تقنية المناظير لجمع المسلسل من الكبد والغدد الليمفاوية مساريقي في قرود المكاك

ملخص

هنا، نحن تصف تقنية المناظير كسبها لأخذ العينات المسلسل من الكبد والغدد الليمفاوية المساريقي (MLN) في قرود المكاك التي تسمح لزيادة تواتر أخذ العينات، ويقلل من احتمالات المضاعفات الجراحية عند مقارنة أداء البطن.

الملخص

ويتعرض العقد الليمفاوية المساريقي (MLN) والكبد للميكروبات والمنتجات الميكروبية من (GI) الجهاز الهضمي، مما يجعلها فريدة من نوعها مناعيا. الجهاز الهضمي وMLN المرتبطة ومواقع تكاثر الفيروس في وقت مبكر من العدوى البشرية بفيروس نقص المناعة (HIV) وMLN من المرجح المواقع خزان الهامة التي تأوي الخلايا المصابة خفية حتى بعد العلاج المضاد للفيروسات لفترات طويلة (ART). وقد تبين الكبد للعب دورا هاما في الاستجابات المناعية لlentiviruses ويبدو أن تلعب دورا هاما في إزالة الفيروس من التداول. الرئيسيات غير البشرية (NHP) نماذج لفيروس نقص المناعة البشرية ومتلازمة نقص المناعة المكتسب (الإيدز) تحاكي عن كثب هذه الجوانب من عدوى فيروس نقص المناعة البشرية وأخذ عينات طولية المسلسل من المواقع الرئيسية لتكاثر الفيروس والاستجابات المناعية المرتبطة في هذا النموذج سوف تساعد على توضيح الأحداث الهامة في الإصابة، المرضية ، وتأثير استراتيجيات التدخل المختلفة على هذه الأحداث. داءتقنيات والأنف والحنجرة نشرت لأخذ عينات الكبد وMLN يشتملان عملية جراحية كبرى و / أو التشريح، مما يحد من القدرة على التحقيق في هذه المواقع الهامة بطريقة التسلسلي في نفس الحيوان. وصفناها سابقا تقنية المناظير لجمع مليون. هنا، نحن تصف تقنية المناظير كسبها لأخذ العينات طولية المسلسل من الكبد وMLN خلال نفس موقعين ميناء المطلوبة لجمع مليون. استخدام نفس الميناءين يقلل من تأثير على الحيوانات التي يتطلبها أي شقوق إضافية. هذه التقنية يمكن استخدامها مع زيادة تردد أخذ العينات مقارنة عملية جراحية في البطن الكبرى، ويقلل من احتمالات المضاعفات الجراحية وما يرتبط بها من الاستجابات الالتهابية المحلية والنظامية التي يمكن أن تعقد تفسير النتائج. هذا الإجراء لديها امكانات لتسهيل دراسة شملت نماذج NHP مع تحسين رعاية الحيوان.

المقدمة

الجهاز الهضمي (GI) هو أكبر سطح الغشاء المخاطي في الجسم ويتعرض لعدد لا يحصى من المستضدات المستمدة من الغذاء ومسببات الأمراض، والمجتمعات البكتيرية endosymbiotic يشار إلى أن microbiome ^{1 و 2.} الغدد الليمفاوية المساريقي (MLN) خط الجهاز الهضمي وهي الموقع الرئيسي لوظائف المناعة لتعزيز الاستجابات الالتهابية أو مولد للتحمل نحو هذه المستضدات المختلفة. المنظمة المادية للMLN يخلق نظاما مجزأة يمكن أن تستجيب لمستضدات محليا دون استثارة ردود النظامية ^3. وبالمثل، الدم من المصارف الجهاز الهضمي إلى الكبد عن طريق الوريد البابي قبل أن يعود إلى التداول، وبالتالي يتعرض للميكروبات والمنتجات الميكروبية التي translocated من الجهاز الهضمي في الصفيحة المخصوصة ودخلت مجرى الدم ^4. وظائف الكبد أيضا بمثابة الثانوي اللمفاوية الجهاز لالثانية لديها عدد كبير من الخلايا المناعية، بما في ذلك الضامة المتخصصة، لإزالة الميكروبات translocated ^{5، 6.} وهكذا، فإن MLN والكبد هي أجهزة المناعة الأولية تتعرض لالمتعايشة والبكتيريا المسببة للأمراض من الجهاز الهضمي، وكذلك الوسط المستضدات من مصادر أخرى، مما يجعلها فريدة من نوعها ومهمة من وجهة نظر المناعية.

وMLN هي المواقع الحرجة لتقييم الآثار عن الفيروسات والمناعية لفيروس نقص المناعة البشري (HIV) أو العدوى المسببة للأمراض نقص المناعة القردي فيروس (SIV)، ويشارك على الأرجح في نشر في وقت مبكر من SIV التالية التحدي داخل المستقيم. ومن المعروف الأنسجة اللمفاوية المرتبطة القناة الهضمية لتكون موقعا رئيسيا للتكرار المستمر فيروس نقص المناعة البشرية، على الرغم من سيطرة فعالة ديه فيروسية دم من العلاجات المضادة للفيروسات الحديثة (ART) ^7. في نماذج عدوى فيروس (SIV) وقد ثبت MLN أن تكون الخزانات الهامة من الفيروس كامنا ويجوزيكون الخزان الرئيسي ^{8 و 9.} الكبد هو أيضا مهم في الإصابة lentiviral كما يتضح من تراكم SIV خلايا معينة CD8 ⁺ T في كبد قرود المكاك خلال العدوى الحادة SIV ^10. وعلاوة على ذلك، هو الجهاز الرئيسي المسؤول عن إزالة الفيروس من تداول ^11.

ترتبط بفيروس نقص المناعة البشرية والتهاب SIV مع الجراثيم GI المتغيرة، تعطلت GI سلامة الظهارية، وزيادة النبات الميكروبات والمنتجات الميكروبية من القولون في محيط والدورة ^{12، 13.} وترتبط هذه العمليات مع تنشيط جهاز المناعة المحلية والنظامية، وزيادة معدلات الاعتلال والوفيات في الأشخاص المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية ^(14). في العدوى SIV، وقد لوحظ البكتيريا translocated في MLN ^15، في حين أن تراكم هيئة التصنيع العسكريوقد تبين منتجات robial في الكبد أن يؤدي إلى التهاب وتلف الجهاز ^16. وهكذا، في سياق فيروس نقص المناعة البشرية والأمراض للسيف، وMLN والكبد يمكن أن يكون مفيدة للغاية لفهم العمليات الالتهابية يقودها البكتيريا-GI المقيمين.

هنا، نقدم تقنية المناظير كسبها لأخذ العينات المسلسل الى MLN والكبد في الرئيسيات غير البشرية (الرئيسيات). علينا أن نظهر الأداء الناجح لهذه التقنية على اثنين صحية المكاك ريسوس الإناث (RMS)، وأخذ العينات كل حيوان مرتين، مع 160 يوما بين كل عملية جراحية. نذهب لاستخدام هذه العينات لتقييم ومقارنة رئيسيا الكريات البيض والخلايا اللمفاوية السكان داخل كل جهاز باستخدام التدفق الخلوي، وإظهار البيانات متسقة للغاية بين النقاط مرتين.

البروتوكول

تم إيواء الحيوانات والرعاية في الجمعية لتقييم واعتماد مختبر رعاية الحيوان الدولية (AAALACi) المرافق المعتمدة، وأجريت كافة الإجراءات الحيوانية وفقا لبروتوكولات وافقت عليها اللجنة الحيوان الرعاية المؤسسية والاستخدام (IACUC) من جامعة واشنطن و مركز واشنطن الوطنية الرئيسيات البحوث.

1. الجراحي إعداد والتخدير، وتسكين

1. التخدير والحث
   1. رزين المكاك مع الحقن العضلي من 10 ملغ / كغ من الكيتامين و 0.015 ملغم / كغم من ديكسميديتوميدين (مجتمعة في حقنة واحدة). ضمان عدم وجود ردود الفعل الانسحاب قبل إزالة من القفص.
   2. تدخله الحيوان، والحفاظ على الحيوانات في الطائرة من التخدير العام باستخدام الأيزوفلورين (1،0-2،5٪) و 100 الأوكسجين٪. انظر المراجع للحصول على مزيد من المعلومات حول التنبيب والتخدير العام في قرود المكاك ^17،المرجع "> 18 ^{و 19.}
2. دعم التخدير ومراقبة
   1. اضافة الى وجود القسطرة الوريدية الطرفية وتوفير السوائل الوريدية متساوي التوتر (مثل قارعو الأجراس Lactated الحل) بمعدل 5 مل / كغ / ساعة في جميع أنحاء التخدير والجراحة. تطبيق العقيمة تشحيم العين لمنع جفاف القرنية.
   2. توفير تسكين الألم، مثل صياغة الإفراج مستمرة من البوبرينورفين (0.2 ملغم / كغم، تحت الجلد).
      ملاحظة: هناك NSAID (مثل ميلوكسيكام أو كيتوبروفين) كما يمكن أن تقدم خلال فترة الانتعاش مخدر، شريطة أن يكون بروتوكول تجريبي يسمح إدارة NSAID وهذا الحيوان هو سوي ضغط الدم ورطب بشكل جيد أثناء التخدير.
   3. مراقبة عمق مخدر (مثل لهجة الفك) ومعدل ضربات القلب، ومعدل التنفس، ورسم القلب وضغط الدم والأوكسجين النبض، نهاية المد CO _2، ودرجة حرارة الجسم في جميع أنحاء التخدير والجراحة.
      ملاحظة: عند insufflated البطن، والحيوان قد hypoventilate.توفير التهوية الميكانيكية إذا ينخفض معدل التنفس، أو نهاية المد CO ₂ مستويات فوق 45 مم زئبق.
   4. بعد الجراحة، إدارة atipamezole (0.15 مغ / كغ، العضل) لعكس ديكسميديتوميدين.
3. إعداد الجراحية
   1. أداء متعددة الحقن الشرجية الماء الدافئ لتقليص حجم البراز في القولون لمساعدة التصور والتلاعب في الأمعاء أثناء إجراء ^20.
   2. استخدام كليبرز مع عدد 40 شفرة لإزالة الشعر من حقل الجراحي. يحلق من التلال الساحلية إلى العانة ومن اليسار إلى الجهة اليمنى.
   3. جو معقم و مطهر إعداد الجراحي الميداني باستخدام المطهرات المناسبة، مثل بالتناوب الكلورهيكسيدين الكحول أو بوفيدون اليود من الكحول الدعك.
   4. وضع الحيوان على طاولة العمليات على ظهر لها، في منتصف الطريق على الزاوية بين ظهري والاستلقاء الجانبي الأيمن. ربط الذراعين والساقين مع حبل في موقف الموسعة. توفير chlorhexi النهائيتناول الطعام والإعدادية الكحول مرة واحدة يتحرك الحيوان إلى غرفة العمليات ويتم وضع لعملية جراحية.

2. جراحة

ملاحظة: للحصول على مزيد من المعلومات من تنظير البطن في الحيوانات الصغيرة، أنظر المرجع ^21.

1. إعداد صك بالمنظار
   1. ثنى الحيوان مع ثنى منوفذة معقمة.
   2. مع مساعدة من مساعد غير معقمة، والتفاف الكاميرا الرقمية مع ثنى كاميرا معقمة ونعلق كابل إلى البرج. إرفاق نطاق جامدة في الرأس الكاميرا.
   3. إرفاق كابل ضوء المعقم في نطاق جامدة وتوصيل كابل إلى مصدر الضوء. توازن اللون الأبيض الكاميرا وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
   4. إرفاق أنابيب منفاخ المعقم في منفاخ.
2. بالمنظار الدخول
   1. باستخدام رقم 15 مشرط، وجعل ~ 5 مم طعنة شق طريق الجلد إلى عمق عضلات البطن، والتطبيقroximately 1-2 سم إلى يسار السرة.
   2. باستخدام اليد غير المسيطرة، وترفع من جدار الجمجمة البطن الى موقع شق طعنة. مع اليد المهيمنة، ضع رأس الإبرة Veress من خلال شق وزاوية cranially طرف.
      ملاحظة: زاوية اختراق الإبرة Veress سوف تختلف بناء على حالة الجسم من الحيوان. على سبيل المثال، في الدهون الحيوانية، ستكون هناك حاجة إلى إدراج نحو عمودي على جدار البطن الإبرة Veress. في حيوان رقيق، ينبغي الزاوية الإبرة Veress cranially للحد من المخاطر من الاتصال الأحشاء.
      1. عقد رمح (وليس محور) من الإبرة Veress، ودفع بقوة الإبرة لاختراق جدار البطن في تجويف البطن. A متميزة "فوق" وسيشعر انخفاضا في المقاومة كما غيض حاد تخترق الغشاء البريتوني وغيض حادة من الينابيع إبرة Veress قدما في تجويف البطن.
         ملاحظة: إذا كانت الإبرة يمر على النحو المناسب في اله تجويف البطن، وستكون هناك مقاومة تذكر عندما يكون متقدما وسحب 1-2 سم.
   3. ربط منفاخ الأنابيب CO ₂ إلى الإبرة وفتح محبس. الضغط على البطن للا يزيد عن 10-12 مم زئبق إلى إنشاء استرواح الصفاق.
      ملاحظة: حقق البطن نفخ المثالي عندما وسعت بشكل متناظر وهناك فقدان للكفاف حاد الطبيعي للهوامش الساحلية. الضغط ينبغي أن توفر مساحة كافية لإدخال قنية / مبزل دون التعرض لخطر الاتصال الأحشاء.
3. قنية التنسيب
   1. بمجرد insufflated البطن تماما، وجعل ~ 5 - ملم شق 7 مع مشرط شفرة رقم 15 من خلال جلد البطن الجمجمة الأيسر لعضلات البطن ~ 2-4 سم الذيلية للضلع الماضي.
   2. وضع 5 مم التجمع مبزل-قنية من خلال شق الجلد وزاوية ذلك ~ 45-60 درجة caudomedially. اختراق تجويف البطن إلى عمق 1-2 سم. أفلام اث قنية مترابطة في البطن عن طريق تناوب قنية (~ 0،5-1 سم أكثر من ذلك) على عمق 1،5-3 سم، وإزالة مبزل.
   3. إزالة أنابيب منفاخ من الإبرة Veress، إيقاف محبس، وإزالة الإبرة. قم بتوصيل أنابيب منفاخ للقنية وفتح محبس للحفاظ على استرواح الصفاق في ما لا يزيد عن 10-12 مم زئبق.
   4. إدراج نطاق جامدة من خلال قنية وفي تجويف البطن.
   5. تحت تصور الكاميرا، والاستمرار في إجراء شق صغير مع مشرط شفرة رقم 15 من خلال عضلات البطن والغشاء البريتوني في شق الجلد السابقة تستخدم لVeress إبرة الإدراج. يستخدم الكاميرا لتصور الجانب البطن للشق لتجنب السفن وتقليل النزيف.
      ملاحظة: تأكد شق طريق العضلات والغشاء البريتوني كبيرة بما فيه الكفاية لتسهيل دخول لجنة التحقيق وظاهرية من مساريق (~ 0.5 سم). قد تكون هناك حاجة لشق أكبر لمن الداخل للظاهر mesentريها في الحيوانات مع الدهون المساريقي المفرط.
   6. وضع الحيوان في موقف تراند ²¹ مع القدمين مرتفعة بحوالي 15-30 درجة فوق الرأس. هذا هو اختياري ولكن قد تسمح سهولة الوصول إلى الغدد الليمفاوية المساريقي من القولون، والأمعاء الصغيرة سينتقل إلى موقف أكثر الجمجمة.
4. المساريقي العقدة الليمفاوية خزعة
   1. تحت تصور الكاميرا، اضافة الى وجود تحقيق الصلبة من خلال شق في البطن في الخطوة 2.3.5.
   2. وضع مسبار بين الثرب والأمعاء وتستخدم حركة واسعة لاكتساح بلطف الثرب قبالة الأمعاء للسماح التصور من مساريق الأساسي. الاستمرار في استخدام حركة واسعة من الذيلية إلى البطن الجمجمة. الثرب يمكن وضعها في البطن الجمجمة الصحيح لذلك هو خارج الحقل المنطوق.
   3. استخدام مسبار لتحريك القولون النازل نحو جدار البطن الأيسر أو الأيمن. وسيتيح هذا التصور أفضل من رانه مساريق للمساعدة في البحث عن الغدد الليمفاوية المساريقي.
   4. استخدام مسبار لاكتساح من خلال مساريق لتحديد مكان الغدد الليمفاوية المساريقي على طول القولون والمساريقي السفن.
      ملاحظة: العقد القولون تعمل على طول الحدود المساريقي من القولون، والعقد مغص اليسرى يمكن العثور بالقرب من نقطة فرع من السفن، والعقد المساريقي السفلي ويمكن الاطلاع على طول الأوعية المساريقي السفلي. الغدد الليمفاوية المساريقي مرئية بسهولة في الحيوانات العجاف. عندما دفن في الدهون المساريقي أنها في كثير من الأحيان مد مرتفعة قليلا، لامعة مظهر لمساريق المغطي وقد يكون أكثر لون تان أكثر رمادي ثم المحيطة الدهون المساريقي. بالإضافة إلى ذلك، الغدد الليمفاوية المساريقي تميل إلى الكذب على طول الأوعية اللمفاوية والأوعية الدموية المساريقي.
   5. وحالما يتم تحديد العقدة الليمفاوية، وإزالة التحقيق وإدراج ملقط ماريلاند صعد إلى تجويف البطن. استخدام ملقط لفهم مساريق المجاورة العقدة الهدف. سحب مساريق نحو INCIسيون، وإزالة نطاق من قنية.
   6. إيقاف منفاخ وترك محبس قنية مفتوحة للأزال الضغط على البطن لتسهيل أمور ظاهرية من مساريق. سحب مساريق خارج الجسم عن طريق شق. مرة واحدة exteriorized، فهم مساريق مع المرقأة البعوض منحنية أو ملقط الإبهام لضمان الوصول من خلال شق.
   7. تحديد العقدة الليمفاوية (ق) في غضون مساريق exteriorized بواسطة التلمس لالعقدة الليمفاوية أكثر ثباتا و / أو التصور المباشر للون أكثر رمادية أو ظهور عقيدية من العقدة الليمفاوية.
      1. وبمجرد تحديدها، وجعل فتحة صغيرة (~ 3-5 ملم) في مساريق بالقرب من عقدة باستخدام المرقأة منحنية. مرفقات مجانية إلى مساريق باستخدام تشريح حادة مع المرقأة منحنية. Ligate الأوعية الدموية مع 4-0 غير قابل للامتصاص خياطة حيدة عند الضرورة. استخدام تشريح حاد مع مشرط لإزالة العقدة الليمفاوية. وضع العقد في معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) 1640 المتوسطة علىجليد.
   8. دراسة مساريق exteriorized للنزيف. إذا لاحظت النزيف، وتوفير الإرقاء المناسب من قبل يسد الأوعية مع المرقأة أو الأربطة (4-0 غير قابل للامتصاص حيدة خياطة)، أو عن طريق استخدام الكي. الافراج عن مساريق ونفخ في البطن إلى 10-12 مم زئبق للسماح مساريق للعودة إلى تجويف البطن.
   9. كرر الخطوات من 2.4.1 خلال 2.4.8 للحصول على الخزعات إضافية العقدة الليمفاوية.
5. خزعة الكبد
   1. العودة الطاولة لوضع أفقي.
   2. وضع قنية الخيوط في البطن من خلال شق المستخدمة سابقا لجمع العقدة الليمفاوية خزعة (شق في الخطوة 2.3.5). ضمان شق كبير بما فيه الكفاية (~ 5-7 ملم) للسماح لوضع قنية دون الإدراج مبزل. إدراج نطاق جامدة من خلال هذا قنية نحو تجويف البطن الجمجمة وتصور البطن الجمجمة والكبد.
   3. تحت تصور الكاميرا، إدراج خزعة وorceps من خلال قنية وضعت سابقا في البطن الجمجمة الأيسر (شق في الخطوة 2.3.1).
   4. للحصول على خزعات الكبد، ووضع ملقط الخزعة تحت الهامش الفص الكبد المحدد مع جزء متحرك من الفك التي تواجه الكبد، افتح ملقط، والسماح للهامش الوقوع بين فكي مفتوحة. ضمان عدم الثرب ما بين الكبد وملقط الخزعة. ضبط الموقف من ملقط وإغلاق الصك على المنطقة عينة المطلوب.
      1. الحفاظ على الضغط لحوالي 20 - 30 ق لضمان الارقاء. مع إغلاق ملقط، إزالة عينة عن طريق سحب بلطف ملقط حتى من خلال قنية. هذا وسوف المسيل للدموع بلطف خزعة من الكبد. وضع خزعات الكبد في RPMI 1640 المتوسطة على الجليد.
         ملاحظة: حجم خزعة الكبد ما يقرب من 5 مم × 2 مم × 2 مم باستخدام 5 ملم ملقط الخزعة.
   5. فحص الموقع خزعة لنزيف باستخدام التصور الكاميرا. إذا لوحظ نزيف، وضع moistene المالحةد معقمة مسحة القطن من خلال قنية وممارسة الضغط على الموقع الخزعة. بدلا من ذلك، حزمة المواقع خزعة مع رغوة جل معقم للمساعدة الارقاء.
   6. كرر الخطوات من 2.5.3 خلال 2.5.5 للحصول على خزعات الكبد إضافية.
      ملاحظة: هنا، تم جمع 3 الخزعات لكل حيوان في الإجراء، وهو ما يكفي لجميع التحليلات المصب.
6. اختتام الجراحية
   1. فحص تجويف البطن للنزيف.
      ملاحظة: لم يحدث هذا حتى الآن. ومع ذلك، إذا لاحظت النزيف، وتحديد موقع النزيف وتقديم الارقاء المناسب عن طريق الضغط مع قطعة قطن معقمة أو استعمال رغوة جل.
   2. إيقاف منفاخ وفتح الصمامات قنية. تطبيق الضغط اليدوي لطيف في البطن لأزال الضغط بشكل كامل التجويف البريتوني. إزالة قنية.
   3. إغلاق كل من شقوق جدار البطن مع 1-2 الغرز توقف بسيطة في الموقع. ينصح 4-0 خياطة للامتصاص.
   4. أداء كتلة البداية عن طريق وضع 0،1-0،3 سم مكعب بوبيفاكايين في كل شق لتسكين المحلي قبل إغلاق الجلد.
   5. إغلاق الجلد مع 1-2 الغرز توقف دفن (ينصح 4-0 خياطة للامتصاص) في الموقع. يمكن تطبيق الأنسجة الغراء.

3. الكبد خزعة معالجة وتحليل الخلايا الليمفاوية

1. تخزين عدة قطع من أنسجة الكبد (حوالي 0.5 مم × 0.5 مم × 0.5 مم في حجم) في أنابيب الحفظ بالتبريد، في حلول التخزين RNA المفضل، و 10٪ من الفورمالين لمستقبل الجزيئي والنسيجية ويحلل.
   1. ضع خزعات الكبد المتبقية في 50 مل من RPMI 1640 المتوسطة تستكمل مع 1X البنسلين / الستربتومايسين، 40 ميكروغرام / مل من محلول كولاجيناز المتاحة تجاريا، و 4 ميكروغرام / مل الدناز في العقيمة 250 مل كوب من البلاستيك مع غطاء. يحرك بقوة باستخدام شريط مغناطيسي وصفيحة ضجة لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية.
2. توزيع بالتساوي بصب الأنسجة هضمها. غرامIND الأنسجة هضمها (من الخطوة 3.1.1) أكثر من 70 ميكرون مرشحات تنسجم مع اثنين من أنابيب 50 مل المخروطية الى تعليق خلية واحدة باستخدام نهاية معقمة 5 مل حقنة. تبرزي حجم كل من أنابيب إلى 50 مل في المتوسط ​​1640 RPMI تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني و1X البنسلين / الستربتومايسين (R10).
3. الطرد المركزي الخلايا في 840 x ج لمدة 6 دقائق في 4 درجات مئوية. صب وطاف. تركيز الخلايا في واحد أنبوب 50 مل المخروطية من خلال تعليق الخلايا من كل من الأنابيب في 5 مل R10 والجمع بين واحد إلى 50 أنبوب مل المخروطية. ليصل حجم 50 مل باستخدام R10. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات لتحديد العائد الخلوية.
   1. الطرد المركزي الخلايا في 840 x ج لمدة 6 دقائق في 4 درجات مئوية. Resuspend الخلايا في 1 مل R10، توزيع بالتساوي إلى مجموعتين 5 مل أنابيب البوليسترين جولة القاع وتبرزي حجم كل أنبوب إلى 4 مل مع R10، واستهداف ل> 500،000 الخلايا في كل أنبوب.
4. الطرد المركزي الخلايا في 840 x ج لمدة 6 دقائق في 4 درجات مئوية. صب الصورةupernatant وإعادة تعليق بيليه خلية في 4 مل الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). أجهزة الطرد المركزي في 840 x ج لمدة 6 دقائق في 4 درجات مئوية.
5. صب وطاف و resuspend الخلايا في 100 ميليلتر من برنامج تلفزيوني قبل vortexing بلطف. إضافة 1.5 ميكرولتر من يمكن حلها وصمة عار الخلايا الميتة. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
6. أضف التالي الأجسام المضادة تلطيخ السطح مخفف في التتر الموصى بها من قبل الشركة المصنعة: CD45-PerCP (استنساخ D058-1283)، CD3-PE-CF594 (استنساخ SP34-2)، CD20-PE-Cyanin5 (استنساخ 2H7)، CD4-BV605 ( استنساخ OKT4)، CD8-BV570 (استنساخ الجيش الوطني الرواندي-T8)، وCD14-BV785 (استنساخ M5E2). احتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
7. إضافة 4 مل برنامج تلفزيوني وأجهزة الطرد المركزي في 840 x ج لمدة 6 دقائق في 4 درجات مئوية. صب وطاف و resuspend الخلايا في 250 ميليلتر من 1٪ امتصاص العرق في برنامج تلفزيوني.
   تحذير: امتصاص العرق السامة. ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة.
8. تحليل السكان الخلية باستخدام قياس التدفق الخلوي كما هو موضح في اشارة ^22.

النتائج

تم الإبلاغ عن طرق مفصلة لتجهيز MLN التي تم جمعها عن طريق المنظار، وكذلك عوائد الخلوية، والترددات الكريات البيض في هذه الأجهزة من قبل ^(13). ويبين الشكل 1 البيانات العائد الخلوي وقابلية المقارنة بين MLN وخزعات الكبد التي تم جمعها في نقطتين الوقت 160 يوما بصرف النظر عن اثنين من نظام إدارة الموارد الإناث صحية باستخدام هذه التقنية بالمنظار. وجدنا أن العائد الخلوي من MLN كان أعلى بكثير من من الكبد (P = 0.0021)، بمتوسط 33.5 × 10 ⁶ و 6.74 × 10 ⁶ خلايا التي تم الحصول عليها، على التوالي. وأشار تلطيخ خلية الميت وتحليل التدفق الخلوي أن> 90٪ من الخلايا المعزولة من كلا الجهازين كانت قادرة على البقاء.

باستخدام التدفق الخلوي، قمنا بتقييم ومقارنة وفرة من كريات الدم البيضاء والخلايا الليمفاوية في MLN والكبد. ويرد مخطط النابضة التمثيلي للكبد في + الخلايا، وأخيرا خلايا CD3 ^+. من السكان CD3 ^+، قمنا بتقييم وفرة من خلايا CD4 ⁺ CD8 ⁺ T و، في حين قمنا بتقييم فرة CD14 ⁺ CD20 ⁺ والخلايا من السكان CD3-. وتظهر تدفق تمثيلي الخلوي المؤامرات تبين CD45 ⁺ وCD3 ⁺ السكان من MLN وكبد كل من الحيوانات في يوم 0 ويوم 160 في الشكل 3، في حين يبين الشكل 4 الكريات البيض والخلايا اللمفاوية وفرة لاثنين من عينات من الحيوانات اثنين. أظهرت MLN فرة أعلى بكثير من CD45 ⁺ الخلايا مما فعل الكبد (متوسط 76.9٪ و 7.66٪ من خلايا قابلة للحياة، على التوالي، = P 0.0002). ليس من المستغرب، أظهرت MLN بنسب أعلى بكثير من الخلايا CD3 ⁺ T (P0؛ 0.0001) وخلايا CD4 ⁺ T (= P 0.0004). على العكس من ذلك، فقد أثرى الكبد بشكل ملحوظ لالكريات البيض CD14 ⁺ مقارنة MLN (= P 0.0036). أظهرت MLN بمعدل أعلى من الخلايا CD8 ⁺ T، لكن هذا لم يكن كبيرا. والمثير للدهشة، لهذه الحيوانات اثنين أظهرت كلا الجهازين فرة مماثلة للخلايا CD20 ⁺ B. ذكرت وعائدات الخلوي وفرة مختلفة الكريات البيض والخلايا اللمفاوية فرعية من MLN في هذه الدراسة أكدت سابقا قيم ^23.

الشكل 1. إجمالي الخلوي العائد (أعلى) وبقاء الخلية (القاع) من جمعها تسلسليا MLN والكبد الخزعات. أظهرت MLN غلة خلية أعلى بكثير مما كان الكبد. ومع ذلك، قدمت كلا النوعين عينة خلايا وافرة لتحليل المصب. بقاء الخلية، ويقاس cytom تدفقetrically باستخدام يمكن حلها ميتة خلية أمين وصمة عار، وأظهرت أن كلا النوعين عينة عادة أسفرت> 90٪ خلية الجدوى بعد تفكك الأنسجة. أشرطة الخطأ تمثل الانحراف المعياري بين العينات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2. الممثل التدفق الخلوي استراتيجية المحاصرة. أولا، تم استبعاد الخلايا المجمعة، تليها مجموعة من خلايا قابلة للحياة فقط بعد تلطيخ باستخدام يمكن حلها ميتة خلية أمين صمة عار. بعد ذلك، تم اختيار الكريات البيض CD45 ^+، تليها مجموعة من الخلايا CD3 ⁺ T. من السكان CD3 ^+، تم تحليل خلايا CD4 ⁺ CD8 ⁺ T و. من CD3 ^- السكان، وقد تم تحليل CD14 ⁺ CD20 ⁺ والخلايا. ثي وقد استخدم استراتيجية النابضة ايضا لMLN. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3. مؤامرات التدفق الخلوي من MLN والكبد اثنين من الحيوانات طوليا. تم جمع MLN وعينات الكبد 160 يوما بعيدا عن كل من الحيوانات. (A). MLN CD45 ⁺ الخلايا (كريات الدم البيضاء)؛ (B) الكبد CD45 ⁺ الخلايا (كريات الدم البيضاء)؛ (C) MLN ⁺ CD3 خلايا ⁺ (خلايا T)؛ (D) الكبد CD3 ⁺ الخلايا (خلايا T). بالنسبة لكل من الحيوانات، أظهرت MLN نسب أعلى من CD45 ⁺ وCD3 ⁺ الخلايا مقارنة الكبد. عبر الزمان، كانت ترددات هؤلاء السكان مماثلة لكل من الحيوانات.ق / ftp_upload / 55617 / 55617fig3large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 4. ترددات من CD45 ⁺ الخلايا (يسار) وخلايا الدم البيضاء والخلايا الليمفاوية مختلف المجموعات السكانية الفرعية (يمين) عبر 23 أخذ العينات الفردية. عرض MLNs ترددات أكبر بكثير من CD45 ^+، CD3 ^+، وCD4 ⁺ الخلايا، في حين أظهر الكبد ترددات أكبر بكثير من الكريات البيض CD14 ^+، مما يدل على وظائف فريدة من نوعها لكل جهاز. أشرطة الخطأ تمثل الانحراف المعياري بين العينات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

هنا، علينا أن نظهر تقنية المناظير لجمع التسلسلي MLN وخزعات الكبد التي كان لها نسبة نجاح 100٪ في هذه وغيرها من الحيوانات وليس وصفها في هذه الدراسة. وعلاوة على ذلك، لم ارتبط استخدام هذه التقنية على الحيوانات نفسها عبر الزمن مع أي أحداث سلبية. في الواقع، لم تكن هناك أي مضاعفات تنتج عن الاعتماد على هذه التقنية في أفواج أخرى من الحيوانات التي كانت مصابة SIV، القردي فيروس / نقص المناعة البشرية (SHIV)، أو فيروس زيكا (بيانات غير منشورة). وبالمثل، فقد أثبتت هذه الجراحة ناجحة حتى في الحيوانات التي خضعت سابقا لعملية جراحية في البطن الكبرى، وفي الحيوانات نقص الصفيحات (بيانات غير منشورة). أثبتنا أن هذه العينات يمكن جمعها من خلال نفس الميناءين عن طريق عكس موقع الكاميرا عند التبديل من MLN إلى الكبد تجنب الحاجة إلى شقوق إضافية. العوامل التي تؤثر على جمع MLN تم الإبلاغ سابقا ^13.

الطبقة = "jove_content"> ما يصل إلى أربعة مجموعات من 3 MLN و 3 خزعات الكبد كل تم تنفيذها عبر الزمن على الحيوانات الفردية من دون مضاعفات، والتغيرات في معدلات النجاح أو تعديلات على البيانات التي تم جمعها. بالإضافة إلى ذلك، تم الجمع بين هذه التقنية جمع / الكبد بالمنظار MLN بنجاح مع إجراءات أخرى مثل جمع LNS الطرفية، والتنظير العلوي والسفلي الخزعات GI، تطلع نخاع العظام، وجمع السائل النخاعي، وبزل الوريد في نفس الحدث مخدر السماح للتقييم واسع النطاق لل اكتشاف الفيروسات والاستجابات المناعية بطريقة التسلسلي (بيانات غير منشورة).

الإجراء بأكمله وعادة ما يستغرق 30 - 45 دقيقة لاستكمال ويتم إنجاز من خلال اثنين من ~ 0.5 سم شقوق. في الحيوانات يعانون من السمنة المفرطة، فإنه قد يكون من الضروري إجراء شق أكبر (~ 1-1،5 سم) لاسترداد MLN من خلال وقد تتطلب وقتا إضافيا لإكمال. الحيوانات مع الدهون المساريقي واسعة غالبا ما تتطلب خبرة كبيرة لدifferentiate MLN من الدهون المحيطة بها. وغالبا ما توجد MLN على طول الأوعية الدموية المساريقي ويبدو أن أكثر انتشارا قرب نقطة فرع في الأوعية. وهناك جانب هام من هذه التقنية هو أنه يتطلب MLN اختيار أن يكون التنقل كاف في مساريق أن exteriorized من خلال شق في البطن. ونتيجة لذلك، فإن هذا الأسلوب لا يمكن أن تستخدم لجمع MLN بالقرب من جذر مساريق. بسبب التكبير، فإنه في بعض الأحيان أسهل لتحديد MLN مع الكاميرا، ويمكن استيعاب في مقربة من MLN مساعدة في تحديد مكان وتحديد العقدة مرة واحدة هو exteriorized ذلك.

قد لا تكون هناك حاجة دائما استخدام موقف تراند لجمع MLN، وإذا كان من الممكن استردادها MLN بسهولة دون استخدام موقف تراند يمكن أن تجعل خزعات الكبد أسهل لأنها سوف تمنع الأعضاء من تحويل cranially. في بعض الأحيان، بعد وضعهم في وضعية ترندلينبورغ، يتم إزاحة الكبد حتى ضد الحجاب الحاجز ويجب يمكن التلاعب بها بلطف العودة الى الموقف قبل جمع الخزعة. كما وضع الميناء لجمع MLN إلى اليسار، وعادة ما تؤخذ الخزعات الكبد من الناحية اليسرى في فصوص الكبد وسطي الجانبية واليسرى لأنها أقرب إلى قنية.

جمعت MLN وخزعات الكبد قدمت غلة وافرة خلية لمجموعة متنوعة من التحليلات التحويلية وأظهرت جدوى عالية من الخلايا التي تم جمعها. هنا، كانت ملطخة الخلايا لتحليل تدفق cytometric من الكريات البيض والخلايا اللمفاوية السكان، وتم توضيح الاختلافات الرئيسية بين هذين الجهازين المناعي الهامة. على سبيل المثال، كانت MLN التخصيب لخلايا CD4 ⁺ T مقارنة الكبد، ونظرا لأهمية MLN كنقاط مركزية لجمع ونشر الاستجابات المناعية التكيفية، وكذلك إلى أهمية CD4 ⁺ T لإدارة التهابات و ردود مولد للتحمل للبيئة المستضدات المشتقة من المدخول الغذائي والكائنات الدقيقة-GI المقيمينالصورة = "XREF"> 24. ومع ذلك، فقد أثرى الكبد بشكل ملحوظ لCD14 ⁺ الكريات البيض بالمقارنة مع MLN. وأعرب عن CD14 الغالب على وحيدات الضامة، وهو عنصر رئيسي في مجمع مستقبلات للlipopolysaccharide في البكتيري (LPS) ^25. في الواقع، وترتبط زيادة تركيزات البلازما من CD14 للذوبان مع النبات الجراثيم وتنشيط جهاز المناعة في HIV والأمراض المسببة للأمراض للسيف ^26. وهكذا، ترددات أعلى من CD14 ⁺ الكريات البيض في الكبد المرجح أن يؤدي من عبء البكتيريا أكبر في هذا الجهاز بالمقارنة مع MLN.

هنا، علينا أن نظهر تقنية جراحية سريعة وبأقل تدخل جراحي لجمع التسلسلي MLN وخزعات الكبد باستخدام اثنين فقط شقوق صغيرة للدخول بالمنظار الذي لم يؤد إلى أي نتائج سلبية. توفر هذه العينات طريقا مفيدا لتقييم العمليات المناعية، فيروسية، والميكروبيولوجية الرئيسية التي تأخذ جيش التحرير الشعبى الصينىم في MLN والكبد، والتي هي منفصلة وفريدة من نوعها من الحصانة النظامية. وبالمثل، خزعات الكبد حاسمة لتقييم المدى الطويل من آثار فيروس نقص المناعة البشرية / SIV، علاجات العقاقير، والميكروبات translocated، والتي غالبا ما تتجمع للحث على تلف الكبد كبير ^16. وعلاوة على ذلك، لأن MLN والكبد وأجهزة المناعة يتعرضون لGI الجراثيم، والقدرة على تقييم الحصانة في هذه الأجهزة عبر الزمان يوفر منصة ممتازة لفهم الدور الذي microbiome يلعب في الحفاظ على التوازن المضيف المناعي. مجتمعة، وتقييم الكبد وMLN له أهمية كبرى في سياق اللقاح وefficacies العلاجية، SIV إزالة الخزان الفيروسي، والحصانة المخاطية العامة. القدرة على جمع هذه العينات من خلال نهج مينيملي يعني أن هناك خطر أقل من التهاب المتعلقة بإجراءات من موجود مع تقنيات المنشورة حاليا وتأثير أقل على علم وظائف الأعضاء الحيوانات. في فوتلح، سوف نقوم بتقييم القدرة على الجمع بين مجموعة من MLN والكبد مع مجموعة من الطحال من خلال نفس المواقع ميناء اثنين للسماح لأخذ العينات من جزء آخر مهم ومتميز في الجهاز المناعي التي ثبت أنها تلعب دورا هاما في عدد من النماذج المرض.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
الدموع الاصطناعية زيوت التشحيم مرهم العيون	باترسون البيطري	97-890-8152
أولوية الرعاية الكلورهيكسيدين 2٪ مقشر	باترسون البيطري	07-842-6153
كحول فيدكو ، أيزوبروبيل 70٪	باترسون بيطري	07-869-6434
فيدكو فيتادين فرك	باترسون بيطري	07-869-6772
هوسبيرا 250 مل	باترسون البيطري	07-800-9325
الجراحي	Medline	DYNJP3004
Access 40 L Insufflator	Dyonics	7205832
300XL Xenon Light Source	Dyonics	7206084
460P 3 & ndash ؛ كاميرا CCD الرقمية مع ستارة كاميرا عالمية	72200086		Dyonics
للرأس ، 7 × 96 بوصة	خدمات دعم التنظير	ESS-6920
دليل الضوء العالمي ،	خدمات دعم التنظير	قدم في الولايات المتحدة. خدمات
		TM-102
منظار صلب متعدد الأغراض ، 2.7 مم × 187.5 مم ، خدمات	دعم التنظير	0 درجة B30-0007-00
فحص وغمد واقي لمنظار 2.7 مم × 187.5 مم مع محبس ثابت	واحد خدمات دعم التنظير	B10-0025-00
منظار صلب ، خدمات دعم		التنظير الداخلي 5 مم × 300 ممB30-0071-00
إبرة فيريس ، 2 مم × 80 مم   ؛	خدمات دعم التنظير	الداخلي 8302.08
مسبار صلب مع علامات ، خدمات دعم التنظير الداخلي 5 مم × 320 مم		8383.661
ملقط الإمساك والتشريح في ماريلاند بمقبض سقاطة مزدوج الحركة ، 3.5 مم × 240 مم & nbsp ؛	خدمات دعم التنظير	الداخلي 8390.2054
ملقط خزعة ، 3.5 مم × 310 مم	R. Wolf	8391.4063
قنية بلاستيكية ملولبة مع منفذ Insufflator ، 3.5 مم × 60 مم	خدمات دعم التنظير	الداخلي 8903.072
قنية بلاستيكية ملولبة مع منفذ Insufflator ، 5.5 مم × 60 مم	خدمات دعم التنظير	8919.333
المبازل الحاد	خدمات الدعم	8903.101
دعم التنظير	للمبزل	8903.121
CO2< / sub>	Airgas	CD USPE
RPMI 1640	Fisher Scientific	SH30027FS	مع L-Glutamine
RNAحل تثبيت لاحق	ThermoFisher Scientific	AM7021
البنسلين الستربتومايسين	سيجما ألدريتش	P4333
Liberase TM من الدرجة البحثية	سيجما ألدريتش	5401119001	محلول كوليجان متاح تجاريا
Dnase I من البنكرياس البقري	Sigma Aldrich	D5025
70 & micro ؛ مصافي الخلايا m	Morganville Scientific	CSS0200
5 مل حقنة	BD	309646
50 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطية	ThermoFisher Scientific	339652
مصل الأبقار	الجنيني فيشر Scientific	SH3007003
5 مل أنابيب البوليسترين المستديرة	فيشر	14-959A
PBS	Fisher Scientific	SH3025601
LIVE / DEAD Aqua Fixable Dead Cell Dead Stain	Kit ThermoFisher Scientific	L34957	بقعة أمين للخلايا الميتة
CD45-PerCP (استنساخ D058-1283)	BD Biosciences	558411
PE-CF594 ماوس مضاد ل Hu CD3 (استنساخ SP34-2)	BD Biosciences	562406
BV605 ماوس مضاد للHu CD4 (استنساخ OKT4)	Biolegend	317438
APC-H7 ماوس مضاد ل Hu CD8 (استنساخ SK1)	BD Biosciences	560179
PE-Cy5 ماوس مضاد للهو CD20 (استنساخ 2H7)	BD Biosciences	555624
BV786 ماوس مضاد للهو CD14 (استنساخ M5E2) BD	Biosciences	563698
16٪ PARAFORMALDEHYDE AQ SOLUTN	فيشر Scientific	50-980-487
LSR II مقياس التدفق الخلوي	BD	NA