Method Article

مستوحاة تشريحيا ثلاثي الأبعاد الأنسجة الدقيقة المهندسة الشبكات العصبية لإعادة الإعمار الجهاز العصبي، والتحوير، والنمذجة

DOI:

10.3791/55609

⸱

May 31st, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, School of Engineering and Applied Science, University of Pennsylvania, 2Center for Brain Injury & Repair, Department of Neurosurgery, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 3Center for Neurotrauma, Neurodegeneration & Restoration, Michael J. Crescenz Veterans Affairs Medical Center, 4School of Biomedical Engineering, Drexel University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذه المخطوطة تفاصيل تلفيق الشبكات العصبية الأنسجة الدقيقة المهندسة: بناء ثلاثي الأبعاد ميكرون الحجم تتألف من المسالك المحورية محاذاة طويلة تمتد سكان الخلايا العصبية المجمعة المغطاة في هيدروجيل أنبوبي. هذه السقالات الحية يمكن أن تكون بمثابة التبديلات وظيفية لإعادة بناء أو تعديل الدوائر العصبية أو كما بيوفيديك اختبار الأسرة تحاكي الرمادي الأبيض المادة العصبية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نادرا ما يحدث الانتعاش وظيفية بعد الإصابة أو انحطاط الناجم عن المرض داخل الجهاز العصبي المركزي (نس) بسبب البيئة المثبطة والقدرة المحدودة على تكوين الخلايا العصبية. نحن نعمل على تطوير استراتيجية لمعالجة في وقت واحد الخلايا العصبية والمحور فقدان المسار داخل الجهاز العصبي المركزي التالفة. تقدم هذه المخطوطة بروتوكول تصنيع الشبكات العصبية المهندسة الأنسجة الدقيقة (تينس-ميكرو)، والبنى زرع تتكون من الخلايا العصبية ومسارات محور عصبي الانحياز التي تمتد تجويف المصفوفة خارج الخلية (إسم) من هيدروجيل اسطوانة بريفورميد المئات من ميكرون في القطر التي قد تمتد سنتيمتر في الطول. يتم تحديد المجاميع العصبية إلى أقصى حد من التضمين ثلاثي الأبعاد وتمتد من إسقاطات محور عصبي. يتم وضع تينس الصغرى كاستراتيجية لإعادة الإعمار الجهاز العصبي المركزي، محاكاة جوانب الهندسة المعمارية الدماغ كونيكوم ويحتمل توفير وسائل لاستبدال الشبكة. نيوقد تتشابك مجاميع رونال مع أنسجة المضيف لتشكيل مرحلات وظيفية جديدة لاستعادة و / أو تعديل الدوائر المفقودة أو التالفة. ويمكن أن تكون هذه البنى أيضا بمثابة الموالية للتجدد "السقالات الحية" قادرة على استغلال الآليات التنموية للهجرة الخلية والمحاور المساري، وتوفير التآزر الهيكلي والذوبان الإشارات استنادا إلى حالة التجديد. يتم تصنيعها تينس الصغرى عن طريق صب هيدروجيل السائل في قالب أسطواني يحتوي على إبرة تركز طوليا. مرة واحدة وقد تلمح هيدروجيل، تتم إزالة الإبرة، وترك عمود الصغير جوفاء. يتم إضافة حل إسم إلى التجويف لتوفير بيئة مناسبة لالتصاق العصبية ونمو محور عصبي. يتم تجميع الخلايا العصبية متفرقة ميكانيكيا للبذر الدقيق داخل واحد أو طرفي العمود الصغير. هذه المنهجية تنتج موثوقة بنيات مصغرة مكتفية ذاتيا مع المسارات محور عصبي طويلة الإسقاط التي قد تلخص ملامح الدماغ العصبي. سينابتيك إمونولابيلينغ ومؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا تشير إلى أن تينس الصغرى تمتلك توزيع متشابك واسعة النطاق والنشاط الكهربائي الجوهري. وبالتالي، تينس الصغرى تمثل استراتيجية واعدة لإعادة بناء الأعصاب المستهدفة من مسارات الدماغ، ويمكن أيضا أن تطبق كنماذج بيوفيديك لدراسة الظواهر العصبية الحيوية في المختبر .

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وهناك سمة مشتركة من اضطرابات وأمراض الجهاز العصبي المركزي، مثل إصابات الدماغ الصدمة (تبي)، إصابة الحبل الشوكي (سسي) والسكتة الدماغية ومرض الزهايمر، ومرض باركنسون، هو انقطاع مسارات محور عصبي والخلايا العصبية الخسارة 1 ، 2 ، 3 ، 4 ، 5 ، 6 . على سبيل المثال، عندما يذهب السكتة الدماغية دون علاج، ويقدر أن محاور يتم فقدان بمعدل 7 أميال من المحاور في الدقيقة 5 . في حالة تبي، والتي ما يقرب من 1.7 مليون شخص تجربة كل ع....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على جميع الإجراءات التي تنطوي على الحيوانات من قبل اللجان المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام في جامعة بنسلفانيا والمركز الطبي مايكل مايكل كريزينز شؤون المحاربين القدماء والتزمت المبادئ التوجيهية المنصوص عليها في المعاهد الوطنية للصحة سياسة خدمة الصحة العامة على الرعاية الإنسانية واستخدام المختبر الحيوانات (2015).

1. تطوير أغاروس هيدروجيل (مكون أسيلولار من الصغرى تينس)

  1. أغاروس حل إعداد

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Results

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    تم رصد تينس الصغرى باستخدام مرحلة المجهر التباين لتقييم سيتوارشيتتيور ونمو محور عصبي ( الشكل 4 ). داخل أحادي الاتجاه، 2 مم طويلة تينس الصغرى، تم تقييد المجاميع العصبية إلى نهاية واحدة من العمود الصغير وتوقع حزمة من المحاور من خلال النواة الداخلية. محاور امتدت طول العمود بأكمله من قبل 5 أيام في المختبر (ديف) ( الشكل 4A ). كان هناك معدل نمو محوري أولي أكبر في ثنائية الاتجاه 2 مم طويلة تينس-تينس، كما محاور ام.......

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Discussion

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    إصابة الجهاز العصبي المركزي والمرض يؤدي عادة إلى فقدان أو خلل في المسارات محور عصبي لمسافات طويلة التي تتألف من كونكتوم الدماغ، مع أو بدون يصاحبها انحطاط الخلايا العصبية. ويضاعف هذا من قبل قدرة محدودة من الجهاز العصبي المركزي لتعزيز الخلايا العصبية والتجدد. على الرغم من السعي لاستراتيجيات إصلاح مثل عامل النمو، والخلية، وتقديم المواد الحيوية كنهج الفردية أو التوافقي، وهذه التقنيات تفشل في حساب في وقت واحد لكل من انحطاط الخلايا العصبية وفقدان الاتصالات محور عصبي 14،22. هذه الثغرات ف.......

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Disclosures

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

    Acknowledgements

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    وقدم الدعم المالي من قبل المعاهد الوطنية للصحة U01-NS094340 (كولين)، T32-NS043126 (هاريس)، و F31-NS090746 (كاتيار))، ومؤسسة مايكل J. فوكس (برنامج خط العلاج العلاجي # 9998 (كولين))، والرابطة الوطنية للعلوم (زمالات بحوث الدراسات العليا دج-1321851 (ستروزينا وأديوول))، وإدارة شؤون المحاربين القدامى (ر & D استعراض ميرت # B1097-I (كولين))، والجمعية الأمريكية من الجراحين العصبية وكونجرس الجراحين العصبية (2015-2016 زمالة كودمان في نيوروتراوما والرعاية الحرجة (بتروف))، والبحوث الطبية الجيش الأميركي وقيادة العتاد (# W81XWH-13-207004 (كولين) و W81XWH-15-1- 0466 (كولين)).

    ....

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Materials

    List of materials used in this article
    NameCompanyCatalog NumberComments
    قاطع الليزرالليزر العالميةPLS4.75تستخدم لتصنيع قالب القناة الدقيقة المقطوع بالليزر.
    جهاز تصنيع العمود الصغير المقطوع بالليزرحسب الطلب--------------اتصل بمجموعة البحث لدينا إذا كنت مهتما. الأبعاد والمخططات الواردة في المخطوطة.
    مسامير----------------------------# 4-40 بقطر خيط 3.05 مم
    المكسرات----------------------------# 4-40 بقطر خيط 3.05 مم
    إبرة الوخز بالإبر (180 وميكرو ؛ قطر م)لاسا الطبيةsj.16X40قد يختلف القطر وفقا للحجم المطلوب لتجويف العمود الصغير.
    طبق بتريفيشر08772B
    محلول ملحي مخزن بالفوسفات من دولبيكو (DPBS)Invitrogen14200075
    البوليسترين الماصة المصلية التي يمكن التخلص منهافيشر13-678-11D
    AgaroseSigmaA9539-50G
    أنبوب شعري (398 وميكرو ؛ قطر م)فيشر21170Dقد يختلف القطر وفقا للحجم المطلوب لغلاف العمود الصغير.
    لوح ساخنفيشرSP88857200
    شريط مغناطيسيفيشر1451352
    ماصة دقيقةسيجماZ683884-1EA
    إبرة قياس 25 ممفيشر14-826-49
    مشرط ميكرو مشرطروبوز جراحيRS-6270
    مقصأدوات العلوم الدقيقة14081-09
    الملقطالعالمي للأدوات الدقيقة501985
    معقم الخرز الساخنSigmaZ378550-1EA
    StereoscopeNikonSMZ800Nيستخدم لجميع خطوات التشريح وتصنيع micro-TNN.
    ذيل الفئران النوع الأول من الكولاجينCorning354236الحفاظ على 4 & ordm; C وإزالتها فقط عند الحاجة. استخدم الثلج للحفاظ على درجة حرارته عند الاستخدام.
    أنبوب الطرد المركزيالدقيق فيشر02-681-256
    الماوس لامينينكورنينج354232الحفاظ على 4 & ordm; C وإزالتها فقط عند الحاجة. استخدم الثلج للحفاظ على درجة حرارته عند الاستخدام.
    الوسط العصبيInvitrogen21103049الوسط القاعدي لثقافة الخلايا العصبية قبل الولادة والجنينية. تخزين في 4 & ordm; C ودافئ عند 37 & ordm; ج قبل الاستخدام.
    هيدروكسيد الصوديوم (هيدروكسيد الصوديوم)فيشرSS2661
    حمض الهيدروكلوريك (حمض الهيدروكلوريك) فيشرSA48-1
    ورق عبادفيشر09-876-18
    محلول الملح المتوازن من هانك (HBSS)Invitrogen14170112يحفظ في درجة حرارة 4 درجة مئوية.
    0.25٪ Trypsin-EDTAInvitrogen25200056Store في -20 & ordm; C ودافئ عند 37 & ordm; ج قبل الاستخدام.
    ديوكسيربونوكلياز البنكرياس البقري (DNase) ISigma10104159001Store at -20 & ordm; C ودافئ عند 37 & ordm; ج قبل الاستخدام.
    مكمل B-27المكمل 12587010 Invitrogenالملحق المضاف إلى الوسط العصبي العصبي لثقافة الخلايا العصبية الحصين والقشرية. يخزن في -20 & ordm; C ودافئ عند 37 & ordm; ج قبل الاستخدام.
    L-الجلوتامين Invitrogen35050061Store في -20 & ordm; C ودافئ عند 37 & ordm; ج قبل الاستخدام.
    سبراج دولي اليوم الجنيني 18 فأرنهر تشارلز001
    ماصة باستورفيشر22-042816
    15 مل أنبوب الطرد المركزيEMESCO1194-352099
    دوامةفيشر02-215-414
    الطرد المركزيفيشر05-413-115
    مقياس الدمهيميسيتوير فيشر02-671-6
    Objet30 3D-PrinterStratasys --------------تستخدم لتصنيع قوالب الآبار الصغيرة الهرمية.
    قالب البئر الهرمي المطبوع ثلاثي الأبعادحسب الطلب--------------اتصل بمجموعتنا البحثية إذا كنت مهتما. الأبعاد والمخططات الواردة في المخطوطة.
    Polydimethylsiloxane (PDMS) وعامل المعالجةFisherNC9285739يأتي كمجموعة مع المطاط الصناعي وعامل المعالجة. استخدمه داخل غطاء الدخان الكيميائي.
    قمعفيشر10-348C
    1 مل لمبة ماصةسيجماZ509035
    ملعقة صغيرةفيشرS50821
    لوحة ثقافة 12 بئرEMESCO1194-353043
    فرنفيشر11-475-154
    حاضنةفيشر13 998 076
    AAV1. Syn.GCaMP6f.WPRE.SV40UPenn Vector Core36373يخزن في -80 درجة مئوية الفيروس المرتبط بالغدة (AAV) المتاح تجاريا مع مؤشر الكالسيوم GCaMP6f.
    الفورمالديهايد 40٪فيشرF77P-4الفورمالديهايد هو مركب سام معروف بأنه مسرطن ، ويجب التخلص منه في حاوية منفصلة.
    Triton X-100SigmaT8787خافض للتوتر السطحي غير أيوني يستخدم لاختراق أغشية الخلايا.
    مصل الحصانGibco16050-122
    الفأر المضاد ل Tuj-1 / beta-III التوبولين الأجسام المضادة الأوليةSigmaT8578-200ULStore at -20 & ordm;C.
    الأرانب المضادة للمشبك العصبي 1 أنظمة الأجسام المضادة الأولية106-001تخزين في -20 درجة مئوية.
    الحمار المضاد للفأر 568 الجسم المضاد الثانويInvitrogenA10037يخزن في 4 درجة مئوية.
    الحمار المضاد للأرانب 488 الجسم المضاد الثانويInvitrogenA21206يخزن في 4 درجة مئوية.
    Hoechst 33342 ، TrihydrochlorideInvitrogenH3570Store at 4 ºC.   ؛ Hoechst هو مطفر معروف يجب التعامل معه على أنه مادة مسرطنة. لذلك ، يجب التخلص منها في حاوية منفصلة.
    A1RSI مجهر متحد البؤر للمسح الضوئي بالليزر   ؛نيكون--------------تستخدم لأخذ عمليات إعادة البناء متحد البؤر للتركيبات ذات العلامات المناعية.
    Eclipse Ti-S Microscope نيكون--------------تستخدم لالتقاط صور تباين الطور.  من خلال الحصول على الصور الرقمية باستخدام كاميرا QiClick المتصلة ببرنامج Nikon Elements Basic Research (4.10.01).
    مجهر مضان عالي السرعةنيكون--------------نيكون Eclipse Ti مقترن بكاميرا ANDOR Neo / Zyla لتصوير الكالسيوم.
    NIS Elements AR 4.50.00 SoftwareNikon Instruments--------------تستخدم لتحديد عابرات الكالسيوم من التسجيلات التي تم التقاطها بالمجهر الفلوري عالي السرعة.
    أنظمة القاعدي الشمس سلالة

    References

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
    1. Struzyna, L. A., Harris, J. P., Katiyar, K. S., Chen, H. I., Cullen, D. K. Restoring nervous system structure and function using tissue engineered living scaffolds. Neural Regen. Res. 10 (5), 679-685 (2015).
    2. Tallantyre, E. C., Bø, L., et al.

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Reprints and Permissions

    Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

    Request Permission

    Tags

    Micro TENNsNeural Network ReconstructionAxonal Tract EngineeringHydrogel Micro ColumnsNeuronal AggregatesBrain Connectome ModelingAxonal Pathway RepairCell MigrationSynaptic ImmunolabelingThree Dimensional Neural Networks

    Related Articles