساخ: SK3
فأر مضاد للإنسان CD196 (CCR6) BV421BD biosciences562515استنساخ: 11A9
مضاد للإنسان RORgt AF647BD biosciences563620استنساخ: Q21-559
مضاد للإنسان CD45 eFluor450ebioscience48-9459-42استنساخ: 2D1
Foxp3 / تلطيخ عامل النسخ مجموعة العازلةebioscience00-5523-00لعامل النسخ داخل الخلايا لقياس التدفق الخلوي تلطيخ
FcR مثبط ربط منقىebioscience14-9161-71
ImmunoCult-XF T Cell Expansion MediumStemcell Technologies10981"وسائط أساسية خالية من المصل"
MACS CD28 درجة وظيفية نقية ، استنساخMiltenyi Biotecالبشري 130-093-375: 15E8
CD3 المضادة للإنسان UCSFأنقاية الأجسام المضادة أحادية النسيلةN / Aاستنساخ: OKT-3
LEAF منقى مضاد للإنسان IL-4Biolegend500815استنساخ: MP4-25D2
مضاد للإنسان IFNg ، درجة وظيفية منقىebioscience16-7318-85استنساخ: NIB42
مؤتلف البشري IL-23Peprotech   ؛200-23
المؤتلف البشري IL-1 & بيتا ؛Peprotech 200-01B
المؤتلف البشري TGF- وبيتا ؛ 1Peprotech 100-21C
المؤتلف البشري IL-6Peprotech 200-06
تجمع التحكم في الجينوم ، غير مستهدف # 2دارماكونD-001206-14-05
siGENOME SMARTpool البشري RORCDharmaconM-003442-00
siGENOME SMARTpool Human PTPRCDharmaconM-008067-01
مجموعة الخلايا التائية البشرية CD4 التي لم تمسها DynabeadsThermoFisher Scientific11346DHuman CD4+< / sup> خلية تائية طقم العزل
نقل النيونThermoFisher ScientificMPK5000الجيل التالي من أداة التثقيب الكهربائي
نظام نقل النيون 10 & mu ؛ L KitThermoFisher ScientificMPK1096
Resuspension Buffer TThermoFisher Scientificمتوفرة في مجموعة (MPK1096)"العازلة لإعادة تعليق التعداد"
تقنيات الخلايا الجذعية Lymphoprep# 07801تدرج الكثافة متوسط
كوستار 6 ألواح معالجة لثقافة الأنسجة Corning3516لوحات
القاع المسطحةألواح معالجة زراعة الأنسجة ذات 48 بئر منكوستار Corning3548ألواح القاع المسطحة
BD Pharm Lyse ، 10xBD Biosciences555899يجب عمل محلول 1x بالماء المقطر قبل الاستخدام
Hu نظام

المراجع

  1. Zhu, J., Yamane, H., Paul, W. E. Differentiation of Effector CD4 T Cell Populations*. Ann Rev Immunol. 28 (1), 445-489 (2010).
  2. Korn, T., Bettelli, E., Oukka, M., Kuchroo, V. K. IL-17 and Th17 Cells. Ann Rev Immunol. 27 (1), 485-517 (2009).
  3. Gaffen, S. L., Jain, R., Garg, A. V., Cua, D. J. The IL-23-IL-17 immune axis: from mechanisms to therapeutic testing. Nature. 14 (9), 585-600 (2014).
  4. Romagnani, S., Maggi, E., Liotta, F., Cosmi, L., Annunziato, F. Properties and origin of human Th17 cells. Mol Immunol. 47 (1), 3-7 (2009).
  5. Acosta-Rodriguez, E. V., et al. Surface phenotype and antigenic specificity of human interleukin 17-producing T helper memory cells. Nature Immunol. 8 (6), 639-646 (2007).
  6. Annunziato, F., et al. Phenotypic and functional features of human Th17 cells. J Exp Med. 204 (8), 1849-1861 (2007).
  7. Du, C., et al. MicroRNA miR-326 regulates TH-17 differentiation and is associated with the pathogenesis of multiple sclerosis. Nature Immunol. 10 (12), 1252-1259 (2009).
  8. Escobar, T. M., et al. miR-155 Activates Cytokine Gene Expression in Th17 Cells by Regulating the DNA-Binding Protein Jarid2 to Relieve Polycomb-Mediated Repression. Immunity. 40 (6), 865-879 (2014).
  9. Wang, H., et al. Negative regulation of Hif1a expression and TH17 differentiation by the hypoxia-regulated microRNA miR-210. Nature Immunol. 15 (4), 393-401 (2014).
  10. Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Anal bioanal chem. 397 (8), 3173-3178 (2010).
  11. Steiner, D. F., et al. MicroRNA-29 Regulates T-Box Transcription Factors and Interferon-γ Production in Helper T Cells. Immunity. 35 (2), 169-181 (2011).
  12. Simpson, L. J., et al. A microRNA upregulated in asthma airway T cells promotes TH2 cytokine production. Nature Immunol. 15 (12), 1162-1170 (2014).
  13. Pua, H. H., et al. MicroRNAs 24 and 27 Suppress Allergic Inflammation and Target a Network of Regulators of T Helper 2 Cell-Associated Cytokine Production. Immunity. 44 (4), 821-832 (2016).
  14. Flaherty, S., Reynolds, J. M. Mouse Naïve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets. J Vis Exp. (98), (2015).
  15. Schumann, K., et al. Generation of knock-in primary human T cells using Cas9 ribonucleoproteins. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (33), 10437-10442 (2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

CD4 Th17 siRNA CCR6 ROR Gamma T IL 17A
الصغيرة RNA ترنسفكأيشن في الخلايا الأولية Th17 الإنسان من قبل الجيل القادم Electroporation لل
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.