مقالة منهجية

تعبير البروتين المؤتلف، التبلور، والدراسات البيوفيزيائية ل العصوية -conserved النيوكليوتيد بيروفوسفوريلاس، بكمازغ

DOI:

10.3791/55576

⸱

مايو 16, 2017

 ,  , 
1Division of Biological Science and Technology, Yonsei University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

عصيات الجمرة الخبيثة هو الممرض الملزم من الجمرة الخبيثة استنشاق قاتلة، لذلك يتم تنظيم دراسات جيناته والبروتينات بدقة. وثمة نهج بديل هو دراسة الجينات أورثولوغوس. نحن تصف الدراسات الفيزيائية الحيوية من B. انثراسيس أورثولوغ في B. سيريوس ، bc1531، التي تتطلب الحد الأدنى من المعدات التجريبية والافتقار إلى مخاوف تتعلق بالسلامة خطيرة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

للتغلب على القيود واللوائح السلامة عند دراسة الجينات والبروتينات من مسببات الأمراض الحقيقية، ويمكن دراسة مثيلاتها. عصيات الجمرة الخبيثة هو الممرض الملزم الذي يسبب الجمرة الخبيثة استنشاق قاتلة. عصية سيريوس يعتبر نموذجا مفيدا لدراسة B. الجمرة الخبيثة بسبب العلاقة التطورية وثيقة. يتم حفظ مجموعة الجينات ba1554 - ba1558 من B. الجمرة الخبيثة للغاية مع الكتلة bc1531 - bc1535 في B. سيريوس ، وكذلك مع الكتلة bt1364-bt1368 في عصيات ثورينجينزيس، مما يدل على الدور الحاسم للجينات المرتبطة في جنس عصيات . تصف هذه المخطوطة طرق إعداد وتوصيف منتج بروتين من الجين الأول ( ba1554 ) من مجموعة الجينات في B. انثراسيس باستخدام بروتين المؤتلف من أورثولوغ في B. سيريوس ، bc1531.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يستخدم تعبير البروتين المؤتلف على نطاق واسع للتغلب على المشاكل المرتبطة بمصادر البروتين الطبيعية، مثل كميات البروتين محدودة والتلوث الضارة. وعلاوة على ذلك، في دراسات الجينات المسببة للأمراض والبروتينات، سلالة المختبرات البديلة التي لا تتطلب احتياطات السلامة إضافية يمكن استخدامها. على سبيل المثال، عصية سيريوس هو نموذج مفيد لدراسة عصيات الجمرة الخبيثة بسبب العلاقة التطورية وثيقة 1 .

B. الجمرة الخبيثة هو الممرض الملزم الذي يسبب الجمرة الخبيثة استنشاق قاتلة في البشر والماشية، ويمكن أن تستخدم كطائرة بيولوجية 2 . وهكذا، فإن الدراسات المختبرية على B. الخبيثة تخضع لرقابة صارمة من قبل المراكز الأمريكية لمكافحة الأمراض، والتي تتطلب ممارسات السلامة البيولوجية المستوى 3 (بسل-3)، التي تنص على فصل منطقة المختبر مع ضغط الغرفة السلبي. على النقيض من B. الجمرة الخبيثة ، يتم تصنيف B. سيريوس كعامل بسل-1 وبالتالي لديه الحد الأدنى من المخاوف المتعلقة بالسلامة. B. سيريوس هو الممرض الانتهازية التي، عند الإصابة، يسبب التسمم الغذائي التي يمكن علاجها دون مساعدة طبية. ومع ذلك، لأن B. سيريوس سهم العديد من الجينات الحرجة مع B. الجمرة الخبيثة ، وظائف B. البروتينات الجمرة الخبيثة يمكن دراستها باستخدام هومولوجس المقابلة من B. سيريوس 1 .

يتم حفظ ba1554 - ba1558 مجموعة الجينات من B. الجمرة الخبيثة للغاية مع bc1531 - bc1535 العنقودية من B. سيريوس ، وكذلك مع مجموعة bt1364-bt1368 من عصيات ثورينجينزيس ، من حيث تنظيم الجينات وتسلسل. وعلاوة على ذلك، فإن الجينات الأولى ( ba1554 ، bc1531 ، و bt1364 ) من مجموعات كل الحفاظ عليها تماما ( أي 100٪ هوية تسلسل النوكليوتيدات)، إمبلينانوغرام دورا حاسما للمنتج الجين في الأنواع العصوية . نظرا لموقعها في هذه المجموعات الجينية، تم تعريف ba1554 خطأ كمنظم النسخ المفترضة 3 . ومع ذلك، تحليل تسلسل الأحماض الأمينية من المنتج ba1554 يشير إلى أنه ينتمي إلى عائلة مازغ، التي لديها نشاط النيوكليوتيدات بيروفوسفهيدرولاز ولا يرتبط مع نشاط عامل النسخ 4 ، 5 . على الرغم من أن البروتينات التي تنتمي إلى عائلة مازغ متنوعة فيما يتعلق بالتتابع الكلي والطول، فإنها تشترك في نطاق مازغ 100 ~ متبقي يتميز عزر إكس 12-28 إكسد ("X" يقف على أي بقايا حمض أميني، وعدد يشير إلى عدد من بقايا X).

مجال مازغ لا دائما تمثل مباشرة لنشاط حفزي معين. عضو مازغ من الإشريكية القولونية (إكمازغ) تمتلك اثنين من المجالات مازغ، ولكن جرالي C- محطة مازغ المجال هو الأنزيمية نشطة 6 . وعلاوة على ذلك، فإن خصوصية الركيزة من إنزيمات مازغ يختلف من ثلاثي فوسفات النيوكليوسيد غير محددة (ل إكمازغ) إلى دكب / داتب محددة (للمازجين المرتبطة إنتغرين) و دوتب (ل دوتباسيس) 6 ، 7 ، 8 ، 9 . ولذلك، والتحليلات الفيزيائية الحيوية للبروتين BA1554 ضرورية لتأكيد نشاطها نتباز وفك خصوصية ركيزة لها.

هنا، ونحن نقدم بروتوكول خطوة بخطوة أن معظم المختبرات دون مرفق بسل-3 يمكن أن يتبع لتوصيف المنتج البروتين من الجين B. سيريوس bc1531 ، وهو أورثولوغ من B. انثراسيس ba1554 ، على المستوى الجزيئي. باختصار، تم التعبير عن BC1531 المؤتلف (rBC1531) في E. القولونية وتنقيتها باستخدام علامة تقارب. للتجارب البلورية بالأشعة السينية، البلوريةتم فحص ظروف زاتيون من البروتين RBC1531 والأمثل. لتقييم النشاط الأنزيمي من RBC1531، تم رصد نشاط نتباز كولوريمتريكالي لتجنب نوكلأوتيدس المسمى إشعاعيا التي تم استخدامها تقليديا. وأخيرا، مكننا تحليل البيانات الفيزيائية الحيوية التي تم الحصول عليها من تحديد حالة أوليغوميريزاتيون والمعلمات الحفازة من rBC1531، وكذلك للحصول على بيانات حيود الأشعة السينية من الكريستال rc1531.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إنتاج البروتين المؤتلف وتنقية rc1531

  1. إعداد البروتين المؤتلف BC1531 (rBC1531) -البلازميد التعبير
    1. إعداد الحمض النووي الجيني من B. سيريوس 10 .
    2. تضخيم الجين bc1531 من قالب من الحمض النووي الجيني B. سيريوس من تفاعل البوليميراز سلسلة (ير)، وذلك باستخدام الاشعال إلى الأمام والعكس (انظر قائمة المواد) لإنشاء بام هاي و سال I مواقع انزيم تقييد، على التوالي 10 .
    3. هضم المنتج ير وناقل pET49b تعديل (pET49bm) باستخدام بام مرحبا و سال I، كما هو موضح 11 .
    4. مزيج المنتج ير يهضم وناقلات (3: 1 نسبة) من الخطوة 1.1.3 باستخدام ليغاز T4 دنا في رد فعل 10 ميكرولتر، كما هو موضح 11 . احتضان عند 18 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    5. ماصة 3 ميكرولتر من رد فعل ربط في 50 ميكرولتر من الكيمياءلي المختصة E. القولونية خلايا DH5α في أنبوب. مزيج بلطف بيبتينغ صعودا وهبوطا ومكان على الجليد لمدة 30 دقيقة. صدمة حرارة لمدة 45 ثانية عند 42 درجة مئوية. إضافة 1 مل من لوريا-بيرتاني (لب) المتوسطة وتنمو الخلايا في حين يهز بقوة (250 دورة في الدقيقة، 37 درجة مئوية، 45 دقيقة).
    6. خذ 100 ميكرولتر من الخلايا المحولة من الخطوة 1.1.6 ونشرها على لوحات لب-أجار مع 100 ميكروغرام / مل كانامايسين (كان). احتضان لمدة ~ 18 ساعة عند 37 درجة مئوية.
    7. اختيار المستعمرات باستخدام طرف العقيمة وتنمو الخلايا في 3 مل من وسط لب مع 100 ميكروغرام / مل كان؛ يهز بقوة (250 دورة في الدقيقة، 37 درجة مئوية، 18 ساعة).
    8. إعداد الحمض النووي البلازميد باستخدام طريقة تحلل القلوية-سدز، كما هو موضح 10 .
    9. تأكيد تسلسل النيوكليوتيدات من التعبير RBC1531 بناء باستخدام تسلسل الحمض النووي 12 .
  2. أوفيركسريسيون من البروتين rc1531
    1. إعادة تحويل E. القولونية BL21 (DE3) سلالة مع rBC1531-إكسريسيون البلازميد، كما هو موضح في الخطوات 1.1.5-1.1.6، ل أوفيركسريسيون.
    2. حدد مستعمرة وتنمو في 10 مل من وسط لب تحتوي على 50 ميكروغرام / مل كان (لب + كان). يهز بقوة لمدة 18 ساعة عند 37 درجة مئوية.
    3. تطعيم 10 مل من الثقافة بين عشية وضحاها في 1 لتر من لب + كان المتوسطة وتنمو عند 37 درجة مئوية حتى أود 600 (الكثافة البصرية في 600 نانومتر) تصل ~ 0.7.
    4. تغمر الثقافة في الماء البارد لمدة 15 دقيقة ~ لتبريد درجة الحرارة إلى 18 درجة مئوية وإضافة الأيزوبروبيل β-D-1-ثيوغالاكتوبيرانوسيد (إيبت) إلى الثقافة في تركيز النهائي من 1 ملم للتعبير البروتين المؤتلف. تنمو الثقافة في 18 درجة مئوية لمدة إضافية ~ 16-18 ح.
  3. تنقية rc1531
    1. حصاد الخلايا بواسطة الطرد المركزي (5000 x ج، 4 درجات مئوية، 30 دقيقة). تجاهل طاف بعناية حتى لا يزعج الخلايا. إعادة تعليق الخلايا في 50 مل من محلول ملحي الفوسفات مخزنة (بس) تحتوي على 10 ملي إيميدازول.
    2. ليس الخلايا مرتين عن طريق سونيكاتيون على الجليد لمنع الإفراط في التدفئة من ليسيتس الخلية (الوقت: 2 دقيقة 30 ثانية؛ دورة على: 5 ثانية؛ دورة قبالة: 10 ثانية؛ السعة: 38٪).
    3. مسح المحللة الخلية بواسطة الطرد المركزي (~ 25،000 x ج، 4 درجات مئوية، 30 دقيقة).
    4. مزيج 3 مل من الخرز النيكل و 60 مل من برنامج تلفزيوني يحتوي على 10 ملي إيميدازول والجاذبية تدفق العازلة اضافية لتسوية الخرز النيكل معايرتها في عمود كروماتوغرافيا الزجاج 2.5 × 10 سم.
    5. ماصة لنقل طاف من الخطوة 1.3.3 إلى العمود مع ما قبل معايره الخرز النيكل واحتضان في 4 درجات مئوية لمدة 2 ساعة على عجلة الغزل في سرعة منخفضة (~ 20 دورة في الدقيقة).
    6. السماح طاف لاستنزاف من قبل الجاذبية وغسل الخرز النيكل في العمود ثلاث مرات مع 100 مل من برنامج تلفزيوني يحتوي على 10 ملي إيميدازول.
    7. أزل البروتين RBC1531 من خلال تطبيق 4 × 5 مل من برنامج تلفزيوني يحتوي على 250 ملي إيميدازول.
    8. خذ 15 ميكرولتر من شطف من الخطوة 1.3.7 وتشغيله على 15٪ سدز-بادج. تصور العصابات البروتين جراهلام باستخدام كوماسي تلطيخ الأزرق 10 .
  4. إزالة علامات تقارب بروتين rc1531 عن طريق التحلل البروتين ثرومبين
    1. ماصة الكسور في أنبوب غسيل الكلى (الوزن الجزيئي قطع: 3 كيلو دالتون) ووضع أنبوب في كوب يحتوي على 4 L من العازلة ثرومبين الانقسام متوافق (20 ملي هيبيس، ودرجة الحموضة 7.4، 150 ملي كلوريد الصوديوم، و 1.5 ملي β ميركابتوثانول) عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
    2. ماصة الكسور ونقلها إلى أنبوب مخروطي الشكل.
    3. قياس الامتصاصية في 280 نانومتر وتقدير تركيز البروتين RBC1531، كما هو موضح 13 .
    4. تأخذ 50 ميكروغرام من RBC1531 في أنبوب 0.5 مل وإضافة كميات مختلفة من الثرومبين ( أي 2، 1، 0.6، و 0.3 وحدة). احتضان ردود الفعل rc1531 والثرومبين في 20 درجة مئوية لمدة ~ 3 ساعة لتحديد أقل كمية من الثرومبين المطلوبة لتلصق علامة تقارب N- محطة.
    5. تشغيل ردود الفعل rc1531 والثرومبين على 15٪سدز-بادج وتحديد أقل كمية من الثرومبين (على سبيل المثال، 0.3 وحدة من الثرومبين في 50 ميكروغرام من RBC1531) أن هضم تماما علامة تقارب N- محطة وإنتاج rc1531 خالية من العلامات.
    6. إضافة 10 ملغ من البروتين RBC1531 و 60 وحدة من الثرومبين إلى أنبوب 15 مل واحتضان عند 20 درجة مئوية لمدة ~ 3 ساعة لرد فعل ثرومبين-التحلل البروتيني.
    7. تطبيق معايير الترشيح هلام إلى العمود اللوني استبعاد الحجم (سيك) لإعداد منحنى القياسية من الأوزان الجزيئية وأحجام شطف، كما هو موضح 13 .
    8. وضع البروتين rc1531 هضم الثرومبين من الخطوة 1.4.6 في أنبوب فلتر الطرد المركزي (الوزن الجزيئي قطع: 3 كيلو دالتون) وأجهزة الطرد المركزي في 3000 غرام في 4 درجات مئوية للحد من حجم أقل من 5 مل.
    9. تطبيق البروتين المركزة rc1531 إلى العمود المجلس الأعلى للتعليم وجمع 60 كسور إلوتد في 0.5 مل لكل أنبوب 13 .
    10. خذ 15 ميكرولتر من كل جزء، تشغيلها على 15٪ سدز-بادج، وستايn هلام باستخدام حل تلطيخ كوماسي (0.15٪ (ث / ت) كوماسي الأزرق الرائعة، 40٪ (الخامس / الخامس) الميثانول، و 10٪ (الخامس / الخامس) حمض الخليك الجليدي) كما هو موضح 10 .
    11. ماصة الكسور التي تحتوي على rc1531 وجمعها في أنبوب واحد.

2. فحص التبلور وتحسين RBC1531

  1. ظروف الفحص للبروتين RBC1531 تبلور
    1. تركيز rc1531 من الخطوة 1.4.11 تصل إلى ~ 18.5 ملغ / مل باستخدام أنبوب فلتر الطرد المركزي، كما هو موضح في الخطوة 1.4.8.
    2. إضافة 50 ميكرولتر من كل حل تبلور الفحص (انظر القسم 2.2) 14 إلى آبار 96-جيدا بلورات الجلوس إسقاط التبلور. وضع 0.5 ميكرولتر من 18.5 ملغ / مل RBC1531 حل البروتين على سرير الجلوس. مزيج من محلول البروتين مع 0.5 ميكرولتر من حل جيدا، وتكرار عملية لوحة كاملة.
    3. تغطية لوحة مع فيلم لاصق واضح.وضع لوحات 96 جيدا في 18 درجة مئوية والسماح لنشر البخار.
    4. مسح قطرات في التكبير 20-40X باستخدام المجهر الضوئي لرصد تشكيل الكريستال يوميا لمدة 2-3 أسابيع.
    5. جمع بيانات حيود الأشعة السينية 12 باستخدام البلورات البروتين RBC1531 التي تم الحصول عليها.
  2. تحسين ظروف البلورة rc1531
    1. إعداد 500 ميكرولتر من حل حالة التبلور الأولي المحدد (على سبيل المثال، 0.1 M كاكوديلات الصوديوم، ودرجة الحموضة 6.5 و 1.0 M سيترات الصوديوم) وملء لوحة بلورة 24 جيدا للهبوط الجلوس.
    2. إضافة 0.5 ميكرولتر من 18.5 ملغ / مل RBC1531 حل البروتين إلى سرير الجلوس، وتخلط مع 0.5 ميكرولتر من محلول جيدا، وتغطية لوحة على الفور مع فيلم لاصق واضح. وضع لوحة في 18 درجة مئوية.
    3. مراقبة نمو الكريستال تحت المجهر الضوئي لمدة أسبوع.
    4. تحسين ظروف التبلور المختلفة عن طريق تغيير الرقم الهيدروجيني ( أي، ودرجة الحموضة 5.5-6.8) من 0.1 M كاكوديلات وعن طريق تغيير تركيز الملح ( أي 0.9-1.2 M) من سترات الصوديوم للحصول على بلورات المفرد. رصد نمو الكريستال لمدة ~ 1 أسبوع وجمع بيانات حيود الأشعة السينية 12 .

3. توصيف نوكليوسيد ثلاثي الفوسفاتيز (نتباس) نشاط RBC1531

  1. التحقق من دراسة اللونية غير العضوية المعتمدة على الفوسفات
    1. إعداد مخزون من بيروفوسفات (100 ملم) وتمييع إلى تركيزات النهائية من 0.1، 0.25، 0.5، 1.0، 5.0، 10، 50، 100، و 250 ميكرومتر في 200 ميكرولتر من العازلة رد فعل (20 ملي هيبيس، ودرجة الحموضة 7.4، 150 مم كلوريد الصوديوم؛ و 2 ملي مغكل 2 ) في لوحات مكررة 96-جيدا. استخدام لوحة الأولى كعنصر تحكم (وهذا لا يحتوي على بيروفوسفاتيز). تأكد من أن اللوحة الثانية تحتوي على بيروفوسفاتيز كما لوحة عمل، وفقا لتوجيهات في الخطوة 3.1.2.
    2. إضافة 0.01 وحدة من ساكاروميسز سيريفيسياي غير العضوية pيروفوسفهاتاز (1 ميكرولتر) لآبار لوحة العمل واحتضان عند 20 درجة مئوية لمدة 30-60 دقيقة.
    3. إعداد محلول حمض الموليبديت عن طريق خلط الموليبديت الأمونيوم (0.86٪ الخامس / الخامس) وحمض الاسكوربيك (14٪ الخامس / الخامس) الحلول في نسبة 7: 3. إضافة 16 ميكرولتر من محلول حمض الموليبديت إلى كل من الآبار العمل والتحكم والانتظار لمدة 15 دقيقة.
    4. قراءة الكثافة البصرية في 690 نانومتر ( أود 690nm ).
  2. مقايسة نتباز اللونية
    1. إعداد مخزون من 100 ملي نكليوسيد ثلاثي الفوسفات (نتب) الركيزة وتمييع إلى التركيز المطلوب (على سبيل المثال، 0، 0.2، 4.4، 11، 22، 44، 88، أو 132 ميكرومتر) في 180 ميكرولتر من العازلة فحص (20 هيبيس ملي، ودرجة الحموضة 7.4، 150 ملي كلوريد الصوديوم، و 2 ملي مغكل 2 ).
    2. إضافة 20 ميكروغرام من RBC1531 (1.5 ملم) و ركائز نتب من الخطوة 3.2.1 تصل إلى 200 ميكرولتر لكل رد فعل في لوحة 96 جيدا وماصة صعودا وهبوطا لخلط جيدا. تغطية لوحة مع غطاء ووضعه في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقةلأداء رد فعل التحلل الركيزة.
    3. نقل لوحة إلى حمام مياه 70 درجة مئوية والسماح للوقوف لمدة 15 دقيقة لوقف ردود الفعل الحفازة بوساطة RBC1531.
    4. إضافة 0.01 وحدة من S. سيريفيسياي بيروفوسفاتيز غير العضوية (1 ميكرولتر) إلى كل بئر من لوحة التفاعل (من الخطوة 3.2.3) واحتضان عند 20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. إضافة 16 ميكرولتر من محلول حمض الموليبديت إلى لوحة رد فعل لتطوير اللون (~ 15 دقيقة). قراءة في أود 690nm .
    5. تحليل باستخدام معادلة ميليليس-منتن، كما هو موضح 12 .

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توصيف البروتين من الاهتمام في هذه الدراسة بدأت من خلال إعداد كمية كافية من المؤتلف B. سيريوس bc1531 (rBC1531) البروتين، ويفضل أكثر من عدة ملليغرام. تم إعداد جزء الحمض النووي ترميز البروتين BC1531 بواسطة ير باستخدام الحمض النووي الجيني من B. سيريوس كقالب، لأنه يحتوي على الجينات أورثولوغوس متطابقة ل ba1554 . كان RBC1531 أوفيركسرسد كبروتين قابل للذوبان في E. القولونية الخلايا. تم التعبير عن بروتين rc1531 مع علامة 6x...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

دراسات مسببات الأمراض الحقيقية محدودة بسبب قيود ولوائح السلامة. بدلا من ذلك ، يمكن دراسة مسببات الأمراض باستخدام غير مسببات الأمراض ذات الصلة التطورية أو الأنواع الأقل إمراضا. يعتبر جين ba1554 جينا مهما في B. الجمرة الخبيثة. لحسن الحظ ، يوجد جين متطابق في B. cereus غير السريري.وبالتالي ، دون مخاوف خطيرة تتعلق بالسلامة ، يمكن استخدام بروتين BC1531 المؤتلف للتوصيف الفيزيائي الحيوي والأنزمي. هنا ، وصفنا الإجراءات التفصيلية ، والانتقال من جين إلى بروتين مؤتلف منقى. باستخدام البروتين المؤتلف ، تم إ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

جمعت مجموعات بيانات حيود الأشعة السينية في خط الأشعة 7A لمختبر مسرع بوهانغ (كوريا). وقد تم دعم هذه الدراسة من قبل برنامج بحوث العلوم الأساسية التي تديرها المؤسسة الوطنية للبحوث في كوريا (نرف)، بتمويل من وزارة العلوم وتكنولوجيا المعلومات والاتصالات والتخطيط المستقبلي (2015R1A1A01057574 إلى م).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Bacillus cereus< / em> ATCC14579المجموعة الكورية لزراعة الأنسجة3624
مجموعة إعداد الحمض النووي الجينوميGeneAll106-101تحضير الحمض النووي الجيني
التمهيدي الأماميMacrogenGAAGGATCCGGAAGCAAAAA
CGATGAAAGATATGCA		em>Bam< / em>HI تم تسطير الموقع
التمهيدي العكسيMacrogenCTTGTCGACTTATTTTCT
CCCTCATCAATACGTG		Sal< / em>I تم وضع خط على
موقع nPfu-ForteEnzynomicsP410PCR polymerase
Bam< em>HIEnzynomicsR003S
Sal< / em>IEnzynomicsR009S
pET49b ناقلات التعبيرNovagen71463تم تعديل متجه التعبير لإضافة علامات التقارب ومواقع BamHI / SalI10< / sup>
T4 DNA ligaseEnzynomicsM001S
غسيل الكلى memebraneThermofisher18265017
سخان بلوك جافJSRJSBL-02T
مرق LB (لوريا بيرتاني)محلول LPSLB-05
LB Agar ، Miller (Luria-Bertani)Becton و Dickinson and Company
KanamycinLPS solutionKAN025
مجموعة الإعداد المصغرةFavorgenFAPDE300تحضير الحمض النووي البلازميد
BL21 (DE3) الخلية المختصةNovagen69450-3CN
الأيزوبروبيل > بيتا ؛ -D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)كواشف فيشر الحيوية50-213-378
كلوريد الصوديومدايجونغ7548-4100مادة PBS
كلوريد البوتاسيومدايجونج6566-4405مادة PBS
فوسفات البوتاسيومBio Basic IncPB0445PBS مادة
فوسفات الصوديومBio Basic IncS0404PBS مادة
ImidazoleBio Basic IncIB0277
SonicatorSonicsVCX 130
Ni-NTA agarosQiagen30210حبة النيكل
الدوارFinepcrAG
الدقة بالإضافة إلى البروتين معايير اللون المزدوجBio-rad1610374SDS-PAGE البروتين القياسي
Coonmassie Brilliant Blue R-250Fisher BioReagentsBP101-25Coomassie محلول تلطيخ
كحول الميثيلSamchun الكيميائيةM0585محلول تلطيخ Coomassie
حمض الخليكDaejung1002-4105محلول تلطيخ Coomassie
غسيل الكلى memebraneThermofisher68035
2-MercaptoethanolSigma-aldrichM6250
ThrombinMerckmillipore605157-1KUCNتحضير كميات من 20 & mu ؛ L (1 وحدة لكل مو ؛ L) وتخزينها عند 70 درجة ؛ C والذوبان قبل الاستخدام
Superdex 200 16/600جنرال إلكتريك28989335حجم استبعاد الكروماتوغرافيا
هلام الترشيح القياسيBio-rad151-1901
مرشح الطرد المركزيAmiconUFC800396
لوحات التبريدهامبتونللأبحاث HR3-08396 جيدا لوحة إسقاط الجلوس
مجموعة JCSG الأساسية I-IVQiagen130924-130927حل سري البلورة
مجهرنيكونSMZ745T
لوحات Cryschemأبحاث هامبتونHR3-15824 بئر الجلوس لوحة إسقاط
البيروفوسفاتيز غير العضويةسيجما10108987001
محلول موليبدات الأمونيومسيجما13106-76-8
حمض الأسكوربيكSigma50-81-7
NTP الركيزةStartagene200415-51
مقياس الطيفBiotekSynergyH1قارئ الصفائح
الدقيقة GraphPad Prism 5GraphPadPrism 5 للنافذة
< L. الضوئي

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ivanova, N., et al. Genome sequence of Bacillus cereus and comparative analysis with Bacillus anthracis. Nature. 423, 87-91 (2003).
  2. Spencer, R. C. Bacillus anthracis. J Clin Pathol. 56, 182-187 (2003).
  3. Deli, A., et al. LmbE proteins from Bacillus cereus are de-N-acetylases with broad substrate specificity and are highly similar to proteins in Bacillus anthracis. FEBS J. 277, 2740-2753 (2010).
  4. Gross, M., Marianovsky, I., Glaser, G. MazG -- a regulator of programmed cell death in Escherichia coli. Mol Microbiol. 59, 590-601 (2006).
  5. Galperin, M. Y., Moroz, O. V., Wilson, K. S., Murzin, A. G. House cleaning, a part of good housekeeping. Mol Microbiol. 59, 5-19 (2006).
  6. Lee, S., et al. Crystal structure of Escherichia coli MazG, the regulator of nutritional stress response. J Biol Chem. 283, 15232-15240 (2008).
  7. Moroz, O. V., et al. Dimeric dUTPases, HisE, and MazG belong to a new superfamily of all-alpha NTP pyrophosphohydrolases with potential "house-cleaning" functions. J Mol Biol. 347, 243-255 (2005).
  8. Robinson, A., et al. A putative house-cleaning enzyme encoded within an integron array: 1.8 A crystal structure defines a new MazG subtype. Mol Microbiol. 66, 610-621 (2007).
  9. Moroz, O. V., et al. The crystal structure of a complex of Campylobacter jejuni dUTPase with substrate analogue sheds light on the mechanism and suggests the "basic module" for dimeric d(C/U)TPases. J Mol Biol. 342, 1583-1597 (2004).
  10. Green, M., Sambrook, J. Molecular cloning: A laboratory Manual. 1, John Inglis. (2012).
  11. Brown, T. A. Gene cloning an introduction. , Chapman & Hall. (1986).
  12. Kim, M. I., Hong, M. Crystal structure of the Bacillus-conserved MazG protein, a nucleotide pyrophosphohydrolase. Biochem Biophys Res Commun. 472, 237-242 (2016).
  13. Sheehan, D. Physical biochemistry: Principles and applications. , A John Wiley & Sons. (2009).
  14. Lesley, S. A., Wilson, I. A. Protein production and crystallization at the joint center for structural genomics. J Struct Funct Genomics. 6, 71-79 (2005).
  15. Jeon, Y. J., et al. Structural and biochemical characterization of bacterial YpgQ protein reveals a metal-dependent nucleotide pyrophosphohydrolase. J Struct Biol. 195, 113-122 (2016).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Recombinant Protein ExpressionProtein CrystallizationEnzymatic KineticsNickel Affinity ChromatographySize Exclusion ChromatographyThrombin DigestionSitting Drop Vapor DiffusionX ray CrystallographySpectrophotometric AnalysisBacillus Cereus

مقالات ذات صلة