مقالة منهجية

مستوحاة تشريحيا ثلاثي الأبعاد الأنسجة الدقيقة المهندسة الشبكات العصبية لإعادة الإعمار الجهاز العصبي، والتحوير، والنمذجة

12.9K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/55609

⸱

مايو 31, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, School of Engineering and Applied Science, University of Pennsylvania, 2Center for Brain Injury & Repair, Department of Neurosurgery, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 3Center for Neurotrauma, Neurodegeneration & Restoration, Michael J. Crescenz Veterans Affairs Medical Center, 4School of Biomedical Engineering, Drexel University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

هذه المخطوطة تفاصيل تلفيق الشبكات العصبية الأنسجة الدقيقة المهندسة: بناء ثلاثي الأبعاد ميكرون الحجم تتألف من المسالك المحورية محاذاة طويلة تمتد سكان الخلايا العصبية المجمعة المغطاة في هيدروجيل أنبوبي. هذه السقالات الحية يمكن أن تكون بمثابة التبديلات وظيفية لإعادة بناء أو تعديل الدوائر العصبية أو كما بيوفيديك اختبار الأسرة تحاكي الرمادي الأبيض المادة العصبية.

الملخص

نادرا ما يحدث الانتعاش وظيفية بعد الإصابة أو انحطاط الناجم عن المرض داخل الجهاز العصبي المركزي (نس) بسبب البيئة المثبطة والقدرة المحدودة على تكوين الخلايا العصبية. نحن نعمل على تطوير استراتيجية لمعالجة في وقت واحد الخلايا العصبية والمحور فقدان المسار داخل الجهاز العصبي المركزي التالفة. تقدم هذه المخطوطة بروتوكول تصنيع الشبكات العصبية المهندسة الأنسجة الدقيقة (تينس-ميكرو)، والبنى زرع تتكون من الخلايا العصبية ومسارات محور عصبي الانحياز التي تمتد تجويف المصفوفة خارج الخلية (إسم) من هيدروجيل اسطوانة بريفورميد المئات من ميكرون في القطر التي قد تمتد سنتيمتر في الطول. يتم تحديد المجاميع العصبية إلى أقصى حد من التضمين ثلاثي الأبعاد وتمتد من إسقاطات محور عصبي. يتم وضع تينس الصغرى كاستراتيجية لإعادة الإعمار الجهاز العصبي المركزي، محاكاة جوانب الهندسة المعمارية الدماغ كونيكوم ويحتمل توفير وسائل لاستبدال الشبكة. نيوقد تتشابك مجاميع رونال مع أنسجة المضيف لتشكيل مرحلات وظيفية جديدة لاستعادة و / أو تعديل الدوائر المفقودة أو التالفة. ويمكن أن تكون هذه البنى أيضا بمثابة الموالية للتجدد "السقالات الحية" قادرة على استغلال الآليات التنموية للهجرة الخلية والمحاور المساري، وتوفير التآزر الهيكلي والذوبان الإشارات استنادا إلى حالة التجديد. يتم تصنيعها تينس الصغرى عن طريق صب هيدروجيل السائل في قالب أسطواني يحتوي على إبرة تركز طوليا. مرة واحدة وقد تلمح هيدروجيل، تتم إزالة الإبرة، وترك عمود الصغير جوفاء. يتم إضافة حل إسم إلى التجويف لتوفير بيئة مناسبة لالتصاق العصبية ونمو محور عصبي. يتم تجميع الخلايا العصبية متفرقة ميكانيكيا للبذر الدقيق داخل واحد أو طرفي العمود الصغير. هذه المنهجية تنتج موثوقة بنيات مصغرة مكتفية ذاتيا مع المسارات محور عصبي طويلة الإسقاط التي قد تلخص ملامح الدماغ العصبي. سينابتيك إمونولابيلينغ ومؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا تشير إلى أن تينس الصغرى تمتلك توزيع متشابك واسعة النطاق والنشاط الكهربائي الجوهري. وبالتالي، تينس الصغرى تمثل استراتيجية واعدة لإعادة بناء الأعصاب المستهدفة من مسارات الدماغ، ويمكن أيضا أن تطبق كنماذج بيوفيديك لدراسة الظواهر العصبية الحيوية في المختبر .

المقدمة

وهناك سمة مشتركة من اضطرابات وأمراض الجهاز العصبي المركزي، مثل إصابات الدماغ الصدمة (تبي)، إصابة الحبل الشوكي (سسي) والسكتة الدماغية ومرض الزهايمر، ومرض باركنسون، هو انقطاع مسارات محور عصبي والخلايا العصبية الخسارة 1 ، 2 ، 3 ، 4 ، 5 ، 6 . على سبيل المثال، عندما يذهب السكتة الدماغية دون علاج، ويقدر أن محاور يتم فقدان بمعدل 7 أميال من المحاور في الدقيقة 5 . في حالة تبي، والتي ما يقرب من 1.7 مليون شخص تجربة كل عام في الولايات المتحدة وحدها، قد تستمر انحطاط محور عصبي تحدث بعد سنوات من الصدمة، كما يعجل الإصابة الأولية على المدى الطويل الدولة الاعصاب 4 . ومما يزيد من حدة هذه الآثار الضارة أن الجهاز العصبي المركزي لديه كابا محدود للغايةمدينة للتجديد 1 ، 7 ، 8 ، 9 . بعد الإصابة، وتطور البيئة المثبطة التي تتميز بعدم توجيه توجيهات إلى أهداف بعيدة، وجود مثبطات المايلين المرتبطة التي تعيق نمو العصبية، وتشكيل ندبة الدبقية من قبل الخلايا النجمية رد الفعل 8 ، 10 ، 11 ، 12 . الندبة الدبقية بمثابة الحاجز البيوكيميائية والفيزيائية لتجديد، مع جزيئات مثل بروتيوغليكان كبريتات شوندروتن عرقلة نمو محور عصبي 8 ، 11 . وعلاوة على ذلك، على الرغم من أن الخلايا الجذعية العصبية تم العثور عليها في الجهاز العصبي المركزي الكبار، وإنتاج الخلايا العصبية الجديدة محدودة، ودليل ثابت على تكوين الخلايا العصبية لم يتم العثور عليها إلا في لمبة الشم، والحصينالمنطقة تحت الحبيبية، ومنطقة المحيطة بالبطين، والقناة المركزية للحبل الشوكي 13 ، 14 . هذه العقبات تمنع الانتعاش وظيفية من الخلايا العصبية المفقودة والهندسة المعمارية المادة البيضاء بعد الإصابة أو المرض، مما أدى إلى تغير الحياة في كثير من الأحيان وطويلة الأمد لهذه الظروف.

على الرغم من عدم وجود القدرة التجدد في الجهاز العصبي المركزي الكبار، وقد ثبت أن تجديد محور عصبي ممكن إذا تم تقديم الإشارات البيئية الكافية لاستضافة الخلايا العصبية 15 ، 16 ، 17 ، 18 . وقد حاول الباحثون تقديم ومعالجة عوامل النمو (على سبيل المثال، عامل نمو الأعصاب ، عامل نمو البشرة، عامل النمو المعتمد على الدبقية، والعامل العصبي -3) وغيرها من جزيئات التوجيه لتحفيز اللدونة وتجديد المحوار 14 ،/ سوب> 18 ، 19 . على الرغم من أن هذه الدراسات أكدت أن محاور الكبار قادرة على الاستجابة لعوامل النمو، وهذه الاستراتيجيات محدودة بسبب نفاذية منخفضة من حاجز الدم في الدماغ والتدرجات المكانية والزمانية المحددة المطلوبة لتعزيز التجدد 14 ، 18 ، 19 . وقد اعتمدت نهج أخرى على فرط تنشيط عوامل النسخ ذات الصلة التجدد في الخلايا العصبية الجهاز العصبي المركزي. على سبيل المثال، أوفيركسريسيون من عامل النسخ ST3 حفز تجديد محور عصبي في العصب البصري 20 . ومع ذلك، كلا تسليم جزيء حيوي و أوفيركسريسيون من عوامل النسخ تفشل في استبدال السكان العصبية المفقودة. وقد تركزت الاستراتيجيات القائمة على الخلية أساسا على زرع الخلايا الجذعية العصبية (نسس) في الجهاز العصبي المركزي، والاستفادة من قدرتها على استبدال الخلايا العصبية الجهاز العصبي المركزي، والإفراج عن العوامل الغذائية،ودعم محاولات العصبية التي تحدث بعد الإصابة 17 . على الرغم من هذا، لا تزال هناك تحديات ملحة تعوق هذا النهج، بما في ذلك القدرة المعوقة للخلايا العصبية المزروعة من أجل البقاء، والاندماج مع المضيف، وتظل مقيدة مكانيا إلى المنطقة المصابة 6 ، 14 ، 17 ، 21 . وبالإضافة إلى ذلك، تسليم الخلية وحدها غير قادرة على إعادة الهندسة المعمارية الخلوية من مسارات محور عصبي التالفة أو المفقودة. وهناك نهج بديل يعالج المشاكل التي تواجه استراتيجيات تسليم الخلايا والمخدرات / الكيميائية هو الجمع بين هذه النهج مع استخدام المواد الحيوية 14 ، 22 ، 23 . المواد الحيوية مثل الهلاميات المائية هي قادرة على محاكاة الخصائص البيوكيميائية والفيزيائية للمصفوفة خارج الخلية (إسم)، والمساعدة في تسليم الخليةد داخل المنطقة المصابة، وتسليم عوامل النمو وغيرها من الجزيئات النشطة بيولوجيا مع الافراج عن السيطرة 22 . وقد أدت الخصائص الجذابة لهذه الاستراتيجيات القائمة على المواد الحيوية في أدلة على الجسم الحي تجديد محور عصبي بعد زرع السقالات إلى منطقة ليسيونيد 24 ، 25 ، 26 ، 27 ، 28 ، 29 ، 30 . ومع ذلك، واستراتيجيات المواد الحيوية الخلوية لا تحل محل السكان العصبية المفقودة. عندما تستخدم كوسيلة تسليم الخلايا العصبية، الدبقية، أو الخلايا العصبية السلائف، والمواد الحيوية غير قادرة على إعادة تشكيل شبكات محور عصبي لمسافات طويلة. التحدي المتمثل في تطوير النهج الذي يعالج كل من محور عصبي انحطاط المسار وفقدان الخلايا العصبية المرتبطة إصابة الجهاز العصبي المركزي والمرض لا يزال <سوب كلاس = "كريف"> 31.

وقد ذكرت مجموعة أبحاثنا في وقت سابق تطوير الشبكات العصبية زرع الأنسجة العصبية زرع (تينس الصغرى)، والتي هي نوع من "سقالة المعيشة" تتكون من الهيئات خلية الخلايا العصبية تقتصر على واحد أو طرفي أغاروس هيدروجيل-إسم الصغرى العمود ، مع محاذاة محاور عصبية تمتد في جميع أنحاء المناطق الداخلية من هذا ثلاثي الأبعاد (3D) التشفير 1 ، 10 ، 31 ، 32 . واحدة من الاختلافات الرئيسية بين هذه التقنية والنهج السابقة هو أن الهندسة المعمارية الخلوية من تينس الصغرى يتم إنشاؤها تماما في المختبر وزرع بعد ذلك 33 ، 34 ، 35 ، 36 ، 37 ، 38 ، <سوب كلاس = "كريف"> 39 ، 40 ، 41 . في التصنيع المختبر يوفر السيطرة المكانية والزمانية واسعة من النمط الظاهري الخلوي والتوجه، والخصائص الميكانيكية / الفيزيائية، والإشارات البيوكيميائية، والعوامل الخارجية، والذي يفيد دمج هذه السقالات مع المضيف بعد زرع 41 ، 42 . الصغرى تينس مستوحاة تشريحيا لأنها تحاكي الدماغ العصبي، وعرض المسالك محور عصبي مماثلة لتلك التي تجسر مناطق وظيفية متميزة من الدماغ ( الشكل 1A ) 1 . لذلك، قد تكون هذه الاستراتيجية قادرة على استبدال جسديا مساحات المادة البيضاء المفقودة والخلايا العصبية بعد زرع في منطقة ليسيونيد. هذا الأسلوب هو أيضا مستوحاة من الآليات التنموية التي "السقالات الحية الطبيعية" التي شكلتها الخلايا الدبقية شعاعي والمحاور عصبية رائدة بمثابة أدلة دالة للخليةوالهجرة من المنطقة تحت البطينية ونمو محور عصبي، على التوالي 43 . يتم تلخيص هذه الآليات في محاور محور عصبي الانحياز من تينس الصغرى، والتي يمكن أن تقدم مسارات حية للهجرة الخلايا العصبية وتجديد محور عصبي من قبل محور عصبي بوساطة محور عصبي ( الشكل 1C ) 43 . وعلاوة على ذلك، هذه الاستراتيجية تستفيد من التكامل متشابك بين الخلايا العصبية تين الصغرى والدوائر الأصلية، وتشكيل التبديلات الجديدة التي قد تسهم في الانتعاش وظيفية ( الشكل 1B ) 43 . القدرة على تشكيل المشبك قد تمنح أيضا هذا النهج القدرة على تعديل الجهاز العصبي المركزي والرد على الأنسجة المضيف وفقا لتغذية مرتدة الشبكة. على سبيل المثال، يمكن تحفيز الخلايا العصبية النشطة أوبتوجينيتيكالي في السقالات الحية لتعديل الخلايا العصبية المضيف من خلال التفاعلات متشابك ( الشكل 1D ).

وبالإضافة إلى ذلك، فإن كونستر أنبوبي القائم على المواد البيولوجيةأوكتيون من تينس الصغرى يوفر بيئة كافية لالتصاق الخلايا، والنمو، وتمديد نيوريت، والإشارات، في حين أن أبعاد مصغرة من يبني يمكن أن تسمح غرس زرع الحد الأدنى، وتوفير المكروية جزئيا عزلها للاندماج التدريجي في الدماغ. في الواقع، وقد أظهرت المنشورات الأخيرة إمكانات تينس الصغرى لمحاكاة المسارات العصبية بعد زرع في الدماغ الفئران. وبعد حقن مكروي التجسيمي، ذكرنا سابقا أدلة على البقاء على قيد الحياة الصغرى تين الخلايا العصبية، وصيانة الهندسة المعمارية محور عصبي، وتوسيع العصبية في القشرة المضيف إلى 1 شهر على الأقل في الجسم الحي 10 ، 31 . وعلاوة على ذلك، وضع العلامات مع سينابسين قدمت أدلة نسيجية من التكامل متشابك مع الأنسجة الأصلية 10 ، 31 . وعموما، يمكن أن تكون شبكات تينس الصغرى مناسبة بشكل فريد لإعادة بناء وتعديل التالفنس عن طريق استبدال الخلايا العصبية المفقودة، ودمج متشابك مع الدوائر المضيف، واستعادة المفقودة الهندسة المعمارية المحاور المفقودة، وفي بعض الحالات، وتوفير محاور عصبية تجديد مع العظة المسارات المناسبة.

figure-introduction-1
الشكل 1: المبادئ والإلهام وراء تطوير شبكات العصبية الأنسجة الدقيقة المهندسة (تينس الصغرى). ( A ) الصغرى تينس تقليد الهندسة المعمارية الخلوية من الدماغ كونكتوم (الأرجواني)، التي ترتبط مناطق متميزة وظيفيا من قبل طويلة محاذاة محاور عصبية في اتجاه أحادي الاتجاه (الأحمر والأخضر) أو ثنائية الاتجاه (الأزرق). على سبيل المثال، يمكن لشبكات تين الصغرى إعادة تكوين الوصلات المفقودة في المسالك القشرية والنيغروستريتية أو في المسار الثاقب من القشرة المخية إلى الحصين (مقتبس من ستروزينا وآخرون ، 2015) 1 . ( B ) رسم تخطيطي ل أونيديركتيونال و ثنائية الاتجاه الصغرى تين (الأحمر والأزرق، على التوالي) دمج متشابك مع الدوائر المضيف (الأرجواني) لتكون بمثابة تتابع وظيفي بين طرفي الآفة. ( C ) تخطيطي من المسالك المحورية من أحادي الاتجاه تين الصغرى (الأخضر) بمثابة دليل لتجديد يسرع محوار عصبي محاور (الأرجواني) نحو الهدف الذي تتفاعل الصغرى تين. ( D ) الرسم التخطيطي المفاهيمي لاستخدام تينس-أوبتوجينيتيكالي الصغرى تينس كما نيورومودولاتورس، والاستفادة من التكامل متشابك مع الخلايا العصبية استثارة أو مثبطة (القاع). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المخطوطة الحالية تفاصيل المنهجية المستخدمة في تلفيق الصغرى تينس باستخدام الخلايا العصبية القشرية الدماغية المستمدة من الجنين. ومن الجدير بالذكر أن تينس الصغرى يمكن أن تكون ملفقة مع أنواع أخرى من الخلايا العصبية. على سبيل المثالوافرة، وتقارير أولية ناجحة التنمية الدقيقة الصغرى ظهرت الظهري العقدة الجذرية العقدة (درغ) الخلايا العصبية 32 . يمكن توليد الأعمدة الصغيرة هيدروجيل ( الشكل 2A ) عن طريق إضافة الاغاروز السائل إلى صفيف قناة أسطواني مصنوع حسب الطلب، أو أنابيب الشعرية، على حد سواء تحتوي على محاذاة إبر الوخز بالإبر. الإبرة تشكل التجويف ويحدد القطر الداخلي (إد) من العمود الصغير، في حين أن معرف أنبوب الشعرية وقطر الاسطوانات في جهاز قطع الليزر تملي القطر الخارجي (أود) من يبني. يمكن اختيار أود و إد وفقا للتطبيق المطلوب عن طريق اختيار أقطار مختلفة للجهاز / أنابيب الشعرية وإبر الوخز بالإبر، على التوالي. ويمكن أيضا أن يتغير طول الأعمدة الصغيرة. حتى الآن، أبلغنا عن بناء الصغرى تينس تصل إلى 20 ملم في الطول 10 وتسعى بنشاط حتى أطوال أطول. بعد المواد الهلامية الاغاروز والوخز بالإبر نتتم إزالة إيدلز، يتم إضافة حل إسم تتألف عموما من نوع I الكولاجين و لامينين إلى التجويف من يبني ( الشكل 2C ). يوفر جوهر إسم سقالة لدعم التصاق الخلايا العصبية ونمو محور عصبي. في البداية، كانت الخلايا العصبية القشرية الفئران الأولية مطلي في الأعمدة الصغيرة باستخدام تعليق خلية فصل 10 ، 31 ، 32 . ومع ذلك، فإن هذا النهج لم تنتج الهندسة المعمارية المستهدفة في جميع الحالات، والتي تم تعريفها على أنها الهيئات الخلية العصبية يقتصر على نهايات الأعمدة الصغيرة، مع التجويف المركزي تتألف من محض محاذاة محاور العصبية. ومنذ ذلك الحين، وقد مكن استخدام طريقة التجميع العصبي القسري (على أساس البروتوكولات تكييفها من أونغرين وآخرون ) تصنيع أكثر موثوقية ومتسقة من تينس الصغرى مع هيكل مثالي ( الشكل 2B ) 44 . بالإضافة إلى وصف التيارالمنهجية، هذه المادة سوف تظهر ممثل على النقيض من المرحلة والصور متحد البؤر من تينس الصغرى التي تثبت تشكيل المسالك محور عصبي مع مرور الوقت، فضلا عن الهدف النهائي الهندسة المعمارية. وهذه المخطوطة توسيع أيضا على الجوانب الجديرة بالملاحظة من البروتوكول والتحديات المتبقية والاتجاهات المستقبلية للتكنولوجيا تين الصغرى.

figure-introduction-2
الشكل 2: الرسم التخطيطي لعملية التصنيع الصغرى تين ثلاث مراحل. ( أ ) تطوير هيدروجيل الاغاروز: (1) في البداية، يتم إدخال إبرة الوخز بالإبر الصغيرة (على سبيل المثال ، 180-350 ميكرون في القطر) في القنوات اسطوانية من صنع خصيصا، وقص الليزر قطع أو أنبوب شعري (على سبيل المثال ، 380-700 ميكرون في القطر). في الخطوة التالية، يتم عرض الاغاروز السائل في دبس في القنوات اسطوانية أو أنابيب الشعرية. (إي) بعد المواد الهلامية الاغاروز، تتم إزالة الإبرة ويتم تفكيك القالب لانتاج أجاروس الأعمدة الصغيرة جوفاء. (3) يتم بعد ذلك تعقيم هذه البنايات وتخزينها في دبس. ( ب ) ثقافة الخلايا العصبية الأولية وطريقة التجميع: (1) يتم تنفيذ تجميع الخلايا العصبية في صفيف هرمي الصغرى جيدا، يلقي من قوالب 3D المطبوعة، التي تناسب في آبار لوحة الثقافة 12 جيدا. (2) تشمل الشبكات الصغرى تينس الخلايا العصبية الفئران الأولية فصلها عن أدمغة الجنين من الجنينية-يوم 18 الجرذان. بعد تفكك الأنسجة مع التربسين إدتا ودناز الأول، يتم إعداد محلول خلية مع كثافة 1.0-2.0 × 10 6 خلية / مل. (إي) يتم نقل 12 ميكرولتر من هذا الحل إلى كل بئر في مجموعة هرم الصغيرة أيضا. يتم طرد لوحة تحتوي على هذه الآبار الصغيرة لإنتاج المجاميع الخلية. (4) ثم يتم احتضان هذه بين عشية وضحاها قبل الطلاء في الأعمدة الصغيرة. ( C ) إسم تلفيق الأساسية والبذر الخلية: (ط) قبل زرع الخلايا، والحل إسم تحتوي على 1 ملغ / مل نوع الأول الكولاجين و 1 ملغ / مليتم نقل لامينين إلى المناطق الداخلية من تينس الصغرى ويسمح للبلمرة. (2) اعتمادا على ما إذا كان يتم تصنيع تينس أحادي الاتجاه أو ثنائي الاتجاه تينس، يتم وضع مجمع في واحد أو كليهما من العمود الصغير، على التوالي. (3) بعد فترة من الحضانة لتعزيز الالتصاق، يتم زراعة تينس الصغرى في أطباق بتري غمرت مع المستمدة الجنينية المتوسطة القاعدية العصبية. (4) بعد 3-5 أيام في الثقافة، وينبغي أن الهيكل النهائي تين الدقيقة تظهر مجاميع الخلايا في أقصى النقيض من العمود الصغير، مع مساحات محور عصبي تمتد طوله. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة على جميع الإجراءات التي تنطوي على الحيوانات من قبل اللجان المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام في جامعة بنسلفانيا والمركز الطبي مايكل مايكل كريزينز شؤون المحاربين القدماء والتزمت المبادئ التوجيهية المنصوص عليها في المعاهد الوطنية للصحة سياسة خدمة الصحة العامة على الرعاية الإنسانية واستخدام المختبر الحيوانات (2015).

1. تطوير أغاروس هيدروجيل (مكون أسيلولار من الصغرى تينس)

  1. أغاروس حل إعداد
    1. داخل الخزانة السلامة الأحيائية، وإعداد الخزانات للأعمدة الصغيرة عن طريق نقل 20 مل من المالحة الفوسفات مخزنة المالحة (دبس) إلى كل من اثنين من 10 سم أطباق بتري. تعقيم ملقط غرامة و ميكروسكالبلز مع حبة الساخن معقم.
    2. تزن 3 غرام من الاغاروز ونقله إلى كوب معقمة داخل مجلس الوزراء السلامة الأحيائية. إضافة 100 مل من دبس للتركيز النهائي من 3٪ الوزن / حجم (ث / ت). وتشمل شريط مغناطيسي نظيفة وتغطي الكأس مع ألوميالأسطوانات.
    3. مع لوحة ساخنة / النمام، ودافئ الكأس في 100 درجة مئوية ويقلب في 120-200 دورة في الدقيقة لتذوب تماما الاغاروز (الحل سوف تتحول من غائم لمسح). الحفاظ على التدفئة واثارة بعد ذلك لمنع الجليلة وتغيير درجة حرارة التدفئة حسب الضرورة لتجنب حرق الاغاروز.
      ملاحظة: تلفيق مع كل من جهاز قطع الليزر والأنابيب الشعرية ويرد أدناه في الأقسام الفرعية 1.2 و 1.3، على التوالي. انتقل إلى القسم الفرعي 1.4 بعد الانتهاء من الخطوات الموصوفة في أي من القسم الفرعي. لكل من أساليب تصنيع العمود الصغير، إضافة الاغاروز السائل بسرعة، كما الاغاروز يتصاعد بسرعة كما يبرد. عند التعقيم مع الأوتوكلاف في أي من الخطوات التالية، استخدام الشروط القياسية المطبقة على الأواني الزجاجية.
  2. إعداد العمود الصغير باستخدام جهاز قطع الليزر
    ملاحظة: يتم قطع جهاز قطع الليزر من الاكريليك الشفاف باستخدام قطع ليزر ثاني أكسيد الكربون التجاري. الفبريكاتيون من الهياكل والأجهزة من خلال القطع بالليزر هو موثقة جيدا لمجموعة من التطبيقات الهندسية والبحثية 45 ، 46 ، 47 . يتكون هذا القالب ( الشكل 3 ) من مجموعة من خمس قنوات أسطوانية، كل منها يبلغ قطرها 398 ميكرون وطول 6.35 ملم. تتشكل هذه الصفائح الاسطوانية على طولها بقطعتين: نصف قاع (طول: 25.4 مم، عرض: 6.35 مم، ارتفاع: 6.0 مم) ونصف علوي (طول: 31.5 مم، عرض: 6.35 مم، ارتفاع: 12.7 مم )، كما هو مبين في الشكلين 3A و 3 B، على التوالي. يمكن تثبيت نصفين معا من قبعات الأمامية والخلفية التي لوحظت في الشكل 3C (طول: 31.5 ملم، العرض: 6.35 مم، ارتفاع: 12.7 ملم)، والتي تتميز أربعة ثقوب المحاذاة التي تتزامن مع اثنين من الثقوب كل على أعلى وأسفل القطع التي تساعد على تأمين جميع الأجزاء معا عندما ثمل. هذه القبعات أيضا إنكودفع خمسة ثقوب، متحدة المركز إلى القنوات أسطواني، والتي يمكن إدراجها إبر الوخز بالإبر لتشكيل التجويف من الأعمدة الصغيرة.
    1. تعقيم الجهاز هو مبين في الشكل (3) من خلال تغطية ذلك مع رقائق الألومنيوم والتعقيم. تجميع الجهاز كما هو مبين في الشكل 3D من خلال محاذاة الأمامي والأقواس الخلفية مع فقط الجزء السفلي من قطعة وتأمين الأجزاء الثلاثة مع اثنين # 4-40 مسامير والمكسرات (قطر الخيط: 3.05 مم) في الثقوب محاذاة أسفل.
    2. إدخال بالكامل إبرة الوخز بالإبر (القطر: 180 ميكرون، طول: 30 ملم) في ثقوب إبرة على إما الأمامي أو الخلفي غطاء للجهاز ( الشكل 3D ). مع ميكروبيبيت، صب ما يكفي الاغاروز السائل (~ 1 مل للقنوات الخمس) على قطعة نصف القاع لملء كامل كل من نصفين أسطواني القناة.
    3. وضع على الفور الجزء العلوي من نصف الجهاز على النصف السفلي وتطبيق الضغط حتى يتم بقوة فيمكان لإكمال القنوات اسطوانية (الاحتكاك بين القبعات والجزء العلوي سوف تبقى الأخيرة في مكان). انتظر ~ 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة بعد الاغاروز بالإضافة إلى السماح لها الهلام داخل قنوات الجهاز.
    4. يدويا استخراج الإبرة من كل من الثقوب على قبعات من الجهاز. إزالة مسامير وفصل يدويا اثنين من قبعات والنصف العلوي من قطعة نصف القاع، حيث أن هذا الأخير سيتم عقد هيدروجيل الأعمدة الصغيرة.
    5. استخدام ملقط غرامة لإزالة بلطف الأعمدة الصغيرة من القنوات على قطعة نصف القاع ووضعها في طبق بتري أعدت مسبقا تحتوي على دبس (الخطوة 1.1.1). ريوتيليز الجهاز لجولة أخرى من تصنيع الصغرى العمود. انتقل إلى القسم الفرعي 1.4.
  3. تصنيع العمود الصغير باستخدام أنابيب الشعرية
    1. نقل أنابيب زجاجية الشعرية (القطر: 398.78 ميكرون، طول: 32 مم) إلى داخل مجلس الوزراء السلامة الأحيائية. كسر يدوياأنابيب طويلة في شظايا 2.0-2.5 سم وإدراج كامل إبرة الوخز بالإبر واحدة (القطر: 180 ميكرون، طول: 30 مم) في كل جزء ( الشكل 2A ).
    2. نقل 1 مل من الاغاروز السائل من الكأس إلى سطح طبق بتري فارغة. عقد أنبوب الشعرية وإبرة قدم، وضع نهاية واحدة من الأنبوب في اتصال مع تجمع الاغاروز السائل لملء ذلك عن طريق العمل الشعري. يهيج أنبوب لتعزيز ارتفاع الشعرية.
      ملاحظة: ملء أنابيب الشعرية مع الاغاروز السائل مرتفعا كما تصاريح العمل الشعري. بعد ذلك، يمكن أن تقطع هذه الأعمدة الصغيرة في بنايات أصغر اعتمادا على طول المطلوب. وعادة ما تستخدم بركة الاغاروز 1 مل ل أنبوب واحد فقط، منذ يبرد الاغاروز والمواد الهلامية بسرعة، ومنع مزيد من العمل الشعري.
    3. عندما يتوقف السائل في الارتفاع، وإزالة أنبوب شعري من حمام السباحة ووضعه أفقيا على سطح طبق بتري. انتظر لمدة 5 دقائق للسماح هلام الاغاروز داخل الأنابيب.
    4. وضع الإبهام والسبابة على جانبي الأنبوب واضغط عليه. استخدام اليد الأخرى لسحب الإبرة بسرعة أثناء استخدام الإبهام والسبابة لمنع العمود الصغير نفسه من انزلاق من الأنبوب. إدراج إبرة 30 قياس في أنبوب شعري لدفع ببطء العمود الصغير إلى طبق يحتوي دبس (الخطوة 1.1.1).
  4. مايكرو العمود التشذيب والتعقيم
    1. نقل دقيق واحد العمود الصغير من دبس إلى طبق فارغ باستخدام الملقط غرامة. إضافة 10 ميكرولتر من دبس إلى الجزء العلوي من العمود الصغير مع ميكروبيبيت لمنع التجفيف. وضع الطبق الأخير تحت مجسام للإرشاد البصري.
      ملاحظة: في جميع أنحاء بروتوكول، الجزئي العمود التجفيف أو الجفاف يشير إلى اقتناء بنية تكوم التي يتم تمييزها بصريا من نموذجي، مظهر رطب من هذه البنيات. الأعمدة الصغيرة المجففة نعلق بقوة على سطح أطباق بتري و جيمكن نقلها بسهولة، في حين أن البنيات المائية تميل إلى الانزلاق عبر السطح بعد التلاعب بها مع ملقط. يظهر صورة على النقيض من المرحلة المجففة تماما العمود الصغير في الشكل 8A .
    2. تقليم العمود الصغير مع ميكروسكالب لتقصيره إلى الطول المطلوب (هنا، 2-5 ملم). نقل قلص الصغرى العمود مع الملقط غرامة إلى طبق دبس بتري أخرى أعدت في الخطوة 1.1.1.
    3. كرر الخطوات 1.4.1 و 1.4.2 لكل ملف صغير العمود.
    4. تعقيم الأعمدة الصغيرة في أطباق بتري التي تحتوي على دبس تحت الأشعة فوق البنفسجية (أوف) ضوء لمدة 1 ساعة. تخزين أطباق بتري في 4 درجات مئوية قبل إسم إضافة والطلاء الخلية.

2. ثقافة الخلايا العصبية الأولية وطريقة التجميع القسري للخلية

  1. إعداد مجموعة هرمية الصغرى جيدا
    ملاحظة: يستخدم هذا القسم قالب ثلاثي الأبعاد مطبوع يتكون من قاعدة أسطوانية (القطر: 2.2 سم، الارتفاع: 7.0 مم) aالثانية تسعة الأهرامات مربع على رأس (طول الجانب: 4.0 مم، زاوية مائلة: 60 درجة)، نظمت في 3 × 3 مجموعة، كما هو مبين في الشكل 3E . عملية التصنيع المضافة باستخدام طابعات 3D المتاحة تجاريا موثقة جيدا. يمكن استخدام برامج التصميم بمساعدة الحاسوب لتصميم القالب. ويمكن بعد ذلك تحويل ملف التصميم الناتج رقميا إلى مسار أداة لطابعة ثلاثية الأبعاد. تحتوي كل طابعة على مواصفات مختلفة، وتختلف إرشادات إعداد الطابعة ثلاثية الأبعاد وتشغيلها وفقا لذلك.
    1. استخدام مثقاب 3/32 "لثقب 16 ثقوب في صفيف 4 × 4 (طول الجانب: 4 سم، وفصل حفرة: 1 سم)، تتمحور في غطاء طبق بتري 10 سم.داخل غطاء الدخان الكيميائية، واستخدام والجزء السفلي من طبق بتري لزن 27 غرام من بوليديميثيلزيلوكسان (بدمس) و 3 غرام من وكيل علاج (لنسبة 01:10 ).إثارة مع ملعقة صغيرة لتوزيع وكيل بالتساوي.
    2. تغطية بدمس / وكيل علاج مع غطاء ثقب. ربط طرف واحد من خرطوم إلى فاكوم من غطاء الدخان وإدخال الطرف الآخر في ساق القمع (قطر الفم: 10 سم، طول الساق: 3 سم، قطر الساق: 1.5 سم).
    3. جعل فتحة مع 3/32 "مثقاب في الجزء العلوي من لمبة ماصة 1 مل وإدراج وتأمين طرف ميكروبيبيت 1000 ميكرولتر في الافتتاح (مع نهاية مدببة صعودا) وضع لمبة وغيض في خرطوم وسحب خرطوم صعودا حتى لمبة الأختام خرطوم في جذع القمع.
    4. وضع القمع على غطاء طبق ثقب وتأمين خرطوم مع دعم قوي متاح. فتح صمام فراغ لمدة 5 دقائق إلى شفط وجلب فقاعات الهواء إلى السطح.
    5. إغلاق صمام، وإزالة قمع، وضرب طبق بيتري ضد سطح غطاء الدخان ~ 3 مرات لانفجار أي فقاعات الهواء المتبقية.
    6. وضع قالب 3D هرمي جيدا جيدا المطبوعة في كل من الآبار في لوحة ثقافة 12 جيدا، مع الأهرامات لافتا. صب بدمس / وكيل علاج على رأس القوالب حتى كل بئر من رهو شغل لوحة. تغطية لوحة 12 جيدا مع غطاء ونقله إلى فرن لمدة 1 ساعة عند 60 درجة مئوية لتجف.
    7. إزالة بعناية كل بدمس مجموعة الصغرى جيدا ( الشكل 3F ) من لوحة مع ملعقة صغيرة. تغطية صفائف بدمس مع رقائق الألومنيوم وتعقيم بواسطة الأوتوكلاف. داخل مجلس الوزراء السلامة الأحيائية، إدراج واحد مصفوفة جيدا جيدا في كل بئر من لوحة 12 جيدا ( الشكل 2B ).
  2. عزل الخلايا العصبية القشرية من الأجنة الفئران
    1. إضافة ~ 20 مل من حل الملح المتوازن هانك (هبس) إلى كل من أربعة إلى ستة أطباق بتري 10 سم (واحد لكل الأنسجة تشريح) داخل مجلس الوزراء السلامة الأحيائية. نقل هذه الأطباق إلى غطاء تشريح ووضعها على الجليد. تعقيم أدوات تشريح، مثل ميكروسكالبيلز، مقص، وملقط، مع حبة الساخن معقم.
    2. قبل الدافئة الخلايا العصبية الجنينية القاعدية المتوسطة + 2٪ الملحق خالية من مصل + 0.4 ملي L- الجلوتامين (المشار إليها باسم "ثقافة المتوسطة" هناr) و 0.25٪ التربسين + 1 ملي إيثيلينديامينتيتراسيتيك حمض (إدتا) عند 37 درجة مئوية. ذوبان الجليد ديوكسيريبونوكلياز (الدناز) أنا عن طريق وضعها في درجة حرارة الغرفة. إعداد 1.5 مل من 0.15 ملغ / مل حل دناز I في هبس والحفاظ على الحل على الجليد.
    3. الموت ببطء في الوقت المناسب الحوامل الجنينية اليوم 18 الفئران عن طريق استنشاق ثاني أكسيد الكربون وتأكيد الموت عن طريق قطع الرأس. نقل الذبيحة إلى غطاء تشريح العقيمة ووضعه بطني الجانب حتى. شطف البطن جيدا مع الايثانول 70٪.
    4. فتح الرحم وإزالة الأجنة (عادة ~ 11) من الكيس الذي يحيط بالجنين مع مقص ونقلها مع ملقط إلى طبق بتري تحتوي على هبس الباردة، كما هو موضح 48 . وضع كتلة المبردة (-20 درجة مئوية) الجرانيت تحت المجسام. وضع طبق بتري على سطح هذه الكتلة الباردة للحفاظ على درجة حرارة منخفضة من هبس في جميع أنحاء إجراء تشريح.
    5. شطف الجراء عن طريق سحق هبس حول ومن ثم نقلها إلى طبق نظيفة المقبلالتي تحتوي على هبس. مع المعونة من المجسام وأدوات تشريح، بالتسلسل إزالة رؤساء، نصفي الكرة المخية، والقشور من الأجنة ونقل كل الأنسجة مع ملقط إلى طبق جديد هبس مليئة بعد كل تشريح 48 .
    6. نضح فقط القشور مع ماصة باستور ووضع الأنسجة في أنبوب الطرد المركزي 15 مل العقيمة. تجاهل الأنسجة الأخرى تشريح. شطف القشور ثلاث مرات عن طريق إضافة بالتسلسل وإزالة ~ 5 مل من هبس مع ماصة المصلية. وضع أنبوب على الجليد عندما لا تكون قيد الاستعمال.
    7. نقل القشور مع ماصة باستور إلى أنبوب 15 مل تحتوي على ما قبل تحسنت التربسين إدتا (4-6 القشور لكل 5 مل من التربسين-إدتا). يهيج يدويا أنبوب مرة واحدة ووضعه في 37 درجة مئوية. عكس أنبوب كل 3 دقائق لمنع الأنسجة من التكتل.
    8. وقف التعرض إلى التربسين بعد ~ 10 دقيقة عن طريق إزالة الأنسجة مع ماصة باستور ونقله إلى نظيفة 15 مل الطرد المركزيالة النفخ. إضافة 0.15 ملغ / مل حل الدناز I (1.5 مل) إلى أنبوب مع ماصة.
    9. استخدام ماصة باستور لتفكيك يدويا كتل الأنسجة ثم دوامة (~ 30 ثانية) حتى يظهر الحل متجانسة وليس هناك أي شظايا الأنسجة المتبقية في السائل. إذا لم يكن من الممكن تجانس الحل تماما، استخراج شظايا غير قابلة للذوبان عن طريق سحبها في غيض من ماصة باستور.
    10. أجهزة الطرد المركزي حل الخلية متجانسة التي تم الحصول عليها في الخطوة 2.2.9 في 200 x ج لمدة 3 دقائق. إزالة طاف مع ماصة باستور، مع الحرص على عدم إزعاج الخلايا مكعبات. إضافة 2 مل من وسط الثقافة مع ماصة المصلية ودوامة ريسوسبيند الخلايا.
    11. عد عدد الخلايا في الحل أعدت في الخطوة 2.2.10 باستخدام عدادة الكريات. والعائد المتوقع هو 3.0-5.0 × 10 6 خلايا / نصف الكرة القشرية. إعداد 1 مل أو أكثر من تعليق الخلية في وسط الثقافة، مع كثافة 1.0-2.0 × 10 6 خلايا / مل.
  3. تشكيل الخلايا العصبية المجاميع
    1. مع ميكروبيبيت، إضافة 12 ميكرولتر من 1.0-2.0 × 10 6 / مل تعليق خلية في كل الصغرى جيدا من مجموعة بدمس (التي وضعت في لوحة في الخطوة 2.1.7).
      ملاحظة: يمكن تعديل تركيز الخلية اعتمادا على معرف العمود الصغير والحجم التجميعي الخلية المطلوبة، كما تركيزات أعلى تسفر المجاميع الكبيرة.
    2. أجهزة الطرد المركزي لوحة في 200 x ج لمدة 5 دقائق لإجبار تجميع الخلايا في الجزء السفلي من الآبار الصغيرة ( الشكل 2B ). إضافة بعناية ~ 2 مل من وسط الثقافة إلى الجزء العلوي من كل مجموعة بدمس لتغطية جميع المصنفة الآبار الصغيرة، مع الحرص على عدم إزعاج الخلايا المجمعة.
    3. إذا لم يتم ترانسدوسد الخلايا مع ناقلات الفيروسية، احتضان لوحة لمدة 12-24 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ كو 2 ثم انتقل إلى القسم 3. إذا كان سيتم ترانزدوسد المجاميع، تخطي الحضانة والانتقال إلى القسم 2.4 .
  4. ترانمع ناقلات فيروسية لمراقبة إشارات الكالسيوم
    ملاحظة: يتم تنفيذ هذه الخطوات لانتشار الخلايا العصبية مع ناقلات الفيروسية التي تحتوي على مؤشر الكالسيوم المشفرة وراثيا (جيسي). تم الحصول على النتائج المبينة في هذه المقالة باستخدام فيروس الغدة المرتبطة تجاريا (آف) (المصلي 1) مع GCaMP6f، جيسي مع حركية سريعة تتكون من البروتين الفلوري الأخضر (غفب)، كالمودولين (كام)، والببتيد M13، مدفوعا الإنسان سينابسين أنا المروج. قد يتطلب حل ناقلات الفيروسية التخفيف في دبس العقيمة قبل تنبيغ، اعتمادا على تركيز محلول المخزون. يجب ملاحظة صحة الخلية / التشكل وقوة إشارة GCaMP6f مع مرور الوقت لمجموعة من تركيزات النواقل. يجب إجراء هذا الإجراء الأمثل من قبل كل محقق لتحديد العيار المناسب لثقافات الخلايا الخاصة بهم. الوقت التعبير GCaMP6f نموذجي هو 7-8 أيام التالية التنبيب الذي يحدث أثناء الحضانة القيام به في سانتإب 2.4.2.
    1. مع ميكروبيبيت، إضافة الحجم المطلوب من حل ناقلات الفيروسية (للتركيز النهائي من ~ 3.0 × 10 9 نسخ الجينومية لكل المجاميع) إلى الوسط الثقافي، وتغطي المجاميع. ببطء ماصة صعودا وهبوطا لضمان أن يتم توزيع حل متجه بشكل متجانس في جميع أنحاء وسط الثقافة.
    2. احتضان لوحة مع المصنفة هرمي الآبار الصغيرة لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ كو 2 للسماح للتنبيغ الفيروسي من GCaMP6f.

3. تطوير المكون الخلوي من تينس الصغرى

  1. إسم تلفيق الأساسية
    1. بعد الحضانة الإجمالية، إضافة نوع الأول الكولاجين و لامينين إلى وسط الثقافة (لتركيز 1 ملغ / مل لكل منهما) في أنبوب ميكروسنتريفوج لإعداد حل إسم. تنفيذ الخطوات 3.1.2-3.1.4 في درجة حرارة الغرفة، ولكن الحفاظ على أنبوب مع إسم على الجليد عندما لا تكون قيد الاستعمال لمنع الجليلة المبكرة.
      ملاحظة: الإنفاق النموذجي هو 4 ميكرولتر من حل إسم لكل العمود الصغير (طول: 5 ملم، إد: 180 ميكرون).
    2. ضبط الرقم الهيدروجيني للحل إسم عن طريق نقل 1-2 ميكرولتر إلى ورقة ليتموس للتحقق من الرقم الهيدروجيني الأولي، مضيفا 1 ميكرولتر من 1 N هيدروكسيد الصوديوم (هيدروكسيد الصوديوم) و / أو 1 N حمض الهيدروكلوريك (هكل) إلى إسم، حسب الحاجة، وتكرار حتى الرقم الهيدروجيني هو 7.2-7.4. ضمان تجانس الحل إسم عن طريق بيبتينغ صعودا وهبوطا مع تجنب تشكيل فقاعات الهواء.
    3. نقل الأعمدة الصغيرة مع ملقط معقم من الأطباق في الخطوة 1.4.3 لتفريغ 35- أو 60 ملم أطباق بتري. العمل على 4-5 الأعمدة الصغيرة في وقت لمنع الجفاف. إرفاق نصيحة 10 ميكرولتر تعلق على نصيحة 1،000 ميكرولتر إلى ميكروبيبيت. باستخدام مجسام للإرشاد البصري، ووضع طرف في نهاية واحدة من الأعمدة الصغيرة والشفط لاستخراج دبس المتبقية والهواء فقاعات من التجويف.
    4. رسم بسرعة 4-5 ميكرولتر من إسم في ميكروبيبيت. مراقبة تحت ستيريوسكوب، ضع غيض من ميكروبيبيت في واحدة من نهايات الأعمدة الصغيرة وتصريف ما يكفي إسم لملء التجويف. تأكيد عدم وجود فقاعات الهواء في التجويف، وهذه قد تمنع نمو محور عصبي من خلال إسم. إذا وجدت فقاعات الهواء، وإزالة إسم، كما هو موضح في الخطوة 3.1.3، وإضافة إسم مرة أخرى.
    5. لمنع الجفاف، إضافة ~ 2 ميكرولتر من إسم حول كل عمود الصغير. احتضان هيدروجيل / إسم الأعمدة الصغيرة في أطباق بتري في 37 درجة مئوية و 5٪ كو 2 لمدة 25 دقيقة. انتقل إلى زرع الخلايا مباشرة بعد الحضانة.
      ملاحظة: ويهدف فترة الحضانة في الخطوة 3.1.5 للسماح الوقت للبلمرة من الكولاجين و لامينين داخل الأعمدة الصغيرة.
  2. الخلايا العصبية البذر في الأعمدة الصغيرة
    ملاحظة: لتغيير وسط الثقافة من المجاميع ترانسدوسد، إمالة لوحة، واستخدام ميكروبيبيت لإزالة المتوسطة التي برك على جدار البئر، ومن ثم إضافة ببطء ~ 1 مل ضدالجدار (لتجنب إزعاج المجاميع في الآبار الصغيرة الهرمية). كرر هذا الوسيط تغيير مرة ثانية.
    1. بعد فترة الحضانة في الخطوة 3.1.5، نقل ما يقرب من 10-20 ميكرولتر من الوسط الثقافي إلى منطقتين مجانا في أطباق بتري عقد الأعمدة الصغيرة. استخدام ميكروبيبيت لنقل فردي المجاميع إلى طبق بتري التي تحتوي على يبني ونقلها مع ملقط إلى واحدة من برك صغيرة من ثقافة المتوسطة للحفاظ على صحة الخلية.
    2. وفي حين تراقب تحت مجسام، تدرج مجاميع في كل طرف من أعمدة الأعمدة الصغرى لشبكات تينس ثنائية الاتجاه ثنائية الاتجاه أو في طرف واحد لهيكل أحادي الاتجاه (حسب الرغبة) باستخدام ملقط. تأكيد وضع المجاميع داخل الأعمدة الصغيرة باستخدام مجسام. استخدام ملقط لنقل المصنف الصغرى الأعمدة إلى بركة صغيرة أخرى من الوسط الثقافي لتجنب الجفاف والحفاظ على الصحة الإجمالية.
    3. احتضان عند 37 درجة مئوية و 5٪ كو 2 لمدة 45 دقيقة إلىإهداء المجاميع للانضمام إلى إسم. تحقق من أن المجاميع تبقى في نهايات الأعمدة الصغيرة باستخدام المجسام. إعادة إدخال المجاميع الخلية وتكرار خطوة الحضانة عند الضرورة.
    4. بعناية الفيضانات أطباق بتري التي تحتوي على تينس الصغرى مع وسط الثقافة (3 أو 6 مل لطبق 35 أو 60 ملم بتري، على التوالي) باستخدام ماصة المصلية. وضع الأطباق في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ كو 2 للثقافة على المدى الطويل.
    5. إجراء تغييرات نصف الوسائط كل يومين مع وسط الثقافة. إزالة بعناية نصف المتوسطة القديمة مع ماصة واستخدام مجسام للإرشاد البصري لتجنب شفط تينس الصغرى. استبدال عن طريق إضافة ببطء الطازجة، المتوسطة قبل تحسنت مع ماصة.
    6. لإعادة صياغة بدمس مصفوفات جيدا جيدا، وإزالة وسط الثقافة، وتغلي صفائف في الماء منزوع الأيونات لمدة 30 دقيقة، وتعقيم في الأوتوكلاف لجولة أخرى من تشكيل الكلي والثقافة.
      ملاحظة: في تيمبوانتس المطلوب، ويمكن التحقق من الهندسة المعمارية من تينس الصغرى باستخدام المجهر المرحلة التباين. هنا، تم استخدام وقت التعرض من 5-8 مللي ثانية و 10 X (0.64 ميكرون / بكسل) و 20 X (0.32 ميكرون / بكسل) الأهداف لالتقاط الصور على النقيض من المرحلة. تم القبض على مضان يرتبط مع تغيرات تركيز الكالسيوم في ترانسدوسد فيروس تينس الصغرى باستخدام المجهر مضان عالية السرعة مع وقت التعرض 50 مللي ثانية، وهدف 10X (0.64 ميكرون / بكسل)، والضوء الحالة الصلبة مع مرشحات ممر الموجة من 480 ~ نانومتر و ~ 510 نانومتر للإثارة والانبعاثات، على التوالي، لتصور إشارة مضان GCaMP6f.

4. إمونوسيتوشيميستري للدراسات في المختبر

ملاحظة: بالنسبة للصور المعروضة هنا، تم استخدام الأجسام المضادة الأولية التالية: الماوس المضادة توج 1 / بيتا - 3 توبولين (1: 500) والأرنب المضادة سينابسين -1 (1: 500) لوضع العلامات للمحاور عصبية وقبل -synaptic بوتونس، على التوالي. وكانت الأجسام المضادة الثانوية حمار المضادة-mouse 568 (1: 500) والحمار ضد الأرنب 488 (1: 500). الأحجام المطلوبة من المحضرات الأولية والثانوية الأجسام المضادة أعدت، فضلا عن حجم الفورمالديهايد، مصل الحصان، ومحاليل المنظفات، تعتمد على حجم المطلوبة لتغطية كليا البنيات. يمكن تقليل هذه المجلدات باستخدام قلم حاجز مسعور للحد من المنطقة المحيطة بكل عمود صغير.

تنبيه: هذا القسم توظف الفورمالديهايد وهويشت. الفورمالديهايد هو مركب سام يعرف أن يكون مسرطنا، و هوشست هو الطفرات المعروفة. ولذلك، يجب التخلص من هذه المركبات في حاوية النفايات المناسبة. دائما التعامل معها في غطاء الدخان الكيميائية أثناء استخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة، مثل معطف المختبر، نظارات السلامة، والقفازات.

  1. إعداد 4.0٪ حجم / حجم (الخامس / الخامس) محلول الفورمالديهايد في 1X الفوسفات مخزنة المالحة (بس) داخل غطاء الدخان الكيميائية.
  2. إزالة الوسط الثقافي من أطباق بيتري كونتينينغ تينس الصغرى مع ميكروبيبيت. إضافة حجم كاف من محلول الفورمالديهايد للأطباق لتغطية تماما تينس الصغرى. نقع تينس الصغرى في محلول الفورمالديهايد لمدة 35 دقيقة في 18-24 درجة مئوية لإصلاح الخلايا داخل الأعمدة الصغيرة.
  3. إزالة محلول الفورمالديهايد 4.0٪ من أطباق بتري مع ماصة وتجاهل المبادئ التوجيهية المناسبة التخلص من المواد الخطرة.
  4. أداء اثنين من الشطف سريع عن طريق إضافة ما يكفي من برنامج تلفزيوني لتغطية تماما تينس الثابتة الثابتة ومن ثم إزالة برنامج تلفزيوني مع ماصة. إجراء شطف طويل الثالث عن طريق تمرغ يبني في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة.
    تنبيه: تجاهل برنامج تلفزيوني يستخدم للشطف كما يحتمل أن تحتوي على آثار الفورمالديهايد.
  5. إعداد حل 0.3٪ الخامس / الخامس من المنظفات غير الأيونية في 4٪ الخامس / الخامس مصل الحصان في برنامج تلفزيوني. إزالة برنامج تلفزيوني من الأطباق بتري التي تحتوي على تينس الصغرى الثابتة وإضافة حجم كاف من محلول المنظفات 0.3٪ لتغطية يبني. نقع لمدة 60 دقيقة في 18-24 و #176؛ C ل بيرمابيليز الخلايا.
  6. إزالة محلول المنظفات مع ماصة. أداء اثنين من الشطفات السريعة عن طريق إضافة وبعد ذلك إزالة برنامج تلفزيوني. بعد ذلك، أداء ثلاثة يشطف أطول من خلال تمرغ يبني في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق خلال كل شطف.
  7. تمييع الأجسام المضادة الأولية في 4٪ مصل الحصان. إزالة برنامج تلفزيوني من الأطباق بتري التي تحتوي على تينس الثابتة و بيرمبيليزد الصغرى. إضافة ما يكفي من حل الأجسام المضادة الأولية للأعمدة الصغيرة لتغطية لهم تماما. ختم الأطباق بتري مع بارافيلم لمنع التبخر واحتضان بين عشية وضحاها (12-16 ح) في 4 درجات مئوية.
  8. إزالة الحل الأجسام المضادة الأولية من الأطباق وشطف كما هو موضح في الخطوة 4.6. في الظلام، وإعداد حل الأجسام المضادة الثانوية في مصل الحصان 4.0٪. إضافة ما يكفي من حل الأجسام المضادة الثانوية لتغطية كامل يبني، وتغطي الأطباق مع رقائق الألومنيوم، واحتضان لمدة 2 ساعة في 18-24 درجة مئوية.
  9. إعداد الحل هوشست (1: 10،000) في برنامج تلفزيوني لصمة عار النوى.
    10. إزالة حل الأجسام المضادة الثانوية واحتضان تينس الصغرى في حل هويشت لمدة 10 دقيقة في 18-24 درجة مئوية. أداء خمس يشطف مع برنامج تلفزيوني، كل لمدة 5-10 دقيقة. الفيضانات طبق بتري مع برنامج تلفزيوني لتغطية الملون الصغرى تينس، التفاف الطبق في رقائق الألومنيوم، وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى يتم تنفيذ التصوير.
    ملاحظة: تم التقاط الصور ل إمونولابيلد الصغرى تينس مع المجهر متحد البؤر الليزر مع قرار من 2048 (~ 8 S / الإطار)، وهدف 10X (0.64 ميكرون / بكسل)، 487 نانومتر الإثارة و ~ 525 نانومتر موجات الانبعاثات ل مضان أخضر، 561 نانومتر الإثارة و ~ 595 نانومتر موجات الانبعاثات ل مضان أحمر، و ~ 3.22 ميكرون / شريحة مع ~ 60 شرائح في المتوسط ​​ل Z- مداخن.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تم رصد تينس الصغرى باستخدام مرحلة المجهر التباين لتقييم سيتوارشيتتيور ونمو محور عصبي ( الشكل 4 ). داخل أحادي الاتجاه، 2 مم طويلة تينس الصغرى، تم تقييد المجاميع العصبية إلى نهاية واحدة من العمود الصغير وتوقع حزمة من المحاور من خلال النواة الداخلية. محاور امتدت طول العمود بأكمله من قبل 5 أيام في المختبر (ديف) ( الشكل 4A ). كان هناك معدل نمو محوري أولي أكبر في ثنائية الاتجاه 2 مم طويلة تينس-تينس، كما محاور ام...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

إصابة الجهاز العصبي المركزي والمرض يؤدي عادة إلى فقدان أو خلل في المسارات محور عصبي لمسافات طويلة التي تتألف من كونكتوم الدماغ، مع أو بدون يصاحبها انحطاط الخلايا العصبية. ويضاعف هذا من قبل قدرة محدودة من الجهاز العصبي المركزي لتعزيز الخلايا العصبية والتجدد. على الرغم من السعي لاستراتيجيات إصلاح مثل عامل النمو، والخلية، وتقديم المواد الحيوية كنهج الفردية أو التوافقي، وهذه التقنيات تفشل في حساب في وقت واحد لكل من انحطاط الخلايا العصبية وفقدان الاتصالات محور عصبي 14،22. هذه الثغرات ف...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

وقدم الدعم المالي من قبل المعاهد الوطنية للصحة U01-NS094340 (كولين)، T32-NS043126 (هاريس)، و F31-NS090746 (كاتيار))، ومؤسسة مايكل J. فوكس (برنامج خط العلاج العلاجي # 9998 (كولين))، والرابطة الوطنية للعلوم (زمالات بحوث الدراسات العليا دج-1321851 (ستروزينا وأديوول))، وإدارة شؤون المحاربين القدامى (ر & D استعراض ميرت # B1097-I (كولين))، والجمعية الأمريكية من الجراحين العصبية وكونجرس الجراحين العصبية (2015-2016 زمالة كودمان في نيوروتراوما والرعاية الحرجة (بتروف))، والبحوث الطبية الجيش الأميركي وقيادة العتاد (# W81XWH-13-207004 (كولين) و W81XWH-15-1- 0466 (كولين)).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
قاطع الليزرالليزر العالميةPLS4.75تستخدم لتصنيع قالب القناة الدقيقة المقطوع بالليزر.
جهاز تصنيع العمود الصغير المقطوع بالليزرحسب الطلب--------------اتصل بمجموعة البحث لدينا إذا كنت مهتما. الأبعاد والمخططات الواردة في المخطوطة.
مسامير----------------------------# 4-40 بقطر خيط 3.05 مم
المكسرات----------------------------# 4-40 بقطر خيط 3.05 مم
إبرة الوخز بالإبر (180 وميكرو ؛ قطر م)لاسا الطبيةsj.16X40قد يختلف القطر وفقا للحجم المطلوب لتجويف العمود الصغير.
طبق بتريفيشر08772B
محلول ملحي مخزن بالفوسفات من دولبيكو (DPBS)Invitrogen14200075
البوليسترين الماصة المصلية التي يمكن التخلص منهافيشر13-678-11D
AgaroseSigmaA9539-50G
أنبوب شعري (398 وميكرو ؛ قطر م)فيشر21170Dقد يختلف القطر وفقا للحجم المطلوب لغلاف العمود الصغير.
لوح ساخنفيشرSP88857200
شريط مغناطيسيفيشر1451352
ماصة دقيقةسيجماZ683884-1EA
إبرة قياس 25 ممفيشر14-826-49
مشرط ميكرو مشرطروبوز جراحيRS-6270
مقصأدوات العلوم الدقيقة14081-09
الملقطالعالمي للأدوات الدقيقة501985
معقم الخرز الساخنSigmaZ378550-1EA
StereoscopeNikonSMZ800Nيستخدم لجميع خطوات التشريح وتصنيع micro-TNN.
ذيل الفئران النوع الأول من الكولاجينCorning354236الحفاظ على 4 & ordm; C وإزالتها فقط عند الحاجة. استخدم الثلج للحفاظ على درجة حرارته عند الاستخدام.
أنبوب الطرد المركزيالدقيق فيشر02-681-256
الماوس لامينينكورنينج354232الحفاظ على 4 & ordm; C وإزالتها فقط عند الحاجة. استخدم الثلج للحفاظ على درجة حرارته عند الاستخدام.
الوسط العصبيInvitrogen21103049الوسط القاعدي لثقافة الخلايا العصبية قبل الولادة والجنينية. تخزين في 4 & ordm; C ودافئ عند 37 & ordm; ج قبل الاستخدام.
هيدروكسيد الصوديوم (هيدروكسيد الصوديوم)فيشرSS2661
حمض الهيدروكلوريك (حمض الهيدروكلوريك) فيشرSA48-1
ورق عبادفيشر09-876-18
محلول الملح المتوازن من هانك (HBSS)Invitrogen14170112يحفظ في درجة حرارة 4 درجة مئوية.
0.25٪ Trypsin-EDTAInvitrogen25200056Store في -20 & ordm; C ودافئ عند 37 & ordm; ج قبل الاستخدام.
ديوكسيربونوكلياز البنكرياس البقري (DNase) ISigma10104159001Store at -20 & ordm; C ودافئ عند 37 & ordm; ج قبل الاستخدام.
مكمل B-27المكمل 12587010 Invitrogenالملحق المضاف إلى الوسط العصبي العصبي لثقافة الخلايا العصبية الحصين والقشرية. يخزن في -20 & ordm; C ودافئ عند 37 & ordm; ج قبل الاستخدام.
L-الجلوتامين Invitrogen35050061Store في -20 & ordm; C ودافئ عند 37 & ordm; ج قبل الاستخدام.
سبراج دولي اليوم الجنيني 18 فأرنهر تشارلز001
ماصة باستورفيشر22-042816
15 مل أنبوب الطرد المركزيEMESCO1194-352099
دوامةفيشر02-215-414
الطرد المركزيفيشر05-413-115
مقياس الدمهيميسيتوير فيشر02-671-6
Objet30 3D-PrinterStratasys --------------تستخدم لتصنيع قوالب الآبار الصغيرة الهرمية.
قالب البئر الهرمي المطبوع ثلاثي الأبعادحسب الطلب--------------اتصل بمجموعتنا البحثية إذا كنت مهتما. الأبعاد والمخططات الواردة في المخطوطة.
Polydimethylsiloxane (PDMS) وعامل المعالجةFisherNC9285739يأتي كمجموعة مع المطاط الصناعي وعامل المعالجة. استخدمه داخل غطاء الدخان الكيميائي.
قمعفيشر10-348C
1 مل لمبة ماصةسيجماZ509035
ملعقة صغيرةفيشرS50821
لوحة ثقافة 12 بئرEMESCO1194-353043
فرنفيشر11-475-154
حاضنةفيشر13 998 076
AAV1. Syn.GCaMP6f.WPRE.SV40UPenn Vector Core36373يخزن في -80 درجة مئوية الفيروس المرتبط بالغدة (AAV) المتاح تجاريا مع مؤشر الكالسيوم GCaMP6f.
الفورمالديهايد 40٪فيشرF77P-4الفورمالديهايد هو مركب سام معروف بأنه مسرطن ، ويجب التخلص منه في حاوية منفصلة.
Triton X-100SigmaT8787خافض للتوتر السطحي غير أيوني يستخدم لاختراق أغشية الخلايا.
مصل الحصانGibco16050-122
الفأر المضاد ل Tuj-1 / beta-III التوبولين الأجسام المضادة الأوليةSigmaT8578-200ULStore at -20 & ordm;C.
الأرانب المضادة للمشبك العصبي 1 أنظمة الأجسام المضادة الأولية106-001تخزين في -20 درجة مئوية.
الحمار المضاد للفأر 568 الجسم المضاد الثانويInvitrogenA10037يخزن في 4 درجة مئوية.
الحمار المضاد للأرانب 488 الجسم المضاد الثانويInvitrogenA21206يخزن في 4 درجة مئوية.
Hoechst 33342 ، TrihydrochlorideInvitrogenH3570Store at 4 ºC.   ؛ Hoechst هو مطفر معروف يجب التعامل معه على أنه مادة مسرطنة. لذلك ، يجب التخلص منها في حاوية منفصلة.
A1RSI مجهر متحد البؤر للمسح الضوئي بالليزر   ؛نيكون--------------تستخدم لأخذ عمليات إعادة البناء متحد البؤر للتركيبات ذات العلامات المناعية.
Eclipse Ti-S Microscope نيكون--------------تستخدم لالتقاط صور تباين الطور.  من خلال الحصول على الصور الرقمية باستخدام كاميرا QiClick المتصلة ببرنامج Nikon Elements Basic Research (4.10.01).
مجهر مضان عالي السرعةنيكون--------------نيكون Eclipse Ti مقترن بكاميرا ANDOR Neo / Zyla لتصوير الكالسيوم.
NIS Elements AR 4.50.00 SoftwareNikon Instruments--------------تستخدم لتحديد عابرات الكالسيوم من التسجيلات التي تم التقاطها بالمجهر الفلوري عالي السرعة.
أنظمة القاعدي الشمس سلالة

المراجع

  1. Struzyna, L. A., Harris, J. P., Katiyar, K. S., Chen, H. I., Cullen, D. K. Restoring nervous system structure and function using tissue engineered living scaffolds. Neural Regen. Res. 10 (5), 679-685 (2015).
  2. Tallantyre, E. C., Bø, L., et al. Clinico-pathological evidence that axonal loss underlies disability in progressive multiple sclerosis. Mult. Scler. 16 (4), 406-411 (2010).
  3. Cheng, H. C., Ulane, C. M., Burke, R. E. Clinical Progression in Parkinson Disease and the Neurobiology of Axons. Ann. Neurol. 67 (6), 715-725 (2010).
  4. Johnson, V. E., Stewart, W., Smith, D. H. Axonal pathology in traumatic brain injury. Exp. Neurol. 246, 35-43 (2013).
  5. Hinman, J. D. The back and forth of axonal injury and repair after stroke. Curr. Opin. Neurol. 27 (6), 615-623 (2014).
  6. Li, X., Katsanevakis, E., Liu, X., Zhang, N., Wen, X. Engineering neural stem cell fates with hydrogel design for central nervous system regeneration. Prog. Polym. Sci. 37 (8), 1105-1129 (2012).
  7. Horner, P. J., Gage, F. H. Regenerating the damaged central nervous system. Nature. 407 (6807), 963-970 (2000).
  8. Yiu, G., He, Z. Glial inhibition of CNS axon regeneration. Nat. Rev. Neurosci. 7 (8), 617-627 (2006).
  9. Montani, L., Petrinovic, M. M. Targeting Axonal Regeneration: The Growth Cone Takes the Lead. J. Neurosci. 34 (13), 4443-4444 (2014).
  10. Struzyna, L. A., Wolf, J. A., et al. Rebuilding Brain Circuitry with Living Micro-Tissue Engineered Neural Networks. Tissue Eng. Part A. 21 (21-22), 2744-2756 (2015).
  11. Huebner, E. a, Strittmatter, S. M. Axon Regeneration in the Peripheral and Central Nervous Systems. Results Probl. Cell Differ. 48, 339-351 (2009).
  12. Benowitz, L. I., Yin, Y. Combinatorial Treatments for Promoting Axon Regeneration in the CNS: Strategies for Overcoming Inhibitory Signals and Activating Neurons' Intrinsic Growth State. Dev. Neurobiol. 67 (9), 1148-1165 (2007).
  13. Lie, D. C., Song, H., Colamarino, S. A., Ming, G., Gage, F. H. Neurogenesis in the Adult Brain: New Strategies for Central Nervous System Diseases. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 44, 399-421 (2004).
  14. Gao, Y., Yang, Z., Li, X. Regeneration strategies after the adult mammalian central nervous system injury-biomaterials. Regen. Biomater. 3 (2), 115-122 (2016).
  15. Benfey, M., Aguayo, A. J. Extensive elongation of axons from rat brain into peripheral nerve grafts. Nature. 296 (11), 150-152 (1982).
  16. David, S., Aguayo, A. J. Axonal Elongation into Peripheral Nervous System "Bridges" after Central Nervous System Injury in Adult Rats. Science. 214 (4523), 931-933 (1981).
  17. Shoichet, M. S., Tate, C. C., Baumann, M. D., LaPlaca, M. C. Strategies for Regeneration and Repair in the Injured Central Nervous System. Indwelling Neural Implant. Strateg. Contend. with Vivo Environ. , at http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK3941/ (2008).
  18. Lu, P., Tuszynski, M. H. Growth factors and combinatorial therapies for CNS regeneration. Exp. Neurol. 209 (2), 313-320 (2008).
  19. Curinga, G., Smith, G. M. Molecular/genetic manipulation of extrinsic axon guidance factors for CNS repair and regeneration. Exp. Neurol. 209 (2), 333-342 (2008).
  20. Mehta, S. T., Luo, X., Park, K. K., Bixby, J. L., Lemmon, V. P. Hyperactivated Stat3 boosts axon regeneration in the CNS. Exp. Neurol. 280, 115-120 (2016).
  21. Elliott Donaghue, I., Tam, R., Sefton, M. V., Shoichet, M. S. Cell and biomolecule delivery for tissue repair and regeneration in the central nervous system. J. Control. Release. 190, 219-227 (2014).
  22. Tam, R. Y., Fuehrmann, T., Mitrousis, N., Shoichet, M. S. Regenerative therapies for central nervous system diseases: a biomaterials approach. Neuropsychopharmacology. 39 (1), 169-188 (2014).
  23. Cullen, D. K., Wolf, J. A., Smith, D. H., Pfister, B. J. Neural Tissue Engineering for Neuroregeneration and Biohybridized Interface Microsystems In vivo (Part 2). Crit. Rev. Biomed. Eng. 39 (3), 243-262 (2011).
  24. Han, Q., Jin, W., et al. The promotion of neural regeneration in an extreme rat spinal cord injury model using a collagen scaffold containing a collagen binding neuroprotective protein and an EGFR neutralizing antibody. Biomaterials. 31 (35), 9212-9220 (2010).
  25. Suzuki, H., Kanchiku, T., et al. Artificial collagen-filament scaffold promotes axon regeneration and long tract reconstruction in a rat model of spinal cord transection. Med. Mol. Morphol. 48 (4), 214-224 (2015).
  26. Silva, N. A., Salgado, A. J., et al. Development and Characterization of a Novel Hybrid Tissue Engineering-Based Scaffold for Spinal Cord Injury Repair. Tissue Eng. Part A. 16 (1), 45-54 (2009).
  27. Moore, M. J., Friedman, J. A., et al. Multiple-channel scaffolds to promote spinal cord axon regeneration. Biomaterials. 27 (3), 419-429 (2006).
  28. Tsai, E. C., Dalton, P. D., Shoichet, M. S., Tator, C. H. Synthetic hydrogel guidance channels facilitate regeneration of adult rat brainstem motor axons after complete spinal cord transection. J. Neurotrauma. 21 (6), 789-804 (2004).
  29. Chen, B. K., Knight, A. M., et al. Axon regeneration through scaffold into distal spinal cord after transection. J. Neurotrauma. 26 (10), 1759-1771 (2009).
  30. Jain, A., Kim, Y. -T., McKeon, R. J., Bellamkonda, R. V. In situ gelling hydrogels for conformal repair of spinal cord defects, and local delivery of BDNF after spinal cord injury. Biomaterials. 27 (3), 497-504 (2006).
  31. Harris, J. P., Struzyna, L. A., Murphy, P. L., Adewole, D. O., Kuo, E., Cullen, D. K. Advanced biomaterial strategies to transplant preformed micro-tissue engineered neural networks into the brain. J. Neural Eng. 13 (1), 16019-16037 (2016).
  32. Cullen, D. K., Tang-Schomer, M. D., et al. Microtissue engineered constructs with living axons for targeted nervous system reconstruction. Tissue Eng. Part A. 18 (21-22), 2280-2289 (2012).
  33. Tate, M. C., Shear, D. A., Hoffman, S. W., Stein, D. G., Archer, D. R., LaPlaca, M. C. Fibronectin promotes survival and migration of primary neural stem cells transplanted into the traumatically injured mouse brain. Cell Transplant. 11 (3), 283-295 (2002).
  34. Denham, M., Parish, C. L., et al. Neurons derived from human embryonic stem cells extend long-distance axonal projections through growth along host white matter tracts after intra-cerebral transplantation. Front. Cell. Neurosci. 6 (11), (2012).
  35. Fawcett, J. W., Barker, R. A., Dunnet, S. B. Dopaminergic neuronal survival and the effects of bFGF in explant, three dimensional and monolayer cultures of embryonic rat ventral mesencephalon. Exp. Brain Res. 106 (2), 275-282 (1995).
  36. Mine, Y., Tatarishvili, J., Oki, K., Monni, E., Kokaia, Z., Lindvall, O. Grafted human neural stem cells enhance several steps of endogenous neurogenesis and improve behavioral recovery after middle cerebral artery occlusion in rats. Neurobiol. Dis. 52, 191-203 (2013).
  37. Ren, H., Chen, J., Wang, Y., Zhang, S., Zhang, B. Intracerebral neural stem cell transplantation improved the auditory of mice with presbycusis. Int. J. Clin. Exp. Pathol. 6 (2), 230-241 (2013).
  38. Sinclair, S. R., Fawcett, J. W., Dunnett, S. B. Dopamine cells in nigral grafts differentiate prior to implantation. Eur. J. Neurosci. 11 (12), 4341-4348 (1999).
  39. Tate, C. C., Shear, D. A., Stein, D. G., Tate, M., LaPlaca, M. C., Archer, D. R. Laminin and fibronectin scaffolds enhance neural stem cell transplantation into the injured brain. J. Tissue Eng. Regen. Med. 3 (3), 208-217 (2009).
  40. Yoo, S. J., Kim, J., Lee, C. -S., Nam, Y. Simple and novel three dimensional neuronal cell culture using a micro mesh scaffold. Exp. Neurobiol. 20 (2), 110-115 (2011).
  41. Chen, H. I., Jgamadze, D., Serruya, M. D., Cullen, D. K., Wolf, J. A., Smith, D. H. Neural Substrate Expansion for the Restoration of Brain Function. Front. Syst. Neurosci. 10, (2016).
  42. Cullen, D. K., Wolf, J. A., Vernekar, V. N., Vukasinovic, J., LaPlaca, M. C. Neural tissue engineering and biohybridized microsystems for neurobiological investigation in vitro (Part 1). Crit. Rev. Biomed. Eng. 39 (3), 201-240 (2011).
  43. Struzyna, L. A., Katiyar, K., Cullen, D. K. Living scaffolds for neuroregeneration. Curr. Opin. Solid State Mater. Sci. 18 (6), 308-318 (2014).
  44. Ungrin, M. D., Joshi, C., Nica, A., Bauwens, C., Zandstra, P. W. Reproducible, ultra high-throughput formation of multicellular organization from single cell suspension-derived human embryonic stem cell aggregates. PLoS One. 3 (2), (2008).
  45. Dahotre, N. B., Harimkar, S. Laser fabrication and machining of materials. , Springer Science & Business Media. (2008).
  46. Kutter, J. P., Klank, H., Snakenborg, D. Microstructure fabrication with a CO2 laser system. J. Micromechanics Microengineering. 14 (2), (2004).
  47. Spicar-Mihalic, P., Houghtaling, J., Fu, E., Yager, P., Liang, T., Toley, B. CO2 laser cutting and ablative etching for the fabrication of paper-based devices. J. Micromechanics Microengineering. 23 (6), (2013).
  48. Pacifici, M., Peruzzi, F. Isolation and culture of rat embryonic neural cells: a quick protocol. J. Vis. Exp. (63), (2012).
  49. Cullen, D. K., Gilroy, M. E., Irons, H. R., Laplaca, M. C. Synapse-to-neuron ratio is inversely related to neuronal density in mature neuronal cultures. Brain Res. 1359, 44-55 (2010).
  50. Huang, J. H., Cullen, D. K., et al. Long-Term Survival and Integration of Transplanted Engineered Nervous Tissue Constructs Promotes Peripheral Nerve Regeneration. Tissue Eng. Part A. 15 (7), 1677-1685 (2009).
  51. Katiyar, K. S., Winter, C. C., Struzyna, L., Harris, J. P., Cullen, D. K. Mechanical elongation of astrocyte processes to create living scaffolds for nervous system regeneration. J. Tissue Eng. Regan. Med. , (2016).
  52. Howard, M. A., Baraban, S. C. Synaptic integration of transplanted interneuron progenitor cells into native cortical networks. J. Neurophysiol. 116 (2), 472-478 (2016).
  53. Wernig, M., Benninger, F., et al. Functional Integration of Embryonic Stem Cell-Derived Neurons In Vivo. J. Neurosci. 24 (22), 5258-5268 (2004).
  54. Ganguly, K., Poo, M. Activity-dependent neural plasticity from bench to bedside. Neuron. 80 (3), 729-741 (2013).
  55. Dancause, N. Extensive Cortical Rewiring after Brain Injury. J. Neurosci. 25 (44), 10167-10179 (2005).
  56. Winter, C. C., Katiyar, K. S., et al. Transplantable living scaffolds comprised of micro-tissue engineered aligned astrocyte networks to facilitate central nervous system regeneration. Acta Biomater. 38, 44-58 (2016).
  57. Adewole, D. O., Serruya, M. D., et al. The Evolution of Neuroprosthetic Interfaces. Crit. Rev. Biomed. Eng. 44 (1-2), 123-152 (2016).
  58. Cullen, D. K., Patel, A., Doorish, J. F., Smith, D. H., Pfister, B. J. Developing a tissue-engineered neural-electrical relay using encapsulated neuronal constructs on conducting polymer fibers. J. Neural Eng. 5 (4), 374-384 (2008).
  59. Cullen, D. K., Stabenfeldt, S. E., Simon, C. M., Tate, C. C., LaPlaca, M. C. In Vitro Neural Injury Model for Optimization of Tissue-Engineered Constructs. J. Neurosci. Res. 85, 3642-3651 (2007).
  60. Irons, H. R., Cullen, D. K., Shapiro, N. P., Lambert, N. A., Lee, R. H., Laplaca, M. C. Three-dimensional neural constructs: a novel platform for neurophysiological investigation. J. Neural Eng. 5 (3), 333-341 (2008).
  61. Morrison, B. I., Cullen, D. K., LaPlaca, M. In Vitro Models for Biomechanical Studies of Neural Tissues. Stud. Mechanobiol. Tissue Eng. Biomater. 3, 247-285 (2011).
  62. Vukasinovic, J., Cullen, D. K., Laplaca, M. C., Glezer, A. A microperfused incubator for tissue mimetic 3D cultures. Biomed. Microdevices. 11 (6), 1155-1165 (2009).
  63. Cullen, D. K., Lessing, M. C., Laplaca, M. C. Collagen-dependent neurite outgrowth and response to dynamic deformation in three-dimensional neuronal cultures. Ann. Biomed. Eng. 35 (5), 835-846 (2007).
  64. LaPlaca, M. C., Vernekar, V. N., Shoemaker, J. T., Cullen, D. K. Three-dimensional neuronal cultures. Methods Bioeng. 3D Tissue Eng. , (2010).
  65. Chwalek, K., Tang-Schomer, M. D., Omenetto, F. G., Kaplan, D. L. In vitro bioengineered model of cortical brain. Nat. Protoc. 10 (9), 1362-1373 (2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Micro TENNs

مقالات ذات صلة