مقالة منهجية

تحليل الناجم عن حمض الريتينويك العصبية تمايز الخلايا الجذعية الجنينية الماوس في الهيئات مضغي اثنين وثلاثة الأبعاد

DOI:

10.3791/55621

⸱

أبريل 22, 2017

 ,  ,  , 
1Department of Medicine, Cardeza Vascular Research Center, Sidney Kimmel Medical College, Thomas Jefferson University, 2Department of Molecular Cardiology, Cleveland Clinic Foundation, 3Department of Cancer Biology, Cardeza Vascular Research Center, Sidney Kimmel Medical College, Thomas Jefferson University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن تصف تقنية لاستخدام الخلايا الجذعية الجنينية في الفئران لتوليد اثنين أو ثلاث جثث مضغي الأبعاد. نحن ثم شرح كيف للحث على تمايز العصبي من خلايا الجسم مضغي من حمض الريتينويك، وكيفية تحليل حالتهم التمايز عن طريق خلية سلفية المناعي علامة وimmunoblotting.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلايا الجذعية الجنينية (المجالس الاقتصادية والاجتماعية) معزولة عن الكتلة الداخلية من الكيسة الأريمية (عادة في E3.5 اليوم)، ويمكن أن تستخدم في المختبر نظام نموذجي لدراسة التطور الجنيني المبكر. في حالة عدم وجود عامل مثبط سرطان الدم (LIF)، المجالس الاقتصادية والاجتماعية تفرق افتراضيا في الخلايا العصبية السلائف. ويمكن جمع إلى ثلاثي الأبعاد (3D) ووصف مجموع كروية الجسم مضغي (EB) نظرا لتشابهه مع الجنين مرحلة مبكرة. EBS يمكن المصنف coverslips على فبرونيكتين المغلفة، حيث أنها توسع من خلال زراعة اثنين الأبعاد (2D) التمديدات، أو زرع في مصفوفات الكولاجين 3D حيث تواصل نموها كما الكروية، وتفرق في الطبقات الجرثومية الثلاث: الأديم الباطن، أرومية متوسطة، والأدمة. ثقافة الكولاجين 3D يحاكي البيئة في الجسم الحي بشكل وثيق من 2D EBS. ثقافة 2D EB تسهل التحليل المناعي وimmunoblotting لتتبع التمايز. لقد قمنا بتطوير من خطوتين فارق العصبيبروتوكول نشوئها. في الخطوة الأولى، يتم إنشاء EBS بواسطة تقنية شنقا الإفلات، و، في وقت واحد، والتي يسببها للتمييز عن التعرض لحمض الريتينويك (RA). في الخطوة الثانية، وعائدات التمايز العصبية في شكل 2D أو 3D في غياب RA.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المجالس الاقتصادية والاجتماعية تنشأ من الكيسة الكتلة الخلوية الداخلية. هذه الخلايا هي المحفزة، أي أنها تملك القدرة على التمايز إلى أي نوع من الخلايا في الكائن الأصلي. ESC في المختبر التمايز هو من اهتمام واسع كنظام تجريبي للتحقيق في مسارات وآليات التنموية. ويقدم نظام نموذجي قوي ومرن لاختبار أساليب علاجية جديدة لتصحيح الخلايا والأنسجة الخلل. EBS تلخيص جوانب كثيرة من تمايز الخلايا خلال مرحلة التطور الجنيني المبكر. على وجه الخصوص، EBS يمكن استخدامها عند الفتك الجنينية يجعل من الصعب تحديد الأساس الخلوي للعيوب الجنينية 1 و 2. EBS يمكن أن تتكون إما من قبل قطرة شنقا أو تقنيات تعليق السائلة 3. ميزة السابق هو القدرة على توليد EBS من حجم ثابت وكثافة، مما يسهل استنساخ التجربة.

معشوقة = "jove_content"> التفاعل مع الخلية البروتينات التصاق مصفوفة (ECM) قد تؤثر على القدرة على الحركة وبقاء الخلايا الملتصقة. في نظام الثقافة 2D، وغالبا ما يتم تطبيق فبرونيكتين لزيادة التصاق الخلية إلى الركيزة. فبرونيكتين عنصرا الصفيحة القاعدية التي تعترف بها 10 أنواع من سطح الخلية إنتغرين heterodimers 4.

RA هو الأيض للدهون صغيرة من فيتامين (أ) الذي يسبب العصبية التمايز 5، 6. تركيزات عالية من RA تعزيز التعبير الجيني العصبي وتقمع التعبير الجيني أرومية متوسطة خلال تشكيل EB 7 و 8. ويتم إنتاج RA فيتامين ألف الأكسدة لريتينالديهيد إما عن طريق الكحول أو الريتينول نازعة، تليها الأكسدة ريتينالديهيد إلى المنتج النهائي من قبل ريتينالديهيد نازعة 9. التمايز العصبي يتطلب نقل RA من السيتوبلازم إلى النواة التي الخلوي ملزم RA بروتين 2 (CRABP2). في النواة، RA تربط لمجمعها مستقبلات وما شابه ذلك تتألف من مغاير RAR-RXR 10. وهذا يؤدي إلى توظيف النسخي شارك في تفعيل، والشروع في النسخ 9 و 11. وعلاوة على ذلك، RA يعزز تدهور فسفرته (نشط) SMAD1، وبالتالي استعداء BMP وSMAD يشير 12. وبالإضافة إلى هذه الأنشطة، RA يزيد التعبير Pax6، وهو عامل النسخ التي تدعم العصبية التمايز 13. والتضمين إشارات RA التي كتبها sirtuin-1 (SIRT1)، وثنائي النوكليوتيد الأدينين نيكوتيناميد النووي (NAD +) - انزيم يعتمد ذلك deacetylates CRABP2، والتدخل مع النبات لالنواة، وبالتالي مع RA ملزمة لمغاير RAR-RXR 14، 15، 16.

e_content "> هدفنا في تصميم بروتوكول EB تعامل RA-الموصوفة هنا هو تحسين التمايز العصبي من أجل تسهيل في المختبر تحليل مسارات الإشارات التي تنظم ESC التمايز في الخلايا العصبية السلائف. واحدة من مزايا هذا البروتوكول هو تيسير تحليل وظيفة الخلية التي كتبها المناعي. 3D EBS لم يتم اختراقها بشكل جيد من قبل الأجسام المضادة ويصعب الصورة. تفارق EB إلى أحادي الطبقة 2D في نقطة زمنية محددة خلال التمايز العصبي يسهل immunolabeling والتصوير من الخلايا عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ثقافة الفأر الجنينية الخلايا الليفية (MEFS)

  1. إعداد المتوسطة MEF والمتوسطة تعديل النسر Dulbecco وفي (DMEM، وارتفاع الجلوكوز)، على أن تستكمل مع المصل 15٪ بقري جنيني (FBS).
  2. معطف 100 ملم أطباق زراعة الخلايا مع 0.5٪ محلول الجيلاتين لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
  3. عدد MEFS باستخدام عداد الكريات. إزالة حل الجيلاتين وتصب على الفور MEF المتوسط ​​قبل تحسنت إلى 37 درجة مئوية. بسرعة ذوبان الجليد قارورة من ميتوميسين MEFS المعالجة C في 37 ° C حمام الماء لمدة 2 دقيقة، ثم البذور 2.8 × 10 6 MEFS لكل 100 ملم طبق الجيلاتين المغلفة. ضبط عدد الخلايا تبعا لذلك في حالة استخدام أطباق من أحجام أخرى. احتضان MEFS بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2.
  4. تغيير المتوسطة في اليوم التالي. الثقافة لمدة 2-3 أيام حتى طبقة MEF هي متموجة.

2. الفأر ESC الثقافة

  1. إعداد ESC المتوسطة، Iscove لتعديل المتوسطة Dulbecco و(IMDM) تستكمل مع 15٪ FBS و 103 U / مل عامل اللوكيميا المثبطة (LIF)، 0.1 ملي الأحماض الأمينية غير الأساسية، 55 مم 2-المركابتويثانول، البنسلين (100 U / مل)، الستربتومايسين (100 ميكروغرام / مل)، جنتاميسين (200 ميكروغرام / مل)، و 0.2٪ الميكوبلازما المضادات الحيوية.
  2. إزالة MEF المتوسطة من الطبق المعد في الخطوة 1 واستبدالها مع 37 ° C قبل تحسنت المتوسطة ESC.
  3. تذويب قارورة ESC وخلايا البذور في أعلى طبقة MEF. احتضان عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2، حتى الوصول إلى نقطة التقاء المجالس الاقتصادية والاجتماعية.
  4. إعداد أطباق ثقافة خلية جديدة تحتوي على أحادي الطبقة متموجة من MEFS. لمرور المجالس الاقتصادية والاجتماعية، ويغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني وفصل مع 0.25٪ التربسين / EDTA لمدة 2-5 دقائق عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2. وقف trypsinization بإضافة IMDM الطازجة مع 15٪ FBS إلى الخلايا فصل، ونقل تعليق خلية إلى أنبوب 15 مل، وأجهزة الطرد المركزي في 160 x ج لمدة 5 دقائق في RT.
  5. إزالة طاف، المجالس الاقتصادية والاجتماعية إعادة تعليق مع IMDM الطازجة ومرور خمس الخلايا إلى كل طبق جديد المغلفة MEF؛ احتضان حتى الخلاياوصول إلى نقطة التقاء (عادة 4-5 أيام).

3. سحب MEFS والمجالس الاقتصادية والاجتماعية الثقافة على لوحات المغلفة الجيلاتين،

  1. مرة واحدة وصلت ECSS التقاء، فصل بينها وMEFS مع 0.25٪ التربسين / EDTA كما في الخطوة 2.4، resuspend الخلايا في IMDM جديدة، ونقل إلى غير لاصقة طبق بتري الجرثومية، واحتضان لمدة 40 دقيقة عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2.
  2. نقل بعناية المجالس الاقتصادية والاجتماعية وMEFS التي تحتوي على المديين المتوسط ​​ولوحة جديدة الجيلاتين المغلفة باستخدام 5 مل ماصة، وتجنب pipetting لالمتكررة. الخلايا المتبقية في أطباق بتري هي MEFS، منذ المجالس الاقتصادية والاجتماعية لا تلتزم.
  3. مرور المجالس الاقتصادية والاجتماعية كل 3-4 أيام. أقل الركض المتكرر قد يقلل ESC تعدد القدرات. لا تتجاوز 60٪ التقاء، لأنها قد يفضلون التمايز.
  4. كرر الخطوات من 3،2-3،3 ثلاث مرات أو أكثر، حسب الاقتضاء، حتى MEFS لم تعد كشفها بواسطة المجهر زراعة الخلايا، وذلك باستخدام الهدف 20X، للتأكد من MEFS غير موجودة.
  5. تحقق ESC تعدد القدرات عن طريق التحقق من ESCالثقافة لمعرفة ما إذا كان شكل خلايا مستعمرات كثيفة مع نموذجي ESC مورفولوجيا المضلع (الشكل 1A). stemness خلية الاختبار الكمي عكس سلسلة من ردود الفعل الناسخ البلمرة (QRT-PCR) 17، immunoblotting 17، أو المناعي النسخ تعدد القدرات الأساسية عوامل 17 (الشكل 2).

4. EB تشكيل

  1. إعداد جميع العابر-RA حل السهم عند 10 ملم في DMSO، وقسامة إلى 1.5 مل أنابيب microfuge محمية الضوء. الحل هو مستقر في -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين. حمايتها من الضوء.
  2. يعرض للتريبسين المجالس الاقتصادية والاجتماعية كما في الخطوة 2.4. replate في IMDM جديدة بدون LIF، وتعليق وحيدة الخلية.
  3. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات، وإعداد 5 × 10 5 خلية / مل تعليق في IMDM مع 0.5 ميكرومتر RA.
  4. لوحة 100 20 ميكرولتر قطرات لكل 100 ملم طبق بتري مع ماصة 8 قنوات و 200 نصائح ميكرولتر، قلبالأطباق، وملء غطاء المقلوب مع PBS لمنع قطرات تتدلى من التجفيف. حماية وسائل الإعلام الثقافة التي تحتوي على RA بعيدا عن الضوء.
  5. ثقافة EBS في شنقا قطرات عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2، لمدة 4 أيام.

5. 2D EB الثقافة

  1. معطف 12 ملم coverslips الزجاج دائري مع 30 ميكروغرام / مل فبرونيكتين لمدة 30 دقيقة في RT. وضع كل ساترة في بئر من 24 لوحة جيدا، وإضافة 1 مل IMDM لكل بئر.
  2. حصاد 3 شنقا انخفاض EBS واحدا تلو الآخر مع 200 نصائح ميكرولتر ماصة والبذور منها على لل coverslips المغلفة فبرونيكتين، 20 EBS لكل بئر، وذلك باستخدام نفس نصائح ماصة نمت يوما.
    ملاحظة: لمدة 3 أيام EBS هي الأفضل على EBS 4 أيام لأنها تلتزم أفضل للل coverslips.
  3. تواصل الثقافة مع IMDM 15٪ FBS دون LIF. استبدال المتوسطة كل 3-4 أيام. جمع الوسيلة المستخدمة لتحليل إفراز بروتين حسب الحاجة.

6. الكشف عن البروتينات يفرز

  1. نقل 500 ميكرولتر من EB ميديأم إلى 10 مرشحات الطرد المركزي كيلو دالتون، قطع، وتدور في 20000 x ج لمدة 60 دقيقة على 4 درجات مئوية.
  2. دراسة المتوسطة المتبقية داخل مرشحات الطرد المركزي كل 15-20 دقيقة لمنع تخصيب المفرط. وقف الطرد المركزي عندما انخفض حجم المتوسطة المتبقية إلى 25 ميكرولتر.
  3. جمع المتوسطة تتركز المتبقية بعد قلب مرشح والغزل في 160 x ج في 4 درجات مئوية، وبعد تعليمات الشركة الصانعة.
  4. الكشف عن البروتينات التي يفرزها immunoblotting مع الأجسام المضادة المحددة 17.

7. 3D EB الثقافة

  1. جمع EBS نمت لمدة 4 أيام في شنقا قطرات كما هو موضح في الخطوة 5.2، ووضعها في 1.5 مل أنابيب الطرد المركزي (30 EBS في أنبوب).
  2. إعداد الكولاجين حل هلام بعد تعليمات من عدة ثقافة الكولاجين 3D (انظر المواد / المعدات الجدول). تمييع كميات مناسبة من محلول الكولاجين و5X DMEM (أحد مكونات عدة)؛ إضافة نحل eutralization (أحد مكونات الطقم) وتخلط جيدا فورا، والحفاظ على هذا على الجليد.
  3. ماصة حجم مناسب من حل الكولاجين المبردة في أنبوب 1.5 مل تحتوي على EBS، ونقل بلطف إلى آبار لوحة 6 جيدا باستخدام 1 مل ماصة. تجنب الوقوع في فقاعات.
  4. على الفور نقل لوحة إلى 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2، لمدة 60 دقيقة لبدء الكولاجين بلمرة.
  5. تراكب لوحة EB التي تحتوي على مع IMDM.
  6. تغيير المتوسطة كل 3-4 أيام.

8. EB التفكك

  1. جمع يوم 4 EBS (من الخطوة 4) واحدا تلو الآخر، مع 200 نصائح ميكرولتر ماصة ونقلها إلى غير لاصقة البكتريولوجي طبق بتري تحتوي على IMDM مع 15٪ FBS. الثقافة عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 لمدة 4 أيام أخرى. تحقق من EBS مرتين كل يوم للتأكد من أنها لا نعلق على الجزء السفلي. يهز بلطف الطبق لمنع EB المرفق إلى أسفل.
  2. الطرد المركزي EBS في 185 x ج لمدة 5 دقائق فيRT، في جهاز للطرد المركزي الفوق.
  3. إزالة supernatants. يجب أن لا يتجاوز بيليه 100 ميكرولتر في كل أنبوب.
  4. إضافة إلى مكعبات EBS 1 مل نوع 0.25٪ I كولاجيناز في الأنبوب، على أن تستكمل مع 20٪ FBS في برنامج تلفزيوني.
  5. احتضان الخليط EB-كولاجيناز لمدة 1 ساعة على 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2، pipetting لبرفق كل 20 دقيقة، وذلك باستخدام 1 نصائح ماصة مل.
  6. غسل الخلايا 3X بلطف مع PBS. إذا المجاميع خلية موجودة، استخدم مصفاة الخلية مع شبكة 100 ميكرون لإزالتها.
  7. Replate الخلايا على الجيلاتين المغلفة أطباق 60 ملم في IMDM. ثم احتضان عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2.

9. ترنسفكأيشن من فصل EBS

  1. لQRT-PCR وimmunoblotting، ومعطف لوحة 6 جيدا مع 0.5٪ الجيلاتين.
  2. لالمناعي، coverslips الزجاج معطف مع 30 ميكروغرام / مل فبرونيكتين لمدة 30 دقيقة في RT. وضع كل ساترة في بئر من 24 لوحة جيدا. إضافة IMDM.
  3. البذور 4.75 × 5 10 أو 1 × 10 5 فصل الخلايا EB (الخطوات 8،4-8،7) لكل بئر في 6- 24 أو جيدا لوحات، على التوالي.
  4. تنمو الخلايا إلى 70٪ التقاء قبل ترنسفكأيشن.
  5. Transfect الخلايا من قبل nonliposomal الدهون كاشف الخلايا الجذعية الأمثل 17 (انظر المواد / المعدات الجدول)، بعد تعليمات الشركة الصانعة.
    ملاحظة: الكاشف كنا بلغ عادة كفاءة ترنسفكأيشن من 50٪ (انظر ممثل النتائج).
  6. تحليل العينات التي QRT-PCR أو immunoblotting بعد 17 2 أو 3 أيام ترنسفكأيشن، على التوالي.

10. تحليل EB التمايز التي كتبها المناعي

  1. غسل 2D EBS أو فصل EBS 3D مع برنامج تلفزيوني والإصلاح مع بارافورمالدهيد 4٪ في برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة في RT. غسل الخلايا الثابتة 3X مع PBS لإزالة الحطام العائم الخلية.
    ملاحظة: لامتصاص العرق والجلد والعين إزعاج. توخي الحذر عند التعامل مع الامر.
  2. إضافة 1٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني لpermeabilize الخلايا لمدة 20 دقيقة في RT، ثم يغسل 3X مع برنامج تلفزيوني.
  3. إزالة برنامج تلفزيوني ومنع مع 5٪ BSA في برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة.
  4. إعداد تخفيف الأجسام المضادة الأولية في 1٪ BSA / PBS تستكمل مع 0.03٪ تريتون X-100. استبدال حل حجب من قبل حل الأجسام المضادة الأولية. احتضان لمدة 3 ساعات في RT، أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية، ثم يغسل خلايا 3X مع برنامج تلفزيوني.
  5. تطبيق الضد الثانوية في برنامج تلفزيوني وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. احتضان لمدة 1 ساعة عند RT، ثم يغسل خلايا 3X مع برنامج تلفزيوني.
  6. جبل coverslips على الشرائح الزجاجية مع وسيلة مكافحة تتلاشى لالمجهر الضوئي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oct4، NANOG، وSOX2 هي عوامل النسخ الأساسية التي تمنح ESC تجديد الذات وتعدد القدرات. طبقنا البروتوكول أعلاه لمقارنة التمايز العصبي من المجالس الاقتصادية والاجتماعية من النوع البري ومن سلالة من الفئران المعدلة وراثيا حيث SYX، الجين الترميز لعامل الصرف RhoA محددة SYX، وتعطلت. نحن لمحت SYX في الأوعية الدموية 18. لاحظنا الاختلافات في سلوك EBS مجمعة من SYX + / + وSYX - / - المجالس ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذا البروتوكول نقدم طريقة بسيطة نسبيا ويمكن الوصول إليها لدراسة التمايز العصبي من المجالس الاقتصادية والاجتماعية الفئران. في البروتوكولات السابقة، وأضيف RA إلى متوسطة في يوم 2 أو يوم 4 من EB شنقا الإفلات 8 أو ثقافة تعليق 7، على التوالي، أو مباشرة بعد EB شنقا انخفاض تجميع 21. في البروتوكول وضعت، وأضيف RA في وقت سابق. على الرغم من إدخال سابق من RA إلى EBS التي شكلتها ثقافة تعليق، أنتج هذا البروتوكول التعبير أ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب تعلن أنها لا تملك المصالح المتنافسة أو المالية

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذه الدراسة من قبل منحة المعاهد الوطنية للصحة R01 HL119984 إلى AH

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوي > المواد < / قوي >
MEFs EMDMilliporePMEF-CFESC طبقة التغذية
ESCEMD MilliporeCMTI-2
طبق ثقافة الخلايا (60 مم)Eppendorf30701119
الخلايا طبق زراعة الخلايا (100 مم)صقر الصقر353003
صحن بتري لزراعة الخلايا (100 مم)قطرات Corning351029معلقة
24 بئر لوحةGreiner Bio-One6621602D EBs
6-well لوحةEppendorf30720113Transfection
أنبوب الطرد المركزي الداكن 1.5 ملCelltreat Scientific Products229437RA محلول
مخزون المجهر غطاءزجاجي Fisherbrand12-545-80، قطر 12 مم
شرائح مجهر Superfrost-plusFisherbrand12-550-15
طقم ثقافة الكولاجين ثلاثي الأبعادEMD MilliporeECM675ثقافة 3D
كاشف Transfection EffecteneQiagen301427تعداء الخلايا الجذعية
Microcon   ؛ مرشحات الطرد المركزي (10 كيلو دالتون)EMD MilliporeMRCPRT010تركيز البروتين
<قوي>الاسم  < / strong>Company Catalog NumberComments
Recodes
DMEMLonza12-709FMEFs culture
IMDMGibco12440-046ESCs
مصل الأبقار الجنيني (FBS)EMD MilliporeES-009-BESCs ثقافة
الجيلاتينسيجما ألدريتشG2625طلاء الأطباق
LIFR & D Systems8878-LF-025للحفاظ على ESC متعددة القدرات
MEM حلول الأحماض الأمينية غير الأساسيةGibco11140050زراعة الخلايا
2-MercaptoethanolGibco21985023 زراعة الخلايا
البنسلين الستربتومايسينGibco15140122 زراعة الخلايا
GentamicinGibco15750060زراعة الخلايا
MycoZap Plus-PRLonzaVZA-2022زراعة الخلايا
0.25٪ Trypsin-EDTAGibco25200-072زراعة الخلايا
DMSOSigma-AldrichD2650
حمض الريتينويك المتعدد الترانسسيجما-ألدريتشR2625-50MGتحريض التمايز العصبي
ألبومين مصل الأبقارسيجما-ألدريتشA7030-50Gحجب وتخفيف الأجسام المضادة 
Triton X-100Sigma-AldrichT8787-100MLنفاذية غشاء
Corning352360
إطالة كاشف الذهب المضاد للبهتان مع DAPILife Tech.P36931كاشف التركيب
16٪ بارافورمالدهايد   ؛علوم المجهر الإلكتروني15710تثبيت الخلايا
فيبرونيكتينR & D Systems1030-FNطلاء
الأطباق PBSGibco10010049
كولاجيناز النوع الأولWorthington Biochem. CorpLS004196EB dissociation
Name  < / strong>Company< / strong> Catalog Number< / strong>Comments< strong>
Primary Antibodies< / strong>
Nestin (Rat-401)SantaCruz Biotechsc-33677الكشف عن التمايز العصبي
Oct4سانتا كروز Biotechsc-5279الكشف عن التمايز العصبي
NanogBethyl LaboratoriesA300-398Aالكشف عن التمايز العصبي
Sox2Cell Signaling3579الكشف عن التمايز العصبي
Tubulin b3 (AA10) SantaCruz Biotechsc-80016الكشف عن التمايز العصبي
<قوي>الاسم  < / strong > Company < / strong > Catalog Number < / strong > Comments < / strong >
الأجسام المضادة الثانوية < / strong >
donkey anti-mouse - Alexa555Life Tech.A31570الحمار المناعي
المضاد للفأر-Alexa488 لايف تك.A21202التألق المناعي
<قوي>الاسم  < / strong>Company< / strong> Catalog NumberComments
Instruments
Wide-field مجهرنيكونEclipse TS100تصوير ثقافة الخلايا
مجهر متحد البؤرنيكونC2تصوير التألق المناعي
زراعة دائري مصفاة خلية الخلية

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hopfl, G., Gassmann, M., Desbaillets, I. Differentiating embryonic stem cells into embryoid bodies. Methods Mol Biol. 254, 79-98 (2004).
  2. Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers. Mol Med. 6 (2), 88-95 (2000).
  3. Dang, S. M., Kyba, M., Perlingeiro, R., Daley, G. Q., Zandstra, P. W. Efficiency of embryoid body formation and hematopoietic development from embryonic stem cells in different culture systems. Biotechnol Bioeng. 78 (4), 442-453 (2002).
  4. Johansson, S., Svineng, G., Wennerberg, K., Armulik, A., Lohikangas, L. Fibronectin-integrin interactions. Front Biosci. 2, d126-d146 (1997).
  5. Blumberg, B. An essential role for retinoid signaling in anteroposterior neural specification and neuronal differentiation. Semin Cell Dev Biol. 8 (4), 417-428 (1997).
  6. Ross, S. A., McCaffery, P. J., Drager, U. C., De Luca, L. M. Retinoids in embryonal development. Physiol Rev. 80 (3), 1021-1054 (2000).
  7. Bain, G., Ray, W. J., Yao, M., Gottlieb, D. I. Retinoic acid promotes neural and represses mesodermal gene expression in mouse embryonic stem cells in culture. Biochem Biophys Res Commun. 223 (3), 691-694 (1996).
  8. Okada, Y., Shimazaki, T., Sobue, G., Okano, H. Retinoic-acid-concentration-dependent acquisition of neural cell identity during in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells. Dev Biol. 275 (1), 124-142 (2004).
  9. Duester, G. Retinoic acid synthesis and signaling during early organogenesis. Cell. 134 (6), 921-931 (2008).
  10. Niederreither, K., Dolle, P. Retinoic acid in development: towards an integrated view. Nat Rev Genet. 9 (7), 541-553 (2008).
  11. Maden, M. Retinoic acid in the development, regeneration and maintenance of the nervous system. Nat Rev Neurosci. 8 (10), 755-765 (2007).
  12. Sheng, N., et al. Retinoic acid regulates bone morphogenic protein signal duration by promoting the degradation of phosphorylated Smad1. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (44), 18886-18891 (2010).
  13. Gajovic, S., St-Onge, L., Yokota, Y., Gruss, P. Retinoic acid mediates Pax6 expression during in vitro differentiation of embryonic stem cells. Differentiation. 62 (4), 187-192 (1997).
  14. Dong, D., Ruuska, S. E., Levinthal, D. J., Noy, N. Distinct roles for cellular retinoic acid-binding proteins I and II in regulating signaling by retinoic acid. J Biol Chem. 274 (34), 23695-23698 (1999).
  15. Sessler, R. J., Noy, N. A ligand-activated nuclear localization signal in cellular retinoic acid binding protein-II. Mol Cell. 18 (3), 343-353 (2005).
  16. Tang, S., et al. SIRT1-Mediated Deacetylation of CRABPII Regulates Cellular Retinoic Acid Signaling and Modulates Embryonic Stem Cell Differentiation. Mol Cell. 55 (6), 843-855 (2014).
  17. Yang, J., et al. RhoA inhibits neural differentiation in murine stem cells through multiple mechanisms. Sci Signal. 9 (438), ra76(2016).
  18. Garnaas, M. K., et al. Syx, a RhoA guanine exchange factor, is essential for angiogenesis in Vivo. Circ Res. 103 (7), 710-716 (2008).
  19. Chou, Y. H., Khuon, S., Herrmann, H., Goldman, R. D. Nestin promotes the phosphorylation-dependent disassembly of vimentin intermediate filaments during mitosis. Mol Biol Cell. 14 (4), 1468-1478 (2003).
  20. Arai, T., Matsumoto, G. Subcellular localization of functionally differentiated microtubules in squid neurons: regional distribution of microtubule-associated proteins and beta-tubulin isotypes. J Neurochem. 51 (6), 1825-1838 (1988).
  21. Arnhold, S., Klein, H., Semkova, I., Addicks, K., Schraermeyer, U. Neurally selected embryonic stem cells induce tumor formation after long-term survival following engraftment into the subretinal space. Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (12), 4251-4255 (2004).
  22. Liu, Y., et al. Retinoic acid receptor beta mediates the growth-inhibitory effect of retinoic acid by promoting apoptosis in human breast cancer cells. Mol Cell Biol. 16 (3), 1138-1149 (1996).
  23. Altucci, L., et al. Retinoic acid-induced apoptosis in leukemia cells is mediated by paracrine action of tumor-selective death ligand TRAIL. Nat Med. 7 (6), 680-686 (2001).
  24. Pettersson, F., Dalgleish, A. G., Bissonnette, R. P., Colston, K. W. Retinoids cause apoptosis in pancreatic cancer cells via activation of RAR-gamma and altered expression of Bcl-2/Bax. Br J Cancer. 87 (5), 555-561 (2002).
  25. Kothapalli, C. R., Kamm, R. D. 3D matrix microenvironment for targeted differentiation of embryonic stem cells into neural and glial lineages. Biomaterials. 34 (25), 5995-6007 (2013).
  26. Cai, J., et al. BMP and TGF-beta pathway mediators are critical upstream regulators of Wnt signaling during midbrain dopamine differentiation in human pluripotent stem cells. Dev Biol. 376 (1), 62-73 (2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة