يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

القياس المتكرر التنفسي آخر العضلات والتهوية في نماذج الماوس من مرض عصبي عضلي

13.1K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/55599

⸱

أبريل 17, 2017

 ,  ,  , 
1Neuroscience Graduate Program, University of Cincinnati, 2Department of Biological Sciences, Wright State University, 3Division of Neurosurgery, Cincinnati Children's Hospital Medical Center

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

يقدم هذا البحث طريقة لقياس المتكرر للتهوية ونشاط العضلات التنفسية في التصرف بحرية الضموري نموذج الفأر التصلب الجانبي (ALS) في جميع أنحاء تطور المرض مع تخطيط التحجم كامل الجسم والكهربائي عن طريق جهاز القياس عن بعد زرعها.

الملخص

عضلات الجهاز التنفسي التبعي تساعد على الحفاظ على التهوية عند اختلال وظائف الحجاب الحاجز. يصف بروتوكول التالية طريقة لقياسات المتكررة على مدى أسابيع أو أشهر من النشاط العضلي التنفسي الإكسسوارات بينما قياس في وقت واحد التهوية في الماوس غير تخدير، يتصرف بحرية. وتتضمن هذه التقنية زرع الجراحية جهاز إرسال لاسلكي والإدراج من القطب يؤدي في مختلف الأضلاع وشبه المنحرفة العضلات لقياس النشاط كهربية هذه العضلات الشهيق. يتم قياس التهوية تخطيط التحجم كامل الجسم، ويتم تقييمه حركة الحيوان عن طريق الفيديو ومتزامنة مع النشاط كهربية. وتعرض قياسات لنشاط العضلات والتهوية في نموذج الفأر من التصلب الجانبي لإظهار كيف أن هذا أداة يمكن استخدامها لمعرفة كيف التنفسي تغييرات نشاط العضلات مع مرور الوقت، وتقييم تأثير النشاط العضلي على التهوية. الأساليب المذكورة يمكن éasily تكييفها لقياس نشاط العضلات الأخرى أو لتقييم الإكسسوارات نشاط العضلات التنفسية في نماذج الماوس إضافية من المرض أو الإصابة.

المقدمة

عضلات الجهاز التنفسي الإكسسوارات (الأسلحة) زيادة التهوية خلال فترات ارتفاع الطلب (على سبيل المثال، ممارسة الرياضة) وتساعد على الحفاظ على التهوية عند الشبهة وظيفة الحجاب الحاجز بعد الإصابة أو المرض 1 و 2. وعلى الرغم من التغيرات في وظيفة الحجاب الحاجز قد تم وصفها بشكل جيد في التصلب الجانبي (ALS) من المرضى الضموري ونماذج الماوس 3، 4، 5، 6، لا يعرف الكثير الكثير عن نشاط أو وظيفة السلاح في ALS. ومع ذلك، اقترحت إحدى الدراسات أن المرضى ALS التي تجند المحفوظات يكون أفضل التكهن من تلك التي مع ضعف الحجاب الحاجز مشابه لا 7. وعلاوة على ذلك، والنشاط ARM يكفي للتنفس في حالات شلل الحجاب الحاجز 8. وتشير هذه الدراسات إلى أن استراتيجيات لتعزيز وظيفة ARM قد تحسن breathiنانوغرام في المرضى الذين يعانون من الأمراض العصبية والعضلية، إصابات الحبل الشوكي، أو غيرها من الشروط التي ويضعف وظيفة الحجاب الحاجز. ومع ذلك، فإن آليات السيطرة على تجنيد ARM للتنفس غير معروفة إلى حد كبير. أساليب لقياس وظيفة الجهاز التنفسي والتغيرات في النشاط ARM مع مرور الوقت في النماذج الحيوانية للمرض أو إصابة وهناك حاجة لدراسة كيفية توظيف الأسلحة، وكذلك لتقييم العلاجات لتحسين التوظيف ARM والتهوية. وعلاوة على ذلك، فإن النشاط المتزايد للأسلحة بالتزامن مع الفقدان التدريجي من وظيفة الحجاب الحاجز قد تكون العلامات البيولوجية مفيدة لتطور المرض في الأمراض العصبية والعضلية مثل ALS 7 و 9 و 10.

يصف هذا البروتوكول وسيلة لغير جراحية (بعد الجراحة الأولية) وبشكل متكرر قياس نشاط عضلات الجهاز التنفسي والتهوية في مستيقظا والفئران يتصرف. التسجيلات متزامنة من مخطاط كهربية العضلص (EMG)، تخطيط التحجم كامل الجسم (WBP)، والفيديو يسمح للمحقق لتقييم كيفية تأثير التغيرات في النشاط ARM التهوية تأثير ولتحديد عندما يكون الموضوع هو في بقية أو التحرك. والميزة الرئيسية لهذا الأسلوب هو أنه لا يمكن أن يؤديها في مستيقظا والفئران يتصرف، في حين أن بعض وسائل بديلة لقياس EMG تتطلب التخدير و / أو هي الإجراءات النهائية 11 و 12 و 13. ويمكن أيضا أن يتحقق تسجيل النشاط EMG في الفئران مستيقظا مع مرور الوقت من خلال غرس المزمن EMG يؤدي، حيث المربوطة الماوس عن طريق الأسلاك إلى نظام الحصول على 14 و 15. لأن الربط الماوس يمكن أن تتداخل مع الحركة الطبيعية أو السلوك وقد لا تكون متوافقة مع غرفة تخطيط التحجم القياسية، يستخدم الأسلوب هو موضح أجهزة القياس عن بعد لاسلكيا لنقل إشارة EMG لنظام التملك. الارسال يمكنيمكن تشغيل أو إيقاف تشغيله مع المغناطيس للحفاظ على طاقة البطارية ويسمح قياسات النشاط EMG المتكررة على مدى عدة أشهر. هذا البروتوكول يمكن تكييفها بسهولة لقياس نشاط عضلات الجهاز التنفسي أو غير الجهاز التنفسي إضافية عن طريق إدراج EMG يؤدي إلى العضلات المختلفة. بدلا من ذلك، واحدة من الخيوط اثنين يمكن أن تستخدم لقياس النشاط الدماغي لتقييم حالة سكون أو لتحديد النشاط مصادرة 16. وقد تم بنجاح تستخدم هذه التقنية لقياس التغيرات في النشاط ARM في بقية أنحاء تطور المرض في نموذج الفأر من ALS وتحديد الخلايا العصبية الرئيسية الدافعة النشاط ARM في الفئران صحي 10.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة على الإجراءات التجريبية من قبل لجنة سينسيناتي للأطفال مستشفى المركز الطبي المؤسسي رعاية الحيوان واستخدام وأجريت وفقا لدليل المعاهد الوطنية للصحة للرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية.

1. الاستعداد للالقياس زراعة جهاز جراحة

  1. وضعت على معدات الحماية الشخصية (أي يدعك، ويغطي الحذاء، ثوب، الشعر الصافي، وقناع، والقفازات الجراحية).
    ملاحظة: هذه الجراحة يتطلب حقل معقمة.
  2. تشغيل الحاضنة (التي تسيطر عليها أجهزة حاضنة مرطب / وفيات الرضع مجموعة إلى 29 ° C)، وذلك تمشيا مع الجافة، والمناشف البيضاء للسماح الاحترار الصحيح لتحقيق الانتعاش.
  3. قبل الجراحة، وتعقيم جميع الأدوات الجراحية مع أكسيد الإيثيلين وتعقيم الارسال مع المنظفات الأنزيمية والمعقمات الكيميائية (أو كما هو محدد من قبل الشركة المصنعة) قبل الاستخدام.
    ملاحظة: يجب أن تتضمن الأدوات الجراحية # 2 ملقط الثقب (معيار نصائح / مستقيمة / 12 سم) (X4)، الضيقةملقط نمط (مسننة / المنحني / 12 سم)، مقص فصل الأنسجة (مستقيم / حادة في كليلة / 11.5 سم)، وحامل مشرط والنصل. فمن المستحسن أن يكون لها مجموعة منفصلة من الأدوات المعقمة (اثنان # 2 ملقط ومقص) حصرا للتعامل مع الأسلاك الارسال للحفاظ على الأدوات الجراحية في حالة جيدة.
  4. تعقيم جميع الأسطح في مجال العمليات الجراحية مع مطهر مقبول. ضع المجهر ستيريو تشريح، آلة الأيزوفلورين التخدير، والأدوات الجراحية، ولوس انجليس كليبرز في مجال العمليات الجراحية (انظر جدول المواد).
  5. للحفاظ على درجة حرارة جسم الفأر في حين تحت التخدير، ضع وسادة التدفئة أو بطانية المياه تحت منشفة معقمة أمام مجهر تشريح ستيريو.
  6. تأكد من أن جهاز الإرسال يعمل بشكل كامل قبل استخدامها.
    ملاحظة: مغناطيس صغير يوضع داخل 2 في الارسال وتشغيل الجهاز وإيقاف تشغيله. وعندما يكون الارسال على وعقد بالقرب من راديو وضعت في 500 هرتز AM تردد، وسوف تنبعث منها المستمر، عالي النبرة ضجيج الأز. لإنقاذ حياة البطارية، وتحويل البطارية من قبل ترسيخه في الحيوان.
  7. إعداد الكهربائي يؤدي مسبق لعملية جراحية من قبل تقليم يؤدي البعيدة مع مقص محفوظة للتعامل مع الأسلاك حتى لا يكون هناك ما يقرب من 3 سم من الرصاص (بما فيه الكفاية للوصول إلى العضلات المستهدفة) (الشكل 1A). بدلا من ذلك، لفائف الأسلاك الأقرب إلى الجهاز وربطها مع الغرز حتى لا يكون هناك ما يقرب من 3 سم من الرصاص uncoiled.
    ملاحظة: حفظ جزء قلص حالا من القطب يؤدي لإعداد "القبعات الرصاص" (البلاستيك معزول غلاف)، كما هو موضح في الخطوة 1.9. في الخطوة 3، سيتم إدراج يؤدي الارسال عن طريق العضلات، لذلك ويجب أن تعقد البعيدة، الجزء الظاهر من الأسلاك في مكان والعزل باستخدام قبعات الرصاص.
  8. استخدام مشرط لتقليم قبالة 0.5 سم من الغطاء البلاستيك بدون تقطيع الأسلاك نفسها. استخدام أدوات محفوظة FOص التعامل مع الأسلاك لتمتد نهايات الخيوط 4 - 5X طولها الأصلي بحيث تناسب بسهولة داخل إبرة عيار 25 (الشكل 1B-B ''). تقليم الأسلاك المكشوفة من الخيوط بحيث تكون 0.5 سم في الطول.
  9. إعداد قبعات الرصاص (أنابيب بلاستيكية لتغطية السلك ينتهي) قبل الجراحة. استخدام مشرط لتقليم قبالة أنابيب 0.25 سم طويلة من غلاف من البلاستيك المحيطة شرائح الكهربائي يؤدي حفظها من الخطوة 1.7.
    ملاحظة: هناك حاجة إلى أربعة قبعات الرائدة لكل الفأر الذي سيخضع زرع، ولكن من الأفضل أن تعد ضعف المبلغ المطلوب من القبعات. وجود معقمة أغطية إضافية استعداد الرصاص مفيد في حالة تأمين غطاء من الرصاص غير ناجحة في المحاولة الأولى.
  10. تسجيل الرقم التسلسلي للجهاز الإرسال إدخال وحفظ التعبئة والتغليف الأصلي مع المعلومات معايرة. كل مرسل له المعايرة ترددية مختلفة لتسجيل EMG. إدخال هذه في برنامج الحصول على الحصول مقبول EMGالتسجيلات.

2. إعداد الماوس لجراحة

  1. اختيار الماوس المطلوب للزرع (أي SOD1 (G93A) أو السيطرة) وتزن الحيوان.
    ملاحظة: أوصى عمر والوزن بالنسبة للماوس (ذكر أو أنثى) تمر هذه الجراحة هي P56 - P120 و ≥ 24 غرام على التوالي.
  2. تخدير الماوس تحت 3.5٪ الأيزوفلورين مع / دقيقة معدل تدفق الأوكسجين 2 L. إجراء قرصة أخمص قدميها، وقرصة ذيل للتأكد من أن الفأر هو تخدير كامل.
  3. مرة واحدة تخدير، وإزالة الماوس من مربع القائمة والحفاظ على التخدير عن طريق الأنف مخروط من خلال تحديد مستوى الأيزوفلورين إلى 1.5٪ ومعدل تدفق الأوكسجين إلى 1 لتر / دقيقة. إجراء قرصة أخمص القدمين و / أو قرصة الذيل للتأكد من أن يتم الحفاظ على التخدير.
  4. تطبيق مرهم للعين زيوت التشحيم لمنع العينين من الجفاف أثناء الجراحة.
  5. حلق الماوس لفضح موقع الجراحة بين الأذن والكتف (الشكل 1C).
    6. مقطع أظافر المماثل إلى موقع الجراحة لتقليل فرصة من الفأرة الانسحاب يؤدي أو تسبب الجروح التي الخدش أثناء عملية الشفاء.
  6. البديل ينظف موقع الجراحية، أولا مع مطهر ثم مع الأيزوبروبانول. كرر 2 مرات أكثر.

3. غرس جهاز القياس إلى سجل مختلف الأضلاع وشبه المنحرفة EMG آخر

  1. وضع الحيوان تحت المجهر تشريح، على جانبها على رأس وسادة العقيمة التي تغطي وسادة التدفئة، وتأمين مخروط الأنف في مكان مع الشريط. لاحظ أنه من الأفضل أن زرع الجانب الأيمن للحد من إشارة ECG النابعة من القلب.
    ملاحظة: مراقبة التنفس وضبط مستويات الأيزوفلورين، إذا لزم الأمر، للحفاظ على معدل التنفس العادية والطائرة الجراحية المناسبة من التخدير.
  2. سحب forelimb نحو سفح المماثل على طول الجذع.
    ملاحظة: هذا الموقف نزوح لوح الكتف caudally، وتوفير الوصول الجراحية إلى لياليcalene وشبه المنحرفة العضلات.
    1. خذ ملقط منحنية حادة، كبح المماثل مخلب الأمامي لموقع الجراحية، والشريط مخلب في مكان (الشكل 1C). استخدام الشريط الجراحية لاصقة قوية للتأكد من أن مخلب غير آمن لمدة الإجراء.
  3. وضع على زوج جديد من القفازات الجراحية. استخدام مشرط لإجراء شق مائل، ما يقرب من 2 سم طويلة، بين الكتف والأذن (الخط الأحمر في الشكل 1C).
  4. باستخدام اثنين # 2 ملقط الثقب، واحدة في كل يد، والتراجع لوحة الدهون ونشر عدا شبه المنحرفة ولل platysma العضلات لفضح اللفافة التي تغطي القصية الترقوية الخشائية ومختلف الأضلاع عضلات (1D الشكل وE).
  5. استخدام العضلات القصية الترقوية الخشائية شاحب والعصب الحجابي كما المعالم لتحديد عضلات مختلف الأضلاع. لاحظ أن العصب الحجابي موازية للعضلات مختلف الأضلاع، في حين أن القصية الترقوية الخشائية تكمن inferior. عضلات مختلف الأضلاع تشغيل بشكل غير مباشر من الفقرة العنقية لالأضلاع تحت العضلات شبه المنحرفة. سيتم إدراج يؤدي Biopotential في عضلة مختلف الأضلاع الأمامية، والتي يمكن حصرها في العضلات التي تدير المتاخمة للالعصب الحجابي (الشكل 1F وG).
    ملاحظة: الحذر. هذه المنطقة هي أوعية دموية للغاية، ويجب توخي الحذر لتجنب قطع الشريان تحت الترقوة. تجنب إتلاف الحجابي العصبية والضفيرة العضدية.
  6. مرة واحدة وقد تم التعرف على عضلات مختلف الأضلاع وشبه المنحرفة (الشكل 1G)، وجعل جيب تحت الجلد لجهاز الإرسال على الجزء الخلفي من الحيوان، بين scapulas.
    1. استخدام مقص فصل الأنسجة، وإدراج نصائح صريحة من مقص فقط تحت الجلد ونشرها حتى جيب فتح التي تتشكل حول 1.25x عرض الارسال (الشكل 1H).
      ملاحظة: يجب أن يتم إدراج الارسال مع الحد الأدنى من المقاومة، ولكن بثرةيجب آخرون لا تكون كبيرة بحيث الارسال يمكن ان تتحرك من تلقاء نفسها. إذا كان جيب صغير جدا، يمكن للمرسل فرك على الجلد، مما يسبب تهيج التي قد يدفع الحيوان إلى خدش الجلد و / أو سحب يؤدي بها. إذا كان جيب كبير جدا، ويمكن أن تشكل seromas، أو الارسال يمكن أن تهاجر إلى وضع غير موات.
  7. مطاردة مع دافئة، ملحي معقم وإدراج الارسال مع الجانب تملق ضد العضلات. ضع الارسال بحيث انها تقع شقة والأسلاك يخرج من جيب، موازية لبعضها البعض بدلا من الملتوية (الشكل 1I). حليقة أي طول الزائد من الأسلاك تحت الجهاز ووضع انها مسطحة.
  8. تشغيل يؤدي من جهاز الإرسال إلى مختلف الأضلاع وشبه المنحرفة العضلات بحيث مجموعتين من الخيوط ثنائي المكنة تكمن شقة وموازية لبعضها البعض.
  9. استخدام الملقط الثقب للفصل بين مختلف الأضلاع الأمامية من العضلات المحيطة بها وادخال ابرة عيار 25 خلال المصحف مختلف الأضلاعشركة كلي، عمودي على ألياف العضلات.
    1. إدراج واحد يؤدي إلى رأس الإبرة ثم سحب الإبرة من العضلات، تاركين وراءهم الرصاص إدراجها في العضلات حتى العزل من السلك (الشكل 1J وK). سجل الذي يتم إدراج يؤدي الملونة في التي العضلات.
  10. وضع قطرة صغيرة من مادة لاصقة غراء سريع إلى نهاية المكشوفة من السلك، على مقربة من العضلات حيث يتم إدخال الرصاص، وسرعان ما تنزلق الغطاء الرئيسي عبر السلك بحيث يتعرض أي سلك بين غطاء الرصاص والعضلات (الشكل 2A وB).
    ملاحظة: على الرغم من أنه هو ممارسة مقبولة لتأمين EMG يؤدي مع غراء سريع 17 و 18 و طريقة بديلة هو تأمين غطاء من الرصاص في مكان عن طريق ربط عقدة الخيط الحرير حوله.
  11. تقليم القاصي السلك الزائد إلى الحد الأقصى وتطبيق قطرة من مادة لاصقة غراء سريع إلى نهاية الغطاء الرئيسي / الأسلاك. إعطاء الغراءالوقت لتتبلمر قبل الإفراج عن (الشكل 2C وD).
  12. اتبع نفس الخطوات (الخطوات 3،10-3،12) لإدراج قطبية الرصاص المعاكس موازية لأول مرة في العضلات نفسها، 1-2 ملم بعيدا عن الرصاص الأول.
  13. كرر الخطوات 3،10-3،12 لادخال يؤدي في العضلات شبه المنحرفة، وتقع الأمامي لعضلة مختلف الأضلاع (الشكل 1L وM).
  14. تأكد من أن يؤدي الأسلاك ثابتة في مكان وأن هناك فقط ما يكفي من الركود في خيوط للحيوان لأداء حركات الجسم دون سحب على الخيوط. تأكد من أن أي طول الزائد من الرصاص لا يدفع على الجلد، لأن ذلك قد يسبب تهيج التي قد يدفع الحيوان إلى نقطة الصفر أو سحب يؤدي بها. إعادة يؤدي، إذا لزم الأمر، لمنع أي إزعاج محتمل.
  15. إزالة بلطف الشريط الضغط باستمرار على forelimb. سحب لوحة الدهون مرة أخرى على العضلات واستخدامه لتغطية يؤدي المدرجة. إغلاق شق بمادة لاصقة غراء سريع من قبل إغاظةاللوحات الجلد معا مرة أخرى بحيث تكون خطوط شق يصل. قرصة جزء من اللوحات الجلد مع ملقط المنحنية وتطبيق خط صغير من مادة لاصقة غراء سريع على طول هذا الخط.
  16. ضخ 0.1 مل من تحت الجلد كاربروفين للتخفيف من حدة الألم بعد العملية في حين أن الحيوان لا يزال تحت التخدير.
    ملاحظة: الاستمرار في إدارة 0.1 مل من كاربروفين مرة واحدة يوميا لمدة 1-2 أيام بعد الجراحة، وبعد ذلك حسب الحاجة بعد ذلك.
  17. إزالة الحيوان من الرؤوس ووضعه في قفص نظيفة في الحاضنة قبل تحسنت حتى الحيوان مستيقظا ويتحرك في قفص طوعا. حفاظ على الحيوانات في الحاضنة لمدة 15 دقيقة على الأقل بعد ذلك، ورصد تحركاتها واليقظة.

4. العناية بعد العملية الجراحية

  1. حيوانات المنزل بشكل منفصل بعد الجراحة. توفير الشفاء الحيوانات مع هلام النظام الغذائي وزجاجة مياه.
  2. مراقبة الحيوانات ل30 دقيقة الأولى بعد الجراحة. تحقق على الحيوان على الأقل كل ساعة وأو 5 ساعة بعد الجراحة. في الأيام التي تلت الجراحة، تحقق مرتين على الأقل يوميا.
  3. مشاهدة لنخر، والعدوى على طول شق وداخل تجويف الجسم الذي يحتوي على زرع (أي الحرارة، وتورم، واحمرار)، وتشكيل تورم مصلي.
    ملاحظة: تحدث هذه العلامات في غضون الأسبوع الأول بعد الجراحة. ويرد صحي تلتئم الحيوان شهر واحد بعد عملية جراحية في الشكل 1N. على الرغم من أن التسجيلات EMG يمكن إجراء مباشرة بعد الزرع، يتم إعطاء الحيوانات أسبوع واحد على الأقل للشفاء قبل تسجيل EMG وتخطيط التحجم، وإشارات ECG يمكن أن تكون عالية مباشرة بعد الزرع.

5. الحصول في وقت واحد الكهربائي وتخطيط التحجم إشارات

  1. تشغيل جميع المعدات الاستحواذ، بما في ذلك تدفق التحيز.
    ملاحظة: عادة ما يتم تعيين معدل التدفق للفئران عند 1.0 لتر / دقيقة.
  2. معايرة غرفة تخطيط التحجم (ق) باستخدام تدفق متر.
    ملاحظة: فحص دوري للchambe تخطيط التحجمالتمرير للتأكد من أن الأختام لا تصدع أو كسر. معطف الأختام المطاطية مع مواد التشحيم مثل الشحوم فراغ مرة واحدة في الأسبوع للحفاظ على حالتهم جيدة.
  3. معايرة الارسال المدخلات كما هو محدد من قبل الشركة المصنعة.
  4. ضع الماوس في غرفة تخطيط التحجم مدة 1 ساعة على الأقل حتى يتأقلم ذلك قبل تسجيل EMG وتخطيط التحجم. عن طريق غرف متعددة، فمن الممكن أن يسجل من الماوس واحدة في حين الماوس المقبل والتأقلم في الغرفة الثانية. عدم تشغيل جهاز الإرسال خلال فترة تأقلم من أجل الحفاظ على طاقة البطارية (الشكل 1O).
  5. قبل تسجيل (ولكن بعد المعايرة)، بدوره على الارسال عن طريق وضع مغناطيس قوي في حدود 1 في الحيوان مزروع. والضوء الأحمر في الجزء الأمامي من المتلقي تشير عند الارسال على.
  6. تبدأ الاستحواذ باستخدام القائمة المنسدلة المسمى "شراء" واختيار "ابدأ اقتناء". على الرغم من أن يجوز للمدة التسجيلتختلف من التجربة، وتخطيط التحجم نموذجي وتسجيل EMG يستمر 1-3 ساعة.
    ملاحظة: الارسال لديه معدل أخذ العينات لا يتجزأ من 240 هرتز. يتم تعيين بمعدل أسرع من 500 هرتز في البرنامج أن أقحم بين نقطة وتوفير الموجي أكثر سلاسة. تمرير مرشح منخفض (التي تعد بمثابة فلتر لمكافحة اسم مستعار) وارتفاع مرشح المرور في زرع تحديد عرض النطاق الترددي 1- إلى 50 هرتز لهذا الجهاز القياس عن بعد. 60 هرتز A / C التدخل لا يسهم في الضوضاء الزائدة في إشارة EMG لأن يزرع هي بطارية تعمل بالطاقة والحيوان الدروع الزرع ويؤدي من الحقول الكهربائية. تخطيط التحجم، EMG، والفيديو متزامنة تلقائيا في الوقت الحقيقي عن طريق برنامج الاستحواذ.
  7. عندما يتم الانتهاء من الاستحواذ، إيقاف الارسال مع المغناطيس وإزالة الحيوان من الغرفة.
  8. في حالة بدء تسجيل آخر، وتنظيف الغرفة، أدخل في المعايرة الارسال جديدة من الحيوانات المقبل، والبدء في تسجيل الثاني. إذا زعنفةished مع اكتساب لهذا اليوم، إيقاف تشغيل جهاز الإرسال، وتنظيف غرفة تخطيط التحجم، وإيقاف جميع المعدات اقتناء وتدفق التحيز.

figure-protocol-1
الشكل 1. زرع جهاز القياس لقياس التنفسي EMG العضلات. أجهزة الإرسال (A) والقياس مع اثنين من أزواج من biopotential يؤدي إلى قياس EMG. يؤدي ويمكن خفض إلى الطول المطلوب (القاع) أو لف ومدسوس تحت الارسال (أعلى). (B) مرسل يؤدي. (B ') يؤدي مع قلص قبالة العزل البلاستيك لفضح الأسلاك وجعل القبعات الرصاص (الشكل). (B '') يؤدي بأسلاك امتدت 4 - 5X طولها الأصلي. وينبغي تقليص يؤدي بحيث تكون 0.5 سم (لا تظهر). (C) الفأر على استعداد لإجراء عملية جراحية، مع موقع الجراحية حلق وبشكل صحيحforepaw وضعه. الخط الأحمر المنقط يشير إلى موقع شق. (D) العضلات السطحية الواقعة تحت وسادة من الدهون والرباط، وينظر بعد شق الأولي. T = شبه المنحرفة. S = القصية الترقوية الخشائية. P = لل platysma. السهم الأصفر = العصب الحجابي. الرسم البياني (E) كارتون العضلات والعصب الحجابي هو مبين في (D). وينبغي استخدام ملقط لنشر عدا شبه المنحرفة ولل platysma العضلات للوصول إلى العضلات العميقة مختلف الأضلاع، كما هو موضح في (F) و (G). (F) معالم استخدامها لتحديد موقع مختلف الأضلاع وشبه المنحرفة. هذه الصورة تبين الشريان تحت الترقوة (السهم الأبيض)، والحجابي الضفيرة العصبية / العضدية (السهم الأسود)، والعضلة القصية الترقوية الخشائية شاحب (السهم الأصفر). (G) كارتون تصور مكان أعمق العضلات (أي مختلف الأضلاع الأوسط، مختلف الأضلاع الأمامية، وSCM)، الشريان تحت الترقوة، والعصب الحجابي. في مختلف الأضلاع الخلفية غير مرئية. ويمكن الوصول إليها إلا عندما superficiوتنتشر آل العضلات (في D و E) على حدة. (H) جعل جيب لجهاز باستخدام مقص حادة طرف. (I) المدرجة الارسال في جيب تحت الجلد، مع الخيوط وضعه المتوازية الناشئة من جيب. (J) إدخال الإبرة عيار 25 في مختلف الأضلاع، عمودي على ألياف العضلات، لجعل نفق للسلك الرصاص. (K) كلا يؤدي إدراجها في العضلات مختلف الأضلاع. يتم وضع القبعات الرصاص على نهاية ولصقها في مكانها. (L) إدخال الإبرة عيار 25 إلى شبه المنحرفة، عمودي على ألياف العضلات، لجعل نفق للسلك الرصاص. (M) كل العروض أربعة إدراجها في شبه المنحرفة ومختلف الأضلاع عضلات والاستلقاء قبل إغلاق الجرح. (N) تعافى تماما الماوس، مع جهاز الإرسال وضعه تحت الجلد على ظهره. (O) في وقت واحد تسجيل تخطيط التحجم، نشاط العضلات EMG، وهوالثانية الفيديو باستخدام غرفة تخطيط التحجم (السهم الأصفر) والقياس عن بعد تلقي وحة (السهم الأحمر)، وكاميرا (السهم الأسود)، على التوالي. تم توصيل تدفق التحيز متعددة الوظائف إلى غرفة تخطيط التحجم عبر أنبوب بلاستيكي (السهم الأزرق) لتزويد الأكسجين إلى الماوس. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-protocol-2
الشكل 2. تأمين قبعات الرصاص مع غراء سريع لاصق. (A) تطبيق قطرة صغيرة من غراء سريع (دائرة الأرجواني) إلى الأسلاك المكشوفة من القطب الرصاص (E) القريبة السلك إلى العضلات. (B) بسرعة حرك غطاء الرصاص على استعداد (LC) على الأسلاك المكشوفة خلال لاصق غراء سريع بحيث يتم وضع الغطاء الرئيسي المجاور مباشرة إلى العضلات. (C) تقليم قبالة جزء صغير من النهاية البعيدة للغطاء الرصاص والأسلاك بحيث لا يوجد القطب تعرضا الحاضر غير معزول مع البلاستيك. (D) تطبيق قطرة واحدة صغيرة من مادة لاصقة غراء سريع إلى نهاية الغطاء الرصاص. إزالة نهاية البعيدة قلص حالا من الغطاء الرئيسي من الحيوان. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

6. تحليل ARM EMG وتخطيط التحجم

  1. فتح برنامج تحليل ومراجعة الملف من الفائدة (اذهب إلى "ملف" واختيار "ملف المراجعة فتح"). تصفية إشارات EMG باستخدام 30 هرتز عالية تمرير مرشح بالنقر بزر الماوس الأيمن على أثر EMG، واختيار "تحليل سمات،" تسليط الضوء "سمات متقدمة 1" علامة التبويب، وتغيير فلتر تمريرة عالية إلى 30 هرتز.
    ملاحظة: هذه الخطوة تصفية يزيل غير تميز، المعلومات التردد المنخفض.
  2. تحديد مجالات النشاط الماوس عن طريق الفحص البصري على أساس عدم وجود حركة في ملف الفيديو متزامنة وعدم وجود تغييرات كبيرة وضغط غير النظامية بسبب حركة في تتبع تخطيط التحجم (المربع الأحمر في الشكل 3A)؛ يحدث الخمول عند الفأر هو نائم أو مستيقظا ولكن لا يزال.
  3. تحديد نوبات EMG بشكل مستقل لكل عضلة.
    1. تصحيح ودمج إشارة EMG تصفية أكثر من 30 مللي ثانية (الشكل 4).
      ملاحظة: لأن الفئران التنفس بمعدل 3 هرتز، يتم تمثيل كل نفس بما يقرب من 11 قيم متكاملة.
    2. تحديد السعة EMG الأساس عن طريق حساب متوسط القيم تصحيحه ومتكاملة المرتبطة إشارة EMG لمدة 3 ثوان عندما الماوس غير نشط ويظهر أثر تخطيط التحجم سوائية التنفس (التنفس الطبيعي) (الشكل 4).
    3. تحديد "نوبات" النشاط يحددها لا يقل عن 3 القيم تصحيحه ومتكاملة المتتالية التي هي على الأقل 5زيادة 0٪ أعلى من إشارة EMG الأساس (تحديدها في الخطوة 6.3.2).
      ملاحظة: ثلاث قيم متتالية تمثل نافذة لمدة 90 مللي، ولكن بعض نوبات تحتوي على أكثر من 3 القيم فوق العتبة وسوف تستمر لفترة أطول من 90 مللي ثانية.
    4. استخدام الفيديو تزامن وتخطيط التحجم التتبع لاستبعاد نوبات التي تحدث أثناء تتنهد (الشكل 3B)؛ استنشاق (الشكل 3C)؛ أو حركات الماوس الإرادية، مثل رئيس تحول أو الاستمالة.
    5. كرر الخطوات من 6.3.1 - 6.3.4 لعضلة الثانية.
  4. حساب تواتر نوبة لكل عضلة. سجل أ) الوقت ونهاية بداية وقت كل فترة غير نشطة وب) الوقت وقعت كل نوبة باستخدام المعايير المذكورة أعلاه. خلاصة القول إجمالي وقت غير نشط. تقسيم العدد الإجمالي للنوبات من قبل دقيقة مجموع الوقت نشط على مدى الدورة تسجيل لحساب تواتر نوبة.
  5. تحديد ما إذا ترتبط التغييرات في التهوية مع تفعيل م سجلتuscles.
    1. حدد المعلمات التنفس المراد قياسها (على سبيل المثال، وتدفق الذروة الشهيق، حجم المد والجزر، وحجم دقيقة، ونفسا في الدقيقة).
      ملاحظة: يمكن الاطلاع على جميع الاختيارات الممكنة في القائمة المنسدلة إعداد P3 تحت عنوان "المعايير المشتقة."
    2. تحديد الأنفاس التي تحدث أثناء ممارسة النشاط نوبة EMG والأنفاس التي تحدث أثناء ممارسة النشاط الأساس EMG (الشكل 4).
    3. إنشاء شرائح محلل تمتد الأنفاس تخطيط التحجم التي ترتبط مع النشاط نوبة EMG وخلق قطاعات محلل المستقلة التي ترتبط مع النشاط EMG الأساسي. تأكد من تعيين النوع من التحليل إلى "محلل SEG".
      ملاحظة: تم العثور على هذا التحديد في القائمة المنسدلة إعداد P3 تحت عنوان "إعداد لحد من البيانات."
    4. بمناسبة بداية كل قطعة محلل مع الحدث من خلال النقر بزر الماوس الأيمن على أثر تخطيط التحجم. تحديد نوبة تحتوي على شرائح محلل ب "الحدث 1" في القائمة المنسدلة وسأن ecify قطاعات محلل الأساسية ب "الحدث 2" للتمييز بين فئتين من القطاعات.
    5. ضمن القائمة "وظائف" حفظ "القسم ماركس" و "ماركس مشتقة البيانات." ضمن القائمة محلل البيانات، حفظ "ملف تحليل مراجعة" و "تحليل مشتقة البيانات."
      ملاحظة: المعلمات التنفس التي اختيرت لكل نفس الفردية وجدت في ورقة البيانات المستمدة ماركس في علامة التبويب المسمى "اشتقاق".
    6. مقارنة المعلمات الجهاز التنفسي للالأنفاس التي تحدث أثناء نوبات ARM (وضعت الحدث 1) مقابل الأنفاس التي تحدث أثناء النشاط الأساسي (وضعت الحدث 2) لتحديد ما إذا كان يرتبط نشاط العضلات مع التغيرات في التهوية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تم استخدام بروتوكول صفها لزرع جهاز القياس عن بعد وتسجيل مختلف الأضلاع وشبه المنحرفة EMG، WBP، والفيديو على فأرة الحاسوب SOD1 (G93A) ALS نموذج. تم تحديد الفترات التي يكون الحيوان غير نشط (على سبيل المثال، لا يتحرك) باستخدام تسجيل الفيديو، وأكد من عدم وجود نشاط متعلق الحركة في تتبع WBP (الشكل 3A). وتشمل فترات الخاملة الوقت الذي يقضيه في REM أو غير REM من النوم، فضلا عن الوقت الذي يقضيه مستيقظا ولكن لا يزال (الشكل 3A)...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

الإجراء تظاهر هنا يسمح للموسع (بعد زرع الجراحية الأولية للمرسل) قياس نشاط العضلات التنفسية والتهوية على مدى عدة أشهر في نفس الحيوان. هذه التقنية لديها العديد من المزايا أكثر من التقنيات EMG القياسية في الفئران تخدير: 1) التجارب تتطلب عددا أقل من الفئران وتوفر القدرة على تسجيل البيانات من نفس الموقع في ماوس واحدة عبر مراحل المرض (بدلا من استخدام الفئران متعددة في مراحل المرض المختلفة)؛ 2) ويمكن إجراء تحليل البيانات مع الاختبارات الإحصائية أكثر قوة (أي استخدام تدابير المتكر...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

وقدم الدعم لهذا العمل من قبل جائزة القيم مستشفى المركز الطبي في سينسيناتي للأطفال لSAC ومنحة تدريب المعاهد الوطنية للصحة (T32NS007453) لVNJ

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
B6.Cg-Tg (SOD1 * G93A) 1 مختبر غور / جيجاكسون4435
غرفة تحجمبوكسكو منتجات الجهاز التنفسي / علوم البيانات الدولية601-1425-001
مستقبلات القياس عن بعد (نموذج RPC-1)علوم البيانات الدولية272-6001-001
مضخة تدفق التحيز (نموذج BFL0500)علوم البيانات الدولية601-2201-001
ACQ-7000 USBData Sciences InternationalPNM-P3P-7002XS
Dataquest A.R.T. مصفوفة تبادل البياناتالدولية لعلوم البيانات271-0117-001
نظام تحليل Ponemahعلوم البيانات الدوليةPNM-POST-CFG
برنامج تجميع منصة وظائف الأعضاء Ponemah v5.20علوم البيانات الدوليةPNM-P3P-520
حزمة تحليل تخطيط تحجم التنفس الكامل غير المقيدة Ponemah v5.20InternationalPNM-URP100W
تكوين Ponemah نظامبرمجيات علوم البيانات الدوليةPNM-P3P-CFG
وحدة التحليل (URP)علوم البيانات الدوليةPNM-URP100W
AmplifierData Sciences International13-7715-59
علوم بيانات لوحة المزامنةالدولية271-0401-001
علوم بيانات الكابلات المتزامنةالدولية274-0030-001
محول ضغط الطاقة بوكسكولعلوم البيانات الدولية600-1114-001
علوم بيانات مقياس التدفقالدولية600-1260-001
المغناطيس والراديو المدرجة في مجموعةالمبتدئين F20-EETعلوم البيانات الدولية276-0400-001
محور P1363 كاميرا فيديو   Data Sciences International275-0201-001
Terg-A-ZymeFisher Scientific50-821-785منظفات الإنزيم
ActrilMinntech Corporation78337-000
مجهر تشريح ستيريو معقم كيميائي (موديل MEB126)Leica10-450-508
مرطب مضاعف / حاضنة رضعOHMEDA Ohio Care Plus6600-0506-803
TL11M2-F20-EET أجهزة الإرسالعلوم البيانات الدولية270-0124-001
Dumont # 2 ملقط استئصال الصفيحة الفقرية - أطراف قياسية / مستقيمة / 12 سم (x2)  الأدوات العلمية الدقيقة11223-20لمناولة الأسلاك ملقط
استئصال الصفيحة الفقرية Dumont # 2 - أطراف قياسية / مستقيمة / 12 سم (x2)الأدوات العلمية الدقيقة11223-20للجراحة
ملقط نمط ضيق - مسنن / منحني / 12 سمأدوات علمية دقيقة17003-12
مقص زنبركي - قطع متين / مستقيم / حاد / 12.5 سم / 6 ممعلمية دقيقة متطورة15124-12
مقص فصل الأنسجة - مستقيم / حاد حاد / 11.5 سمأدوات علمية دقيقة14072-10
مقص فاين - مقص متين / منحني / حاد حاد / 9 سم   ؛الأدوات العلمية الدقيقة14058-11لقطع الأسلاك وقص المسامير
مقبض مشرط # 3أدوات الدقة العالمية500236
شفرة مشرطالأدوات العلمية الدقيقة10010-00لتحضير أغطية الرصاص خياطة
Polysorb مضفرة قابلة للامتصاصCovidenD4G1532Xللف يؤدي جهاز الإرسال
Gluture   ؛شركة Zoetis6606-65-1مادة لاصقة سيانواكريليت
3 مل طرف حقنة -118030055
25 جم إبرة (x2)Becton Dickinson and Co.305-145
أدوات تطبيق قطنية ذات رؤوسهنري شاين لصحة100-9175
مجموعة ماكينة قص الشعر من AndisAndis049-06-0271ماكينة حلاقة كهربائية تباع في Target
IsofluraneHenry Schein Animal Health29404Anesthetic 
كحول الأيزوبروبيل 70٪أولوية الرعاية 1MS070PC
ديرماكلور 2٪ مقشر طبي (كلوروهيكسيدين 2٪)بتلر شاين55482
دموع اصطناعيةهنري شاين صحة48272زيوت التشحيم مرهم البصريات
فراغ الشحومداو كورنينج كوربوريشن1597418
بطانية مياهJorVetJOR784BN
الجديد Information Universal أدوات طبية ناعمة حيوية Easy Cut

المراجع

  1. Johnson, R. A., Mitchell, G. S. Common mechanisms of compensatory respiratory plasticity in spinal neurological disorders. Respir Physiol Neurobiol. 189 (2), 419-428 (2013).
  2. Sieck, G. C., Gransee, H. M. Respiratory Muscles: Structure, Function & Regulation. , Morgan & Claypool Life Sciences. Lecture #34 (2012).
  3. Rizzuto, E., Pisu, S., Musaro, A., Del Prete, Z. Measuring Neuromuscular Junction Functionality in the SOD1(G93A) Animal Model of Amyotrophic Lateral Sclerosis. Ann Biomed Eng. 43 (9), 2196-2206 (2015).
  4. Kennel, P. F., Finiels, F., Revah, F., Mallet, J. Neuromuscular function impairment is not caused by motor neurone loss in FALS mice: an electromyographic study. Neuroreport. 7 (8), 1427-1431 (1996).
  5. Pinto, S., Alves, P., Pimentel, B., Swash, M., de Carvalho, M. Ultrasound for assessment of diaphragm in ALS. Clin Neurophysiol. 127 (1), 892-897 (2016).
  6. Stewart, H., Eisen, A., Road, J., Mezei, M., Weber, M. Electromyography of respiratory muscles in amyotrophic lateral sclerosis. J Neurol Sci. 191 (1-2), 67-73 (2001).
  7. Arnulf, I., et al. Sleep disorders and diaphragmatic function in patients with amyotrophic lateral sclerosis. Am J Respir Crit Care Med. 161, 849-856 (2000).
  8. Bennett, J. R., et al. Respiratory muscle activity during REM sleep in patients with diaphragm paralysis. Neurology. 62 (1), 134-137 (2004).
  9. Pinto, S., de Carvalho, M. Motor responses of the sternocleidomastoid muscle in patients with amyotrophic lateral sclerosis. Muscle Nerve. 38 (4), 1312-1317 (2008).
  10. Romer, S. H., et al. Accessory respiratory muscles enhance ventilation in ALS model mice and are activated by excitatory V2a neurons. Exp Neurol. 287 (Pt. 2, 192-204 (2017).
  11. Moldovan, M., et al. Nerve excitability changes related to axonal degeneration in amyotrophic lateral sclerosis: Insights from the transgenic SOD1(G127X) mouse model. Exp Neurol. 233 (1), 408-420 (2012).
  12. Pagliardini, S., Gosgnach, S., Dickson, C. T. Spontaneous sleep-like brain state alternations and breathing characteristics in urethane anesthetized mice. PLoS One. 8 (7), 70411(2013).
  13. Nicaise, C., et al. Phrenic motor neuron degeneration compromises phrenic axonal circuitry and diaphragm activity in a unilateral cervical contusion model of spinal cord injury. Exp Neurol. 235 (2), 539-552 (2012).
  14. Akay, T. Long-term measurement of muscle denervation and locomotor behavior in individual wild-type and ALS model mice. J Neurophysiol. 111 (3), 694-703 (2014).
  15. Tysseling, V. M., et al. Design and evaluation of a chronic EMG multichannel detection system for long-term recordings of hindlimb muscles in behaving mice. J Electromyogr Kinesiol. 23 (3), 531-539 (2013).
  16. Weiergraber, M., Henry, M., Hescheler, J., Smyth, N., Schneider, T. Electrocorticographic and deep intracerebral EEG recording in mice using a telemetry system. Brain Res Brain Res Protoc. 14 (3), 154-164 (2005).
  17. Pilla, R., Landon, C. S., Dean, J. B. A potential early physiological marker for CNS oxygen toxicity: hyperoxic hyperpnea precedes seizure in unanesthetized rats breathing hyperbaric oxygen. J Appl Physiol. 114 (1985), 1009-1020 (1985).
  18. Morrison, J. L., et al. Role of inhibitory amino acids in control of hypoglossal motor outflow to genioglossus muscle in naturally sleeping rats. J Physiol. 552 (Pt. 3, 975-991 (2003).
  19. Tscharner, V., Eskofier, B., Federolf, P. Removal of the electrocardiogram signal from surface EMG recordings using non-linearly scaled wavelets). J Electromyogr Kinesiol. 21 (4), 683-688 (2011).
  20. Hof, A. L. A simple method to remove ECG artifacts from trunk muscle EMG signals. J Electromyogr Kinesiol. 19 (6), e554-e555 (2009).
  21. Lu, G., et al. Removing ECG noise from surface EMG signals using adaptive filtering. Neurosci Lett. 462 (1), 14-19 (2009).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

القياس المتكرر التنفسي آخر العضلات والتهوية في نماذج الماوس من مرض عصبي عضلي
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.