هنا، نقدم طريقة للتعبير عن وتنقية S100A12 (كالغرانولين C). نحن تصف بروتوكول لقياس نشاطها المضادة للميكروبات ضد الممرض البشري H. بيلوري .
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
التعبير، تنقية، ومضادات الميكروبات النشاط من S100A12
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
بروتينات كالغرانولين هي وسطاء مهمين من الحصانة الفطرية وهي أعضاء في فئة S100 من الأسرة إف اليد من البروتينات ملزمة الكالسيوم. بعض البروتينات S100 لديها القدرة على ربط المعادن الانتقالية مع تقارب عالية وعزلها بشكل فعال بعيدا عن غزو مسببات الأمراض الميكروبية في عملية تسمى "الحصانة الغذائية". S100A12 (إن-ريج) يربط كلا من الزنك والنحاس وفيرة للغاية في الخلايا المناعية الفطرية مثل الضامة والعدلات. نحن تقرير طريقة المكرر للتعبير، تخصيب وتنقية S100A12 في نشط، تكوين ملزم المعادن. استخدام هذا البروتين في نمو البكتيريا والتحليلات البقاء على قيد الحياة يكشف أن S100A12 له نشاط مضاد للميكروبات ضد الممرض البكتيرية ، هيليكوباكتر بيلوري . ويستند النشاط المضاد للميكروبات على النشاط ملزم الزنك من S100A12، الذي يخلط الزنك المغذي، وبالتالي تجويع H. بيلوري الذي يتطلب الزنك للنمو و proliferation.
المقدمة
بروتينات S100 هي فئة من الأسرة EF- اليد من البروتينات ملزمة الكالسيوم مع مجموعة متنوعة من الوظائف 1 . يتم التعبير عنها بطريقة الأنسجة والخلية محددة، وتنظيم مجموعة واسعة من الوظائف الخلوية 2 ، 3 . فريدة من نوعها لبروتينات الكالسيوم ملزمة، بروتينات S100 المعرض على حد سواء وظائف داخل الخلية وخارج الخلية 4 ، 5 . داخل الخلية، كا 2 + ملزمة يؤدي إلى تغيير كونفورماتيونال الذي يعرض سطح مسعور الذي يستهدف على وجه التحديد البروتين شركاء ملزم 6 . هذه الآلية داخل الخل....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. التعبير عن S100A12
- تحويل الخلايا المختصة BL21 DE3 مع البلازميد بجيمكس-S100a12 باستخدام معيار صدمة الحرارة بروتوكول 18 . إضافة 1 إلى 5 ميكرولتر من البلازميد إلى 50 ميكرولتر من البكتيريا في أنبوب ميكروسنتريفوج على الجليد. احتضان لمدة 20 دقيقة.
- صدمة الحرارة الخلايا في 42 درجة مئوية لمدة 30 ثانية.
- احتضان الخلايا على الجليد لمدة 2 دقيقة.
- إضافة 500 ميكرولتر من وسائل الاع....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
S100A12 التعبير والتنقية
وتنقية من ثلاث خطوات أنتجت ~ 40 ملغ من S100A12 المؤتلف من 50 مل من ثقافة البكتيرية. وكانت الخطوة الأولى هو هطول أمونيوم كبريتات من البروتينات E. القولونية الذاتية. وأعقب هذه الخطوة كروماتوجرافيا التبادل الأنيوني ( الشكل 1A ). يتم تعقب البروتين من قبل سدز-بادج ملطخة كوماسي الأزرق الرائ.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
ويرد بروتوكول كفاءة لكل من التعبير وتنقية S100A12 الإنسان. نظام التعبير E. القولونية هو الأداة الأكثر شيوعا المستخدمة لإنتاج البروتينات المؤتلف، وخصوصا عندما تكون هناك حاجة كميات ملغ للدراسات البيوكيميائية والبيوفيزيائية. وهناك تعزيز رئيسي للإجراء الموصوف هنا هو استخدام وسائل الإعلام لصناعة السيارات في الحث 26 مما يزيد من العائد من البروتين المنقى بعامل ما يقرب من ثلاثين بالمقارنة مع التعبير مع وسائل الإعلام القياسية لوريا مرق 18<.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ويعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.
شكر وتقدير
وقد أيد هذا البحث من قبل وزارة شؤون المحاربين القدامى جائزة التطوير الوظيفي 1IK2BX001701، كتسا جائزة UL1TR000445 من المركز الوطني للنهوض العلوم الانتقالية، ومؤسسة العلوم الوطنية جائزة أرقام 1547757 و 1400969، والمعاهد الوطنية للصحة منح GM05551. محتوياته هي وحدها مسؤولية المؤلفين ولا تمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية للمركز الوطني للنهوض العلوم الانتقالية أو المعاهد الوطنية للصحة.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| <قوي>S100A12 تعبير < قوي > | |||
| < قوي > خلايا التعبير < / قوي > | |||
| BL 21 (DE3) الخلايا المختصة | نيو إنجلاند بيولابس | C25271 | |
| الحث الذاتي المكونات | |||
| استخراج الخميرة | منتجات أبحاث الدولية | Y20020-250.0 | |
| أبحاث كلوريد | الصوديوم الدولية | S23020-500.0 | |
| منتجات أبحاث التربتون | الدولية | T60060-250.0 | |
| FeCl3< / sub> | Sigma-Aldrich | F2877 | |
| MgSO4< / sub> | Research Products International | M65240-100.0 | |
| Na2< sub>HPO4 | Research Products International | S23100-500.0 | |
| KH2PO4 | Research Products International | P41200-500.0 | |
| NH4Cl | Research Products International | A20424-500.0 | |
| Na2SO4 | Research Products International | S25150-500.0 | |
| منتجات أبحاث الجلسرين | الدولية | G22020-1.0 | |
| منتجات أبحاث الجلوكوز | الدولية | G32040-500.0 | |
| اللاكتوز | سيجما ألدريتش | L2643 | |
| <قوي>عامل الاختيار< قوي> | |||
| أمبيسلين | للمنتجات البحثية الدولية | A40040-5.0 | |
| <قوي>S100A12 تنقية< / قوي> | |||
| AKTA بدء نظام الكروماتوغرافيا | GE | 29-220-94 | |
| HiTrap Q Sepharaose Fast Flow | GE | 17-5156-01 | |
| HiPrep 16/60 S-200 HR | GE | 17-1166-01 | |
| Nanodrop Lite Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-LITE | |
| تريس بیس | ريسيرش برودكتس إنترناشيونال | T60040-1000.0 | |
| H. بيلوري < / em> مزرعة | |||
| لوحات | الدم مختبر التوريد BBL221261 | ||
| مرق بروسيلا | سيجما ألدريتش | B3051 | |
| الكوليسترول (250x) | 12531018 | ثيرمو فيشر العلمي | |
| كلوريد الصوديوم | سيجما ألدريتش | 793566 | |
| كالوريد الكالسيوم < الفرعي > 2 < / فرعي > | سيجما ألدريتش | C4901 | |
| & بيتا ؛ -ميركابتو إيثانول | سيجما ألدريتش | M6250 | |
| تريس قاعدة | سيجما ألدريتش | T1503 | |
| كلوريد الزنك | سيجما ألدريتش | 229997 |
المراجع
- Schiopu, A., Cotoi, O. S. S100A8 and S100A9: DAMPs at the crossroads between innate immunity, traditional risk factors, and cardiovascular disease. Mediators Inflamm. 2013, 828354(2013).
- Chen, B., et al.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
