Method Article

A المناعة الذاتية الجفاف العين الفئران نموذج مع زيادة في المفعول الذاكرة خلايا T في الأنسجة مقلة العين

DOI:

10.3791/55592

⸱

June 7th, 2017

 ,  ,  , 
1Singapore Eye Research Insitute, A Member of SingHealth, 2DUKE-National University of Singapore Medical School, 3Lee Kong Chian School of Medicine, Nanyang Technological University, 4Singapore National Eye Center, 5Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا التقرير طريقة للحث على جفاف المناعة الذاتية المزمن التجريبي العين في الفئران لويس من خلال التحصين مع مستحلب من الفئران استخراج الغدة الدمعية، البيضاوي، وكاملة المساعد فروند، تليها حقن مستخرج الغدة الدمعية والأوفالبومين في الملتحمة تحت الجلد والقرنية الدمعية بعد ستة أسابيع.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مرض العين الجافة هو حالة شائعة جدا أن يسبب المراضة وعبء الرعاية الصحية ويقلل من نوعية الحياة. هناك حاجة لنموذج جاف العين حيوان مناسب لاختبار العلاجات الجديدة لعلاج أمراض العين الجافة المناعة الذاتية. يصف هذا البروتوكول نموذج المناعة الفئران جفاف العين المزمن الذاتي. تم تحصين الفئران لويس مع مستحلب يحتوي على استخراج الغدة الدمعية، البيضاوي، وكامل مساعد فروند. تم إعطاء التحصين الثاني مع نفس المستضدات في مساعد فرويند غير مكتملة بعد أسبوعين. تم إعطاء هذه التحصينات تحت الجلد في قاعدة الذيل. لتعزيز الاستجابة المناعية في سطح العين والغدد الدمعية، تم حقن مستخلص الغدة الدمعية والبيض البيضاوي في الملتحمة تحت الشبكية والغدد الدمعية 6 أسابيع بعد أول تحصين. وضعت الفئران ميزات جافة العين، بما في ذلك انخفاض المسيل للدموع الإنتاج، وانخفاض الاستقرار المسيل للدموع، وزيادة الضرر القرنية. المناعي المواليةالايداع عن طريق التدفق الخلوي أظهر رجحان الخلايا CD3 + المستجيب T في مقلة العين.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مرض العين الجاف (دد) هو مرض متعدد العوامل من الدموع والسطح العين التي تؤدي إلى أعراض عدم الراحة، واضطراب البصرية، وعدم الاستقرار فيلم المسيل للدموع، والتي يمكن أن تؤدي إلى الأضرار التي لحقت سطح العين. ويرافق ذلك زيادة الأسمولية من الفيلم المسيل للدموع والتهاب سطح العين 1 . الأعراض المصاحبة ل ديد هي حرق، لاذع، والشعور، والإحساس جسم غريب، وتمزيق، والتعب العين، وجفاف 2 ، 3 . ويتم تقليل السببين الرئيسيين لدائرة التنمية الاقتصادية في إنتاج المسيل للدموع عن طريق غدة إفراز المسيل للدموع والتبخر المفرط للفيلم المسيل للدموع 4 . في المرضى الذين يعانون من أمراض المناعة الذاتية، مثل متلازمة سجوجرن، الذئبة الحمامية الجهازية، والتهاب المفاصل الروماتويدي الضرر المناعي للغدد ميبوميان يقلل من التعبير عن الدهون الأساسية للاستقرار المسيل للدموع. أيضا، الضرر المناعي لسطح العين يقلل برودوكتيعلى من موسينز مهم لسطح قابل للبلل. معا، وهذه العمليات يسبب تراكميا جفاف المزمن العين 5 ، 6 ، 7 .

استبدال المسيل للدموع والعلاج المضادة للالتهابات هي الدعائم الأساسية للعلاج. ومع ذلك، العلاجات المضادة للالتهابات الحالية ل ديس ( أي الكورتيزون والسيكلوسبورين) هي مناعة على نطاق واسع، مما يؤدي إلى آثار ضارة خطيرة 8 ، 9 ، 10 . هناك حاجة لنموذج حيواني مناسب لاختبار العوامل المناعية الرواية لعلاج العين الجافة المناعية الذاتية.

الفئران مع عيوب وراثية محددة 11 ، 12 ، 13 ، الفئران تفتقر إلى جينات محددة 14 ، 15 ، والفئران المعدلة وراثيا أوفيركسريسينغ إمونوريغولاتوقد استخدمت الجينات أوري كنماذج من المناعة الذاتية جفاف العين 16 ، 17 . كما تم الإبلاغ عن نماذج حيوان المناعة الذاتية التي يسببها المستضد في الفئران 18 ، الأرانب 19 ، والجرذان 20 ، 21 . هنا، نحن تصف نموذج المستضد الناجم عن العين الجافة المناعية المزمن. هذا النموذج هو تعديل اثنين من النماذج السابقة. واحد يستخدم مقتطفات الغدة الدمعية، والثانية تستخدم مولد تلقائي ( أي klk1b22) من الغدد الدمعية 20 ، 21 .

تم تحريض هذا المرض عن طريق التحصين تحت الجلد من 6 إلى 8 من العمر الإناث الفئران لويس مع البيضاوي، وكامل المساعد فرويند، ومستحلب يحتوي على مقتطفات الغدة الدمعية من الجرذان سبراغ داولي ( الشكل 1 ). وكان التحصين الثاني مع نفس المستضد في مساعد فرويند غير مكتملةتدار بعد أسبوعين. لتجنيد الخلايا المناعية المستضد محددة إلى الغدة الدمعية وسطح العين، تم حقن خليط من استخراج الغدة الدمعية والبويضات (1 ملغ / مل) في الملتحمة تحت الجلد والقرنية الدمعية في الأسبوع ال 6 7TH ( الشكل 1 ). أكثر من 85٪ من الفئران وضعت سمات مميزة من جفاف العين بعد 70 يوما من التحصين الأول. وتشمل هذه الميزات انخفاض المسيل للدموع الإنتاج ( الشكل 2 )، وزيادة تلطيخ فلوريسئين القرنية ( الشكل 3 )، وانخفاض الاستقرار المسيل للدموع ( الشكل 4 ). التنميط المناعي للخلايا التائية في مقل العيون من الفئران العادية عن طريق التدفق الخلوي يكشف عن رجحان الخلايا CD3 + المستجيب T ( الشكلين 5 و 6 ). الفئران مع المناعة الذاتية دائرة التنمية الاقتصادية تظهر زيادة في CD3 + خلايا الذاكرة المستجيب T وانخفاض المقابلة في الخلايا السذاجة الذاكرة T المركزية ( الشكل 6 ).

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم التعامل مع الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية وبيان أرفو لاستخدام الحيوانات في البحوث البصريات والرؤية. تمت الموافقة على بروتوكول الدراسة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية من سينغالث.

1. إعداد لاكريمال غلاند استخراج

ملاحظة: تم تخدير الفئران مع الحقن داخل الصفاق من الكيتامين (75 ملغ / كلغ) وزيلازين (10 ملغ / كلغ). وأكد التخدير السليم من قبل اصبع القدم معسر والذيل معسر. تم تطبيق هلام العيون على العينين الفئران لمنع جفاف بعد كل إجراء. وضعت الفئران تخدير تحت أضواء الأشعة تحت الحمراء البعيدة للحفاظ على الحيوانات دافئة حتى تعافى تماما. خلال الإجراءات والوقت الانتعاش، ومراقبة الحيوانات عن كثب من قبل الباحثين. وكانت جميع المواد وأدوات الجراحة معقمة قبل الاستخدام. في نهاية التجربة، الموت الرحيم الموت الرحيم عن طريق الحقن داخل الصفاق من بينتوباربيتال (80 ملغ / كلغ).تم التحقق من القتل الرحيم الكامل عن طريق عدم وجود نبض القلب وليس المنعكس طرفة عن طريق لمس مقلة العين. تم وضع الفئران في ظروف قياسية: درجة حرارة الغرفة، 21-23 درجة مئوية. الرطوبة النسبية، 30-70٪؛ دورة الضوء الداكن، بالتناوب 12 ساعة (7 صباحا إلى 7 مساء).

  1. وضع الموت الرحيم الإناث سبراغ داولي الفئران (الفئة العمرية من 8 أسابيع إلى 16 أسبوعا) شقة، مع الأذن واحدة ضد الطاولة والآخر مواجهة. جعل شق 10 ملم متفوقة-أدنى تحت الأذن المكشوفة مع زوج من مقص الربيع. إزالة الغدة الدمعية عن طريق تشريحها من النسيج الضام المحيطة ومن القناة الصرف الصحي.
    1. تخزين الغدد في -80 درجة مئوية حتى المطلوبة. ذوبان الجليد الغدد على الجليد. اللحم المفروم كما ناعما ممكن على الجليد مع مقص. إضافة 150 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني مع 1X مثبط الأنزيم البروتيني في الغدة الدمعية.
  2. يصوتن العينات على الجليد لمدة 5 دقائق في 20 كيلو هرتز مع سونيكاتور تعيين في 10 ثانية على، 10 ثانية قبالة في 30٪ السعة. الطرد المركزي الابنعينات المثلج لمدة 20 دقيقة في 13،000 x ج و 4 درجة مئوية.
  3. ماصة طاف ونقله إلى أنبوب جديد. قسامة طاف إلى أنابيب 1.5 مل وتخزينها في -80 درجة مئوية. قياس تركيز البروتين مع فحص حمض بيسينونينيك 22 ، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.

2. إعداد مستحلب والسعال الديكي السمية

  1. مستحلب
    1. إضافة 40 ملغ من الحرارة قتل المتفطرة السل H37Ra إلى 10 مل من المساعد فرويند الكامل تحتوي على 1 ملغ / مل المتفطرة السل H37Ra وتخلط جيدا.
      ملاحظة: المساعد النهائي فرويند الكامل يحتوي على 5 ملغ / مل المتفطرة السل H37Ra.
    2. تزن البيضاوي، حله في برنامج تلفزيوني، وإعداد خليط مستضد يحتوي على 2 ملغ / مل البيضاوي البلغم و 10 ملغ / مل استخراج الغدة الدمعية. تهدف لحجم حقن 200 ميكرولتر لكل حيوان، وإعداد خليط سيد بأسيد، عن، ال التعريف، بهيمي، نومبرس.
    3. نقل غير مكتملة المساعد فرويند أو كامل مساعد فرويند ل 50 مل أنبوب، وضمان أن حجم المساعد إلى خليط مستضد في نسبة 1: 1. إضافة خليط مستضد قطرة عن طريق إسقاط إلى مساعد بينما فورتيكسينغ مع أعلى سرعة لا يؤدي إلى تسرب. استمر فورتيكسينغ لمدة 5 دقائق بعد أن تم إضافة كل مستضد.
    4. نقل مستحلب إلى حقنة 5 مل وربطه مع حقنة أخرى 5 مل من خلال موصل حقنة. دفع مستحلب من حقنة واحدة إلى أخرى لخلطه.
      ملاحظة: مستحلب جاهز إذا بقيت قطرة واحدة ككرة عند وضعها في الماء. فقط مستحلب طازجة أو مستحلب تخزينها بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية ينبغي أن تستخدم.
  2. السعال الديكي
    1. إعادة 50 ميكروغرام من السموم السعال الديكي في 500 ميكرولتر من الماء لجعل تركيز النهائي من 100 نانوغرام / ميكرولتر. فوتيكس الحاوية لمدة 30 ثانية للتأكد من tيذوب أوكسين تماما.
      ملاحظة: لا تعقيم عن طريق الترشيح، وهذا سوف يؤدي إلى فقدان المواد. لا تجمد. يبقى هذا الحل نشطا لمدة 6 أشهر على الأقل عند 4 درجات مئوية.
    2. تمييع 100 نانوغرام / ميكرولتر من السم السعال الديكي إلى 3 نانوغرام / ميكرولتر باستخدام برنامج تلفزيوني. نقل 100 ميكرولتر من السعال الديكي المخفف إلى 1 مل لور قفل حقنة الحقن مع إبرة 27 G.

3. التحصين من الفئران لويس

  1. في يوم 0، مزيج مستحلب عدة مرات. توزيع 200 ميكرولتر من مستحلب، والذي يحتوي على 1 ملغ من استخراج الغدة الدمعية و 200 ميكروغرام من البيضاوي في مساعد فرويند الكامل، في 1-مل لور قفل المحاقن مع 27G الإبر. حقن مستحلب تحت الجلد في قاعدة ذيول الفئران دون التخدير.
    ملاحظة: الذيل لا تحتاج إلى أن تكون قبل تحسنت قبل الحقن. يتم تحصين كل الفئران مع 1 ملغ من استخراج الغدة الدمعية و 200 ميكروغرام من البيضاوي في كامل الطعم المساعد فرويندساعة 500 ميكروغرام من المتفطرة السل H37Ra.
  2. في يوم 14، حقن 200 ميكرولتر من مستحلب، والذي يحتوي على 1 ملغ من استخراج الغدة الدمعية و 200 ميكروغرام من البيض البيضاوي في مساعد فرويند غير مكتملة، بنفس الطريقة كما في يوم 0. حقن 300 نانوغرام من السم السعال الديكي في 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني داخل الصفاق لكل فئران في نفس اليوم.

4. حقن أنتيجن خليط في الملتحمة الشوكي و الغدة الدمعية لتجنيد الخلايا المناعية المستضد محددة و سبب التهاب محلي

  1. حساب كمية أوفالبومين والدمعية استخراج الغدة على أساس عدد الفئران في التجربة. تزن المبلغ المطلوب من البيضاوي والجمع بين ذلك مع مستخلص الغدة الدمعية منزوعة الجليد أعدت في الخطوة 1، مما يجعل محلول مستضد يحتوي على 1 ملغ / مل البيضاوي البلغم و 1 ملغ / مل استخراج الغدة الدمعية.
  2. تخدير الفئران مع الكيتامين (75 ملغ / كلغ) وزيلازين (10 ملغ / كلغ) عن طريق الحقن داخل الصفاق. قرصة إلىإس من الفئران للتأكد من أن التخدير السليم قد تحقق ( أي، لا يلاحظ أي حركة استجابة بعد قرصة). حقن 5 ميكرولتر من مستضد في الملتحمة تحت الشبكية للعين. حقن 20 ميكرولتر من مستضد في الغدة الدمعية.

5. تقييم ملامح العين الجافة

ملاحظة: للخطوات 5،1-5،3، ينبغي أن تعقد الفئران تخدير بلطف من ناحية القفاز في وضع مستقيم على سطح مستو لتجنب الحركة.

  1. قياس حجم المسيل للدموع مع الفينول الأحمر الموضوع.
    1. استخدام زوج واحد من ملقط لعقد الخيط وآخر لسحب الجفن السفلي من الفئران. وضع مؤشر الترابط في الزاوية القريبة من القبو السفلي لمدة 1 دقيقة ثم قم بإزالة مؤشر الترابط.
      ملاحظة: الدموع جعل الجزء المبلل من موضوع أحمر في اللون.
    2. التقاط صورة لطول الجزء المبلل من الخيط بجانب حاكم مع علامات ملليمتر. قياس طول المبللة إلى العاشر سفا ملليمتر باستخدام برنامج صورة (على سبيل المثال، إيماجيج).
  2. قياس القرنية / المسيل للدموع نعومة.
    1. وضع الفئران تحت ستيريوميكروسكوب مجهزة إضاءة حلقة وكاميرا. تطبيق 5 ميكرولتر من المياه المالحة لقرنية الفئران. طرفة بشكل سلبي عن طريق تحريك الجفون العلوية والسفلية مع الأصابع القفاز ~ 5 مرات لنشر المالحة.
    2. التركيز على إضاءة حلقة على وسط سطح القرنية تحت التكبير 1.6X. الحصول على الصور الفوتوغرافية بعد 10 ثانية.
      ملاحظة: المصباح حلقة مشاريع صفين دائري من الصور نقطة على قرنيات الحيوان. التباعد المنتظم للنقاط غير المشوهة يقترح طبقة القرنية / المسيل للدموع على نحو سلس.
  3. قياس الضرر القرنية مع تلطيخ فلوريسئين.
    1. إضافة 2 ميكرولتر من 0.2٪ فلوريسئين إلى القرنية الفئران. فتح بشكل فعال وإغلاق الجفون الجرذ 3 مرات مع إصبع قفاز لنشر صبغ فلوريسئين على سطح العين.
      2. بعد 1 دقيقة، ورسم 1 مل من المياه المالحة مع حقنة 3 مل (دون أي مرفق إبرة)، موقف حقنة حوالي 2-3 ملم الأمامي للقرنية، ودفع بلطف المالحة على العين.
    2. الحصول على الصور تحت مرشح الأزرق الكوبالت ( أي ~ 400 نانومتر) من المجهر التصوير العين مع أضواء الخلفية مغلقا.
      ملاحظة: تم تحليل الصور في وقت لاحق من قبل نظام الدرجات المعدلة من المنشورات السابقة 23 . ثم تم تحليل الصور عن طريق تصنيف الدرجات بشكل شخصي لعدد، منطقة، وكثافة البقع الخضراء من 0 إلى 2، حيث 0 يشير إلى غائبة، 1 يشير تلطيخ بونكتات أقل من 50 البقع، و 2 يشير تلطيخ منقط من أكثر من 50 البقع.
  4. الموت ببطء الفئران من خلال الحقن داخل الصفاق من بينتوباربيتال (80 ملغ / كلغ). إزالة الجفن العلوي والسفلي باستخدام مقص. إصلاح وهبوط مقل العيون عن طريق الضغط لأسفل على الأنسجة بيريوكولار مع ملقط. تحرير الكرة الأرضية عن طريق قطع tوعضلات خارج العين، والعصب البصري، والملتحمة الزهري.
  5. إصلاح الموقف من مقلة العين الفئران مع ملقط وفتحه مع شق كفافي على طول خط الاستواء. إزالة العدسة والجسم الزجاجي. وضع مقل العيون تشريح إلى 1.5 مل أنابيب على الجليد.
  6. جمع الغدد الدمعية، كما هو موضح في الخطوة 1.1. نقل على الفور الأنسجة مقلة العين تشريح والغدد الدمعية إلى المختبر للتحضير لتحليل التدفق الخلوي.
  7. عزل الخلايا المناعية مع كولاجيناز و ديسباس الثاني طرق الهضم 24 ، 25 . المضي قدما في استخدام التدفق الخلوي إلى لمحة عن تجزئة الخلايا التائية في الأنسجة مقلة العين 26 .
    ملاحظة: لوحة من الأجسام المضادة هي: مكافحة CD45APC-Cyanine7 (أوكس-1)، ومكافحة CD3 BV421 (1F4)، ومكافحة CD4 بي-Cyanine7 (أوكس-35)، ومكافحة CD45RC Alexa647 (أوكس-22)، ومكافحة -CD62 بي (HRL1)، ومكافحة CD44 فيتس (أوكس-50)، وصبغة الخلية صباغة 7-آد. بين CD45 + CD3 + 7AAD - السكان، السذاجة (CD3 + CD45RC + )، ذاكرة المستجيب (T إم، CD3 + CD45RC - CD44 + CD62L)، والذاكرة المركزية (T سم، CD3 + CD45RC - CD44 + CD62L + .

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويوضح الشكل 1 تصميم التجربة. في كل يوم 48 واليوم 70، ويتم تقييم ملامح العين الجافة الجافة في الفئران المحصنة. ويمثل حجم المسيل للدموع طول الجزء الرطب من الخيط الأحمر الفينول. ويبين الشكل 2 صور تمثيلية من المواضيع الحمراء الفينول من السيطرة والجرذان ديد. طول خيوط الفينول الحمراء في مجموعة ديد أقصر من المجموعة الضابطة، مما يدل على حجم المسيل للدموع أقل.

فلوريسئين يربط الظهارة القرنية التالفة. وبالتالي، يتم قياس الضرر القرنية عن طريق تلطيخ فلوريسئين القرنية. تم تصنيف البقع فلوريسئين على سطح القرنية من الفئران ديد من 0 إلى 2 وبالمقارنة مع الجرذان السيطرة. الفئران مع دائرة التنمية الاقتصادية لديها أكثر تلطيخ فلوريسئين من الفئران السيطرة ( الشكل 3 )، مما يشير إلى تلف القرنية.

نعومة القرنيةفي دائرة التنمية الاقتصادية والجرذان السيطرة تم تقييمها من قبل عصابة إضاءة. إذا كان سطح القرنية على نحو سلس، مع الاستقرار المسيل للدموع عالية، صورة حلقة إضاءة على سطح العين هو جولة والكمال. تشويه الصورة يشير إلى انخفاض نعومة القرنية وفيلم الدموع غير المستقر. تم تصنيف درجة تشويه الحلقة من 0 إلى 2. لوحظ ارتفاع مستوى تشوه الحلقة في مجموعة دائرة التنمية الاقتصادية ( الشكل 4 )، مما يشير إلى استقرار أقل للدموع.

يتم تعريف الفئران بأنها جافة العين عندما اثنين على الأقل من المظاهر السريرية من العين الجافة هي غير طبيعية. من بين 24 الجرذان المحصنة، وضعت 21 الفئران دائرة التنمية الاقتصادية في يوم 48. وكانت النتائج متسقة عند تقييمها في اليوم 70.

تحليل التدفق الخلوي يدل على أن الخلية الفرعية T- السائد في الأنسجة فئران العين العادية هي المستجيب خلايا الذاكرة T ( الشكل 5 ). في مقل العيون من الفئران ديد، ~ 70٪ من CD3+ الخلايا التائية هي خلايا الذاكرة T المستجيب، بينما في السيطرة الفئران، وهذا الرقم هو ~ 50٪. مقل العيون من الفئران ديد لديها أعلى بكثير الخلايا المستجيب الذاكرة T من تلك الفئران السيطرة ( الشكل 6 ).

figure-results-1
الشكل 1: تخطيطي للتصميم التجريبي. لغ: الدمعية الغدة؛ ديد: مرض جفاف العين. كفا: المساعد فرويند الكامل. إيفا: مساعد فرويند غير مكتمل. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: الموضوع الأحمر الفينول يقيس حجم المسيل للدموع. يتم وضع الفينول الموضوع الأحمر في الزاوية القريبة من كل من العينين الفئران لمدة 1 دقيقة ثم يتم إزالتها. Representativيتم عرض الصور من الخيط الأحمر الفينول، جنبا إلى جنب مع حاكم، من كل من مجموعات السيطرة و ديد. تم استخدام إيماجيج لقياس طول الجزء الرطب من المواضيع الحمراء الفينول. شريط مقياس = 1 ملم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: صور الممثل من الأضرار الظهارية القرنية قياسها تلطيخ فلوريسئين. كان ملطخة كل قرنية الفئران مع 0.2٪ فلوريسئين لمدة 1 دقيقة وبيغ مع ما لا يقل عن 1 مل من المياه المالحة. أخذت الصور تحت المجهر التصوير العين مع الضوء الأزرق الكوبالت. يعرض العمود الأول صور تمثيلية لقرنيات التحكم. العمود الثاني يحتوي على صور تمثيلية من تلطيخ القرنية من الفئران مع ميزات ديد. البقع الفلورية الخضراء تشير إلى ظهارة القرنية l الضرر. تم إنتاج جميع الصور على نفس مقياس اللون. تم إجراء القياس الكمي من تلطيخ فلوريسئين وفقا للمنطقة وكثافة البقع الخضراء. شريط مقياس = 1 ملم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: ممثل القرنية الصور تظهر انعكاس من حلقة المنور. تم قياس نعومة الفئران القرنية / المسيل للدموع بواسطة إضاءة حلقة. درجة تشويه الحلبة في الصور الملتقطة هي مقياس لاستقرار المسيل للدموع النسبية. يظهر العمود الأيسر الصور ممثل في الحيوانات السيطرة، والعمود الأيمن يظهر الصور ممثل بعد تحريض العين الجافة. شريط مقياس = 1 ملم.أنك "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5
الشكل 5: النقاط المؤلفة من تحليل التدفق الخلوي. كانت الخلايا التائية المعزولة من أنسجة مقلة العين ملطخة بلوحة من الأجسام المضادة. في CD45 + CD3 + 7AAD - السكان، CD3 + 7-آد - كانت بوابات الخلايا التائية. بين CD3 + 7-آد - الخلايا التائية، تم تحديد السذاجة والذاكرة المركزية، والذاكرة المستجيبة خلايا الخلايا التائية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-6
الشكل 6: T- الخلية السكانية الفرعية في قلة العين. CD3 + CD45RC+ خلايا CD2 + CD45RC CD4 + CD45RC CD44 + CD62L - خلايا المستجيب T (T إم )، و CD3 + CD45RC - CD44 + CD62L + الخلايا المركزية T (T سم ) يتم عرض الخلايا كنسبة مئوية من الخلايا CD3 + T. النتائج هي من 3 الفئران السيطرة و 6 الفئران ديد. تم الحصول على نتائج مماثلة من تحليل الخلايا التائية من الغدد الدمعية المعزولة (لا تظهر البيانات). تم استخدام الاختبار التائي للطالب غير المقيد في المقارنة الإحصائية. أشرطة الخطأ تمثل سد. * p <0.05، ** p <0.01. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

خطوة حاسمة من هذا البروتوكول هو ضمان تجانس مستحلب. في مستحلبات جيدة الإعداد، ومغذيات مستضد تماما مع النفط، وضمان الإفراج البطيء من مستضد حقن والتحفيز المناعي المستمر. ميزة حاسمة أخرى من هذا البروتوكول هو استخدام الفئران لويس. الفئران لويس هي أكثر حساسية لتطوير أمراض المناعة الذاتية من سلالات أخرى 27 .

وقد تم تعديل هذا البروتوكول من اثنين من البروتوكولات المنشورة سابقا، والتي إما تستخدم استخراج الغدة الدمعية فقط أو المؤتلف Klk1b22 20 ، 21 . في البروتوكول الحالي، وتستخدم البيض البيضاوي بالإضافة إلى استخراج الغدة الدمعية كما مستضد، وتنجذب الخلايا المناعية المستضد محددة إلى سطح العين والغدة الدمعية، مما أدى إلى تلف الأنسجة المحلية. العين الجافة تتطور ببطء، ليصل ~ 85٪ بعد يوم 48 بعد التحصين الأولي. تحدي أنتيجيني إلىالعين والغدة الدمعية في يوم 48 تفاقم جفاف العين ويضمن مزمنها حتى يوم 70.

وبالمقارنة مع Clk1b22 المؤتلف في نموذج ديد التي يسببها كلك، ومستخلص الغدة الدمعية والأوفالبومين المستخدمة في النموذج الحالي هي أرخص وأسهل للحصول عليها. يحتوي مستخلص الغدة الدمعية أيضا على بروتينات أخرى، وبصرف النظر عن كلك، التي قد تحفز المناعة الذاتية، لذلك هذا المقتطف هو نظريا أكثر فعالية من طريقة كلك في حفز دائرة التنمية الاقتصادية. لقد حاولنا أيضا تحصين الفئران مع استخراج الغدة الدمعية فقط. على الرغم من أن هذه الفئران المحصنة وضعت دائرة التنمية الاقتصادية، لم يكن هناك زيادة كبيرة في الخلايا T الذاكرة المستجيب في أنسجة مقلة العين مقارنة مع الضوابط.

الحد من هذه التقنية هو أنه يأخذ 70 يوما لتحقيق النموذج. الخلايا المفرطة الخلايا التائية هي مجموعات فرعية من الخلايا التائية الرئيسية في العين الفئران العادية. في هذا النموذج، ونتائج دائرة الرقابة الذاتية المناعة الذاتية في زيادة CD3 + المستجيب خلايا T الذاكرة في مقلة العين. المخدرات التي بريفقمع كبريا خلايا المستجيب الذاكرة T، مثل مثبطات انتقائية لقناة البوتاسيوم Kv1.3، وبالتالي قد يكون لها فائدة علاجية على المناعة الذاتية ديد 28 .

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح. تلقت لوت تمويلا مسبقا و / أو هدايا من ألكون، أليرغان، سانتين، باوش ولومب، إيلنس، إيديتيك.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويود المؤلفون أن يشكروا السيدة تين مين كي والدكتور فيلوشامي أموثا باراثي وفريقها على مساعدتهم في التعامل مع الحيوانات. وأيد هذا العمل من قبل نيك-I2D-1409007، مؤسسة سينغهيلث شف / FG586P / 2014، و نمرك / سسا / 045/2012.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
<قوي > الكواشف < / قوي >
كوكتيل مثبط البروتيازسيجما ألدريتشP2714-1BTL
بيرس BCA بروتين فحص كيتالحرارية العلمية23227
المتفطرة السلية H37Ra & nbsp ؛231141يكمل بيكتون وديكنسون وشركاه
مساعد فرويندبيكتون وديكنسون وشركاه231131
ovalbuminSigma-AldrichA5503-10G
غير المكتمل مساعد فرويند  .Sigma-AldrichF5506-6X10ML
سم السعال الديكي  سيجما ألدريتشP7208-50UG
محلول الصوديوم الفلورسينBausch & Lomb UK LimitedNA
strong>NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment
SonicatorSonics Vibra-Cell الفينول
الخيط الأحمرTianjin Jingming New Technological Development Co. LTD.مجهر ستيريو NA
مع إضاءة ضوء دائري وكاميراكارل زايسNA
Micro IV المجهر مختبرات أبحاث فينيكسNA
<

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. The definition and classification of dry eye disease: report of the Definition and Classification Subcommittee of the International Dry Eye WorkShop (2007). Ocul Surf. 5 (2), 75-92 (2007).">The definition and classification of dry eye disease: report of the Definition and Classification Subcommittee of the International Dry Eye WorkShop (2007). Ocul Surf. 5 (2), 75-92 (2007).
  2. Etiology, prevalence, and treatment of dry eye disease. Clin Ophthalmol. 3, 405-412 (2009).">Gayton, J. L. Etiology, prevalence, and treatment of dry eye disease. Clin Ophthalmol. 3, 405-412 (2009).
  3. The dry eye. Praxis (Bern 1994). 102 (13), 803-805 (2013).">Tong, L., Tan, J., Thumboo, J., Seow, G. The dry eye. Praxis (Bern 1994). 102 (13), 803-805 (2013).
  4. The pathophysiology, diagnosis, and treatment of dry eye disease. Dtsch Arztebl Int. 112 (5), 71-81 (2015).">Messmer, E. M. The pathophysiology, diagnosis, and treatment of dry eye disease. Dtsch Arztebl Int. 112 (5), 71-81 (2015).
  5. Autoimmunity in the pathogenesis and treatment of keratoconjunctivitis sicca. Curr Allergy Asthma Rep. 14 (1), 403(2014).">Liu, K. C., Huynh, K., Grubbs, J., Davis, R. M. Autoimmunity in the pathogenesis and treatment of keratoconjunctivitis sicca. Curr Allergy Asthma Rep. 14 (1), 403(2014).
  6. Dry eye disease: an immune-mediated ocular surface disorder. Arch Ophthalmol. 130 (1), 90-100 (2012).">Stevenson, W., Chauhan, S. K., Dana, R. Dry eye disease: an immune-mediated ocular surface disorder. Arch Ophthalmol. 130 (1), 90-100 (2012).
  7. The eye: a window of opportunity in rheumatoid arthritis. Nat Rev Rheumatol. 10 (9), 552-560 (2014).">Tong, L., Thumboo, J., Tan, Y. K., Wong, T. Y., Albani, S. The eye: a window of opportunity in rheumatoid arthritis. Nat Rev Rheumatol. 10 (9), 552-560 (2014).
  8. Ocular complications of topical, peri-ocular, and systemic corticosteroids. Curr Opin Ophthalmol. 11 (6), 478-483 (2000).">Carnahan, M. C., Goldstein, D. A. Ocular complications of topical, peri-ocular, and systemic corticosteroids. Curr Opin Ophthalmol. 11 (6), 478-483 (2000).
  9. Development of a cyclodextrin-based aqueous cyclosporin A eye drop formulations. Int J Pharm. 493 (1-2), 86-95 (2015).">Johannsdottir, S., Jansook, P., Stefansson, E., Loftsson, T. Development of a cyclodextrin-based aqueous cyclosporin A eye drop formulations. Int J Pharm. 493 (1-2), 86-95 (2015).
  10. Efficacy of cyclosporine 0.05% eye drops in Stevens Johnson syndrome with chronic dry eye. J Ocul Pharmacol Ther. 29 (3), 372-377 (2013).">Prabhasawat, P., Tesavibul, N., Karnchanachetanee, C., Kasemson, S. Efficacy of cyclosporine 0.05% eye drops in Stevens Johnson syndrome with chronic dry eye. J Ocul Pharmacol Ther. 29 (3), 372-377 (2013).
  11. Severe destructive autoimmune lesions with aging in murine Sjogren's syndrome through Fas-mediated apoptosis. Am J Pathol. 156 (5), 1557-1564 (2000).">Ishimaru, N., et al. Severe destructive autoimmune lesions with aging in murine Sjogren's syndrome through Fas-mediated apoptosis. Am J Pathol. 156 (5), 1557-1564 (2000).
  12. Sialadenitis in the MRL-l mouse: morphological and immunohistochemical characterization of resident and infiltrating cells. Immunology. 60 (4), 611-616 (1987).">Jonsson, R., Tarkowski, A., Backman, K., Holmdahl, R., Klareskog, L. Sialadenitis in the MRL-l mouse: morphological and immunohistochemical characterization of resident and infiltrating cells. Immunology. 60 (4), 611-616 (1987).
  13. Immunohistochemical characterization of sialadenitis in NZB X NZW F1 mice. Clin Immunol Immunopathol. 42 (1), 93-101 (1987).">Jonsson, R., Tarkowski, A., Backman, K., Klareskog, L. Immunohistochemical characterization of sialadenitis in NZB X NZW F1 mice. Clin Immunol Immunopathol. 42 (1), 93-101 (1987).
  14. A T cell intrinsic role of Id3 in a mouse model for primary Sjogren's syndrome. Immunity. 21 (4), 551-560 (2004).">Li, H., Dai, M., Zhuang, Y. A T cell intrinsic role of Id3 in a mouse model for primary Sjogren's syndrome. Immunity. 21 (4), 551-560 (2004).
  15. Targeted disruption of the mouse transforming growth factor-beta 1 gene results in multifocal inflammatory disease. Nature. 359 (6397), 693-699 (1992).">Shull, M. M., et al. Targeted disruption of the mouse transforming growth factor-beta 1 gene results in multifocal inflammatory disease. Nature. 359 (6397), 693-699 (1992).
  16. Exocrinopathy resembling Sjogren's syndrome in HTLV-1 tax transgenic mice. Nature. 341 (6237), 72-74 (1989).">Green, J. E., Hinrichs, S. H., Vogel, J., Jay, G. Exocrinopathy resembling Sjogren's syndrome in HTLV-1 tax transgenic mice. Nature. 341 (6237), 72-74 (1989).
  17. Development of autoimmunity in IL-14alpha-transgenic mice. J Immunol. 177 (8), 5676-5686 (2006).">Shen, L., et al. Development of autoimmunity in IL-14alpha-transgenic mice. J Immunol. 177 (8), 5676-5686 (2006).
  18. Immunopathology of experimental autoallergic sialadenitis in C3H/He mice. Clin Exp Immunol. 75 (3), 471-476 (1989).">Hayashi, Y., Hirokawa, K. Immunopathology of experimental autoallergic sialadenitis in C3H/He mice. Clin Exp Immunol. 75 (3), 471-476 (1989).
  19. Experimental autoimmune dacryoadenitis: purification and characterization of a lacrimal gland antigen. Invest Ophthalmol Vis Sci. 33 (6), 2029-2036 (1992).">Liu, S. H., Zhou, D. H. Experimental autoimmune dacryoadenitis: purification and characterization of a lacrimal gland antigen. Invest Ophthalmol Vis Sci. 33 (6), 2029-2036 (1992).
  20. Experimental autoimmune dacryoadenitis. I. Lacrimal gland disease in the rat. Invest Ophthalmol Vis Sci. 28 (2), 270-275 (1987).">Liu, S. H., Prendergast, R. A., Silverstein, A. M. Experimental autoimmune dacryoadenitis. I. Lacrimal gland disease in the rat. Invest Ophthalmol Vis Sci. 28 (2), 270-275 (1987).
  21. A new model of experimental autoimmune keratoconjunctivitis sicca (KCS) induced in Lewis rat by the autoantigen Klk1b22. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (5), 2245-2254 (2009).">Jiang, G., et al. A new model of experimental autoimmune keratoconjunctivitis sicca (KCS) induced in Lewis rat by the autoantigen Klk1b22. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (5), 2245-2254 (2009).
  22. The bicinchoninic acid (BCA) assay for protein quantitation. Methods Mol Biol. 32, 5-8 (1994).">Walker, J. M. The bicinchoninic acid (BCA) assay for protein quantitation. Methods Mol Biol. 32, 5-8 (1994).
  23. A mouse dry eye model induced by topical administration of benzalkonium chloride. Mol Vis. 17, 257-264 (2011).">Lin, Z., et al. A mouse dry eye model induced by topical administration of benzalkonium chloride. Mol Vis. 17, 257-264 (2011).
  24. Flow cytometric detection of lymphocyte proliferation in eyes with immunogenic inflammation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 31 (10), 2111-2122 (1990).">Cousins, S. W., Streilein, J. W. Flow cytometric detection of lymphocyte proliferation in eyes with immunogenic inflammation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 31 (10), 2111-2122 (1990).
  25. Dynamic change in natural killer cell type in the human ocular mucosa in situ as means of immune evasion by adenovirus infection. Mucosal Immunol. 9 (1), 159-170 (2016).">Yawata, N., et al. Dynamic change in natural killer cell type in the human ocular mucosa in situ as means of immune evasion by adenovirus infection. Mucosal Immunol. 9 (1), 159-170 (2016).
  26. Chronic dry eye disease is principally mediated by effector memory Th17 cells. Mucosal Immunol. 7 (1), 38-45 (2014).">Chen, Y., Chauhan, S. K., Lee, H. S., Saban, D. R., Dana, R. Chronic dry eye disease is principally mediated by effector memory Th17 cells. Mucosal Immunol. 7 (1), 38-45 (2014).
  27. The origin of the autoimmune disease-resistant LER rat: an outcross between the buffalo and autoimmune disease-prone Lewis inbred rat strains. J Neuroimmunol. 44 (2), 215-219 (1993).">Goldmuntz, E. A., et al. The origin of the autoimmune disease-resistant LER rat: an outcross between the buffalo and autoimmune disease-prone Lewis inbred rat strains. J Neuroimmunol. 44 (2), 215-219 (1993).
  28. The functional network of ion channels in T lymphocytes. Immunol Rev. 231 (1), 59-87 (2009).">Cahalan, M. D., Chandy, K. G. The functional network of ion channels in T lymphocytes. Immunol Rev. 231 (1), 59-87 (2009).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Autoimmune Dry EyeEffector Memory T CellsLacrimal Gland ExtractFlow Cytometry AnalysisSubcutaneous ImmunizationSubconjunctival InjectionCorneal Damage AssessmentTear Volume MeasurementRat Eye ModelImmune Profiling

Related Articles