مقالة منهجية

A متعدد حفرة Cryovial يزيل تجميد قطع أثرية عندما منغمسين الأنسجة العضلية مباشرة في النيتروجين السائل

11.3K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/55616

⸱

أبريل 6, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory for Pig Genetic Improvement and Production Technology, Jiangxi Agricultural University

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول إجراء لتجميد الأنسجة العضلية التي تغرق بها مباشرة في النيتروجين السائل. كما يسلط الضوء على هذا البروتوكول cryovial الجديدة التي يمكن أن تجنب "تأثير بطانية" من غاز النيتروجين عندما الاتصالات النيتروجين السائل على سطح الأنسجة من العينة.

الملخص

تواجه دراسات على فسيولوجيا العضلات والهيكل العظمي التحدي الفني للمعالجة بشكل مناسب العينات للحصول على المقاطع مع مقصورات حشوية واضحة للعيان. عقبة أخرى هي بدل ضيق من myofibers إلى الأنسجة المحيطة بها. لأن عملية تثبيت الأنسجة وتضمينها البارافين يؤدي إلى انكماش ألياف العضلات التجميد هو وسيلة مثلى لتصلب الأنسجة العضلية لباجتزاء. ومع ذلك، تحدث مشكلة شيوعا التي تواجهها، وتشكيل بلورات الثلج، أثناء إعداد الأبواب المجمدة بسبب ارتفاع محتوى الماء من العضلات. بروتوكول المعروضة هنا يصف أولا طريقة بسيطة وفعالة لتجميد أنسجة العضلات بشكل صحيح عن طريق غمر لهم في النيتروجين السائل. المشكلة باستخدام النيتروجين السائل وحده هو أنه يؤدي إلى تشكيل حاجز غاز النيتروجين بجانب الأنسجة، الذي يعمل بمثابة عازل ويحول دون تبريد الأنسجة. لتجنب هذا "بطانية البخار" تأثير، وشمال شرقوقد تم تصميم cryovial ث لزيادة سرعة تدفق السائل حول سطح الأنسجة. وقد تحقق ذلك من خلال اللكم ما مجموعه 14 الثقوب مدخل في جدار القارورة. وفقا لديناميات فقاعة، وهو معدل أعلى من النتائج تدفق السائل في فقاعات أصغر وأقل فرص لتشكيل حاجز الغاز. عندما يتدفق النيتروجين السائل في cryovial من خلال الثقوب مدخل، وسرعة تدفق في جميع أنحاء الأنسجة سريعة بما يكفي للقضاء على حاجز الغاز. مقارنة لطريقة تجميد أنسجة العضلات باستخدام نظير البنتان قبل المبردة، وهذا البروتوكول هو أبسط وأكثر كفاءة، ويمكن استخدامها لتجميد العضلات بطريقة الإنتاجية. وعلاوة على ذلك، هذا الأسلوب هو الأمثل للمؤسسات التي ليس لديها إمكانية الوصول إلى نظير البنتان، وهي قابلة للاشتعال للغاية في درجة حرارة الغرفة.

المقدمة

الهيكل العظمي والعضلات هي العنصر الأكثر قيمة من الحيوانات المنتجة للحوم من الناحية التغذوية وتجهيز الرأي. في صناعة اللحوم، هناك جانبان خصوصا الحرجة: كفاءة نمو العضلات ونوعية اللحوم الناتجة عن ذلك. كعنصر رئيسي من العضلات، وألياف العضلات هي ذات الصلة مباشرة إلى أداء النمو وجودة اللحوم الطازجة في الحيوانات 1. على سبيل المثال، فإن العدد الإجمالي للألياف (TNF) ومنطقة مستعرضة للألياف (CSAF) تحديد معظمهم من كتلة العضلات وجودة اللحوم. أيضا، نوع من الألياف التركيب (FTC) تؤثر بقوة جودة اللحوم الطازجة 2. ولذلك، فإن التلاعب في خصائص الألياف العضلية في الحيوانات هي طريقة فعالة للغاية لزيادة الربحية الأساسية والقدرة التنافسية للمزارع 1.

حتى الآن، وقد تم تحديد العديد من العوامل الجوهرية وخارجي لمعالجة الألياف العضلية characteristICS 1. هذا التلاعب لا يمكن أن يتحقق من خلال اختيار المستهدفة من الحيوانات مع جينات معينة، مثل الجين Myostatin في الماشية 3، والجينات Callipyge في الأغنام 4، وRYR1 والجينات IGF2 الخنازير 5. أيضا، مراقبة النظام الغذائي والعلاجات مع هرمونات معينة تلعب دورا هاما في خصائص الألياف العضلية 6. وهكذا، وهو نهج يجمع بين العوامل الوراثية والغذائية قد تكون قادرة على تحسين محتوى اللحوم الخالية من الدهون وجودة اللحوم. ومع ذلك، تقتصر الدراسات على ألياف العضلات في صناعة اللحوم لاستجلاء هيكل من ألياف العضلات لا يزال يشكل تحديا.

يتم تحديد خصائص الألياف العضلية باستخدام أساليب النسيجية، مثل فحص الميوسين الأدينوزين فسفاتاز (أتباز). ويعتمد هذا الأسلوب على حقيقة أن الإنزيمات الموجودة في أقسام رقيقة (6-8 ميكرون) المجمدة منألياف العضلات يمكن أن يتفاعل كيميائيا مع بعض المنتجات. ومع ذلك، فإن المحتوى المائي للعضلات أكبر من 75٪ في الخنازير والأرانب والفئران والبشر، بغض النظر عن موقف (أي والظهر والبطن، أو hindlimb) 7. هذا نسبة عالية من الرطوبة في العضلات يسبب مشكلة تصادفها - تجميد التحف - أثناء إعداد cryosections، كما هو موضح سابقا 8 و 9. في معظم الحالات، فإنه يكاد يكون من المستحيل لتجميد الأنسجة العضلية بشكل مناسب في خط إنتاج المسلخ، وفقا لتجربتنا.

بروتوكول المعروضة هنا يصف طريقة بسيطة وفعالة المستخدمة في المختبر لدينا لتجميد الأنسجة العضلية لcryosectioning بطريقة عالية الإنتاجية. تسليط الضوء على هذا الأسلوب هو cryovial الجديد الذي تم تصميمه لأنسجة العضلات فلاش تجميد في النيتروجين السائل. سير العمل الحالي يمكن أن تسهل في الوقت نفسه الأنسجةتجميد وتصنيع لcryosection العضلات ممتازة، مع حجرة حشوية واضحة للعيان وبدل ضيق من myofibers إلى الأنسجة المحيطة بها. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تطبيق هذا البروتوكول لمجموعة واسعة من الخيارات لتحليل الأنسجة لأن النيتروجين السائل لا يمتزج مع الأنسجة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم تأسيس الطريقة الحالية والتحقق من صحتها لحصاد وتخزين أكثر من 1000 عينة العضلات لتلطيخ النسيجي في مختبرنا. وجاءت جميع الإجراءات التي تنطوي على رعاية الحيوان واستخدام المبادئ التوجيهية التي وضعتها وزارة الزراعة في الصين.

1. المعدات اللازمة لجمع العينات

  1. تسمية هوية العينة على كل قارورة المبردة.
    ملاحظة: قارورة المبردة صمم خصيصا لتجميد عينات أنسجة جديدة لهذا الإجراء cryosection (الشكل 1A). مصنوعة من قوارير من البولي بروبلين في قالب المصنع (الشكل 1C).
  2. الحصول على المعدات التالية: النيتروجين السائل في خزان النتروجين السائل المناسب، ونظارات السلامة أو درع الوجه، والقفازات الثلاجة، 10 سم ملقط، 25 ملاقط سم، برودة الستايروفوم (الأبعاد الداخلية: 20 سم × 12 سم واسعة × 13.5 سم ارتفاع ؛ الأبعاد الخارجية: 24 سم × 16 سم × 15 سم ارتفاع)، فيلم من البلاستيك (2.5 سم × 0.8 سم واسعة × 0.1 مم)،مشرط، ويغطي ملزمة A4 PVC (21 سم × 29.5 سم) (الشكل 1B).

2. إعداد عينات العضلات

  1. ملء برودة الستايروفوم مع النتروجين السائل 5 دقائق قبل جمع العينة.
    ملاحظة: عمود كبير من النيتروجين السائل أمر ضروري لأن جزءا من النيتروجين السائل يغلي بعيدا ويتحول إلى غاز عندما تلمس عينات جديدة منه. من أجل الحد من وتيرة نقل النيتروجين السائل لتجديد الخسارة، يجب أن تكتسب برودة الستايروفوم بحجم مناسب مقدما وفقا لعدد من العينات.
  2. مرة واحدة يتم الحصول على العينة، وضع بلطف على قطعة من غطاء ملزمة A4 PVC ومراقبة اتجاه الألياف العضلية.
    ملاحظة: هنا، استخدمنا المقطع العرضي للعضلة الطولى دوريس من الأول إلى فقرة القطنية الأخيرة في الخنازير. العينات هي حوالي 12 سم، 8 سم واسعة، وارتفاع 5 سم.
  3. استخدام مشرط لجعل اثنين من الشقوق موازية من خلال ط عينةن اتجاه الألياف العضلية، ما يقرب من 3 سم في الطول و 0.6 سم عن بعضها البعض. تقليم العضلات قطعي في مستطيل حوالي 0.6 سم واسعة × 0.6 سم ارتفاع × 1.5 سم.
    ملاحظة: موثوقية لقياس مساحة المقطع العرضي للألياف العضلات يعتمد في الغالب على اتجاه الألياف في عضلة قطعي.
  4. استخدام 10 سم ملقط لوضع بلطف العينة على قطعة من البلاستيك فيلم، مع المحور الطولي للبالتوازي العضلات قطعي إلى حافة طويلة من الفيلم (الشكل 2A).
    ملاحظة: فيلم من البلاستيك وظيفتين: وظيفة القابضة التي تساعد في تحديد اتجاه الألياف العضلية وظيفة التصاق أن يمنع التشققات في العينة بسبب تجميد السريع.
  5. باستخدام ملقط، ضع الأنسجة العضلية في منتصف السفلي من القارورة المبردة المسمى، فقط بين الثقوب مدخل، ثم الغطاء بإحكام القارورة (الشكل 2B).

3. تجميد وتخزين عينة العضلاتالصورة

  1. استخدام ملاقط 25 سم، وسرعان ما يغرق القارورة المبردة كاملة في النيتروجين السائل في برودة الستايروفوم تبرد قبل، والانتظار حتى النيتروجين السائل لا تغلي (حوالي 10-20 ق).
    ملاحظة: سيتم cryovial تطفو عندما النيتروجين السائل يغلي، لذلك بعناية تزج القارورة في النيتروجين السائل المغلي لمدة 10-20 ثانية.
  2. نقل عينات العضلات إلى خزان تخزين النتروجين السائل أو -80 ° C الثلاجة لمدة التخزين على المدى الطويل.

4. شريحة التحضير

  1. Precool ناظم البرد إلى ما بين -20 درجة مئوية و -22 ° C.
  2. إزالة والتخلص من شفرة مشراح القديمة، ومسح أسفل حامل سكين ولوحة مكافحة لفة في ناظم البرد، تثبيت شفرة مشراح جديدة في ناظم البرد، وتعيين سماكة القطع الى 8 ميكرون.
  3. نقل عينة العضلات في القارورة المبردة من خزان النتروجين السائل أو الفريزر -80 درجة مئوية إلى ناظم البرد، نقله في النيتروجين السائل أو على الثلج الجاف.
  4. انتظر 30 دقيقة لعينة لكي تتوازن مع درجة حرارة ناظم البرد.
    ملاحظة: أي معدات قد لمس العينة يجب أن يكون قبل تبريده، وذلك لأن درجة حرارة عالية قد تتسبب في تكوين بلورات الثلج في العينة.
  5. جبل العينة في حامل العينة تحت درجة حرارة صياغة قطع المثلى من الجليكول وراتنجات للذوبان في الماء (OCT). قطع أقسام 8 ميكرومتر.
    ملاحظة: ضبط زاوية القطع عموديا على اتجاه الألياف العضلية، لأن CSAF هو منطقة مستعرضة من الألياف العضلية.
  6. جبل أقسام نحو وسط شريحة مجهرية درجة حرارة الغرفة. المكان على الفور الشريحة في مربع الشريحة في الفريزر -80 درجة مئوية. لا تسمح الشريحة لتجف في RT.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

وتظهر التوضيح cryovial والمعدات المختبرية الشائعة لتجميد العضلات أثناء إعداد أقسام المجمدة في الشكل 1. مصنوعة من مادة البولي بروبيلين cryovials في مصنع العفن. كل قارورة لديها ما مجموعه 14 الثقوب مدخل: واحد على الغطاء. وآخر هو في الأسفل. والباقي 12 شكل أربعة خطوط متوازية، مع كل أربعة ثقوب في 90 درجة مع بعضها البعض. ويمكن لهذه الثقوب مدخل تسريع سرعة تدفق النيتروجين السائل بجانب الأنسجة لتجنب "بطانية البخار" تأثير عندما الات...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

هنا، نحن تصف الجديد، cryovial متعددة حفرة لتجميد وتخزين الأنسجة العضلية لإجراء عمليات تقييم النسيجية وظيفة العضلات. الخطوة تعديل حاسمة في هذا البروتوكول هو أن العينة في cryovial متعددة ثقب مغمورة مباشرة في النيتروجين السائل. على حد علمنا، وهذا هو أبسط وrapidest طريقة للحصول على العينات المجمدة ممتازة لcryosectioning العضلات بين الأساليب تجميد القائمة (انظر نتائج ممثل).

التحدي الفني من قبل الباحثين العضلات واجه هو...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

أي تضارب في المصالح أو مالية أو خلاف ذلك، أعلن من قبل المؤلفين.

شكر وتقدير

وقد أيد هذا المشروع من قبل مؤسسة العلوم الطبيعية الوطنية الصينية (NSFC): 31301950 و31671288.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Cryostat Microtome  مجهر لايكالايكا CM1950
الرقمي نيكوننيكون DS-U3
  قارورة مبردة    فيلمصممه
النيتروجينCommomly استخدام
مشرطCommomly
10 سم ملقطCommomly 25
سم ملاقطCommomly يستخدم
زجاجCommomly تستخدم
قفازاتالفريزرCommomly المستخدمة
بلاستيكي السائل أمان

المراجع

  1. Joo, S. T., Kim, G. D., Hwang, Y. H., Ryu, Y. C. Control of fresh meat quality through manipulation of muscle fiber characteristics. Meat Sci. 95 (4), 828-836 (2013).
  2. Lefaucheur, L. A second look into fibre typing--relation to meat quality. Meat Sci. 84 (2), 257-270 (2010).
  3. Fiems, L. O. Double Muscling in Cattle: Genes, Husbandry, Carcasses and Meat. Animals (Basel). 2 (3), 472-506 (2012).
  4. Cockett, N. E., et al. The callipyge mutation and other genes that affect muscle hypertrophy in sheep. Genet Sel Evol. 37, Suppl 1 65-81 (2005).
  5. Stinckens, A., et al. The RYR1 g.1843C>T mutation is associated with the effect of the IGF2 intron3-g.3072G>A mutation on muscle hypertrophy. Anim Genet. 38 (1), 67-71 (2007).
  6. Brameld, J. M., Buttery, P. J., Dawson, J. M., Harper, J. M. Nutritional and hormonal control of skeletal-muscle cell growth and differentiation. Proc Nutr Soc. 57 (2), 207-217 (1998).
  7. Reinoso, R. F., Telfer, B. A., Rowland, M. Tissue water content in rats measured by desiccation. J Pharmacol Toxicol Methods. 38 (2), 87-92 (1997).
  8. Meng, H., et al. Tissue triage and freezing for models of skeletal muscle disease. J Vis Exp. (89), (2014).
  9. Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. Do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis. J Vis Exp. (99), e52793(2015).
  10. Meijer, A. E., Vloedman, A. H. The histochemical characterization of the coupling state of skeletal muscle mitochondria. Histochemistry. 69 (3), 217-232 (1980).
  11. Harnkarnsujarit, N., Kawai, K., Suzuki, T. Effects of Freezing Temperature and Water Activity on Microstructure, Color, and Protein Conformation of Freeze-Dried Bluefin Tuna (Thunnus orientalis). Food Bioprocess Technol. 8 (4), 916-925 (2015).
  12. Dubowitz, V., Sewry, C. Muscle Biopsy: A Practical Approach. , Elsevier. Ch. 15 407-422 (2007).
  13. Suvarna, S. K., Layton, C., Bancroft, J. D. Bancroft's Theory and Practice of Histological Techniques: Expert Consult: Online and Print, 7e. , Elsevier. (2008).
  14. Sulaiman, S. A., Kamarudin, N. A. Z. Bubbles Size Estimation in Liquid Flow Through a Vertical Pipe. J Appl Sci. 12 (23), 2464-2468 (2012).
  15. Fukutomi, K., et al. A Study of A Flow through Small Apertures : 2nd Report, Experiments on The Velocity Field. Nihon Kikai Gakkai Ronbunshu B Hen/transactions of the Japan Society of Mechanical Engineers Part B. 53 (496), 3516-3521 (1987).
  16. Shah, M. S., Joshi, J. B., Kalsi, A. S., Prasad, C. S. R., Shukla, D. S. Analysis of flow through an orifice meter: CFD simulation. Chem Eng Sci. 71 (9), 300-309 (2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Cryostat ATPase

مقالات ذات صلة