LERLIC-MS / MS للمتعمقة توصيف والكمي لالجلوتامين والهليونين نزع الأميد في البندقية البروتيوميات

Xavier Gallart-Palau; Aida Serra; Siu Kwan Sze

doi:10.3791/55626

Method Article

LERLIC-MS / MS للمتعمقة توصيف والكمي لالجلوتامين والهليونين نزع الأميد في البندقية البروتيوميات

DOI:

10.3791/55626

⸱

April 9th, 2017

Xavier Gallart-Palau*¹ , Aida Serra*¹ , Siu Kwan Sze¹

¹Division of Structural Biology and Biochemistry, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا نقدم بروتوكول خطوة بخطوة من طول فترة طويلة للكهرباء-التنافر ماء التفاعل اللوني، جنبا إلى جنب قياس الطيف الكتلي (LERLIC-MS / MS) الأسلوب. هذا هو منهجية جديدة تمكن لتقدير مرة الأولى، وتوصيف الجلوتامين والأسباراجين الإسوية نزع الأميد من البروتينات طلقات نارية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توصيف نزع الأميد البروتين لا بد من فك دور (ق) وإمكانات هذا البروتين posttranslational تعديل (PTM) في علم الأمراض البشرية وغيرها من السياقات البيوكيميائية. من أجل أداء توصيف نزع الأميد البروتين، وقد وضعنا مؤخرا رواية طويل طول كهرباء-التنافر ماء التفاعل اللوني، جنبا إلى جنب الطيف الكتلي (LERLIC-MS / MS) الطريقة التي يمكن فصل الجلوتامين (GLN) والهليونين (الأسباراجين) شكل الإسوي منتجات نزع الأميد من المركبات نموذج لعينات بيولوجية معقدة للغاية. LERLIC-MS / MS هو، وبالتالي فإن أول استراتيجية البروتينات بندقية لفصل وتقدير من الأشكال الإسوية نزع الأميد GLN. علينا أن نبرهن أيضا، والجدة، أن البروتوكول تجهيز العينات المذكورة هنا تستقر succinimide سيطة السماح توصيف من خلال LERLIC-MS / MS. تطبيق LERLIC-MS / MS كما هو موضح في هذه المقالة الفيديو يمكن أن تساعد على توضيح أونكنوو حالياالمصفوفات ن الجزيئية لنزع الأميد البروتين. بالإضافة إلى ذلك، يوفر LERLIC-MS / MS مزيد من فهم التفاعلات الأنزيمية التي تشمل نزع الأميد في الخلفيات البيولوجية متميزة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نزع الأميد هو تعديل البروتين posttranslational (PTM) الذي يقدم شحنة سالبة إلى العمود الفقري البروتين من خلال تعديل الهليونين (الأسباراجين) و / أو الجلوتامين (GLN) بقايا ^1. هذا التعديل في حين تؤثر بقايا الأسباراجين يولد المنتجات ايزوميريا حمض isoaspartic (isoAsp) و n حمض -aspartic (الحية) في المشترك 3: نسبة ² 1. وعلى الرغم من أن هذه النسبة يمكن أن تتغير من خلال تدخل انزيم اصلاح-L isoaspartyl ناقلة الميثيل (PIMT) ^{^3،} ^4. وبالمثل، نزع الأميد من بقايا GLN يولد الأحماض ايزوميريا جاما الجلوتاميك (γ-غلو) والأشكال الإسوية ح....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. التعبئة وطول طويل أنيون الصرف (LAX) شعري العمود

(ملاحظة: على الرغم من أن العمود LAX يمكن أن يكون في المنزل معبأة كما وصفنا في هذا البروتوكول، والأعمدة LAX كما تتوفر تجاريا، انظر الجدول المواد والكواشف لمزيد من التفاصيل).

تعليق 50 ملغ من ضعف مواد التعبئة والتغليف الصرف أنيون في 3.5 مل من التعبئة عازلة (الجدول 1) لتحضير الطين.
تجميع نهاية العمود الشعري (طول 50 سم - 200 ميكرون قط....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويعتبر نزع الأميد من GLN والأسباراجين بقايا تعديل البروتين التنكسية (DPM) متورط في العديد من الأمراض المزمنة والقاتلة ^14. وقد ثبت أن هذا PTM يمكن التنبؤ دول نصف العمر والهادمة من الأجسام المضادة والجزيئات الأخرى في الجسم البشري والخلفيات البيولوجية مماثلة ^{^1،} ^15. أهمية نزع الأميد البروتين، في الواقع، يتجاوز السياق الطب الحيوي، وبالتالي هذا التعديل موجود في proteomes م.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذا الفيديو المقال نقدم بروتوكول خطوة بخطوة من LERLIC-MS / MS ^3، وهي طريقة لأداء توصيف معمقة وتحديد دقيق لمدى نزع الأميد البروتين والعمليات الأنزيمية المعنية على هذا التعديل البروتين. ويستند LERLIC-MS / MS على استخدام طول طويلة (50 سم) LAX وفقا لمبدأ كهرباء-التنافر ماء التفاعل اللوني (ERLIC) ^27. استخدام عمود طول المدى، كما هو مبين في دراستنا ^3، يزيد من إمكانات ERLIC إلى الببتيدات منفصلة وفقا لنقطة تساوي الك.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وكان هذا العمل في جزء بدعم من المنح المقدمة من سنغافورة وزارة التربية والتعليم (المستوى 2: منح ARC9 / 15)، مجلس البحوث الطبية الوطنية في سنغافورة (NMRC-OF-IRG-0003-2016)، وجامعة تايوان الوطنية، NHG بحوث الشيخوخة غرانت ( منحة ARG / 14017). ونود أن نعرب عن امتناننا وشكرنا خالص للدكتور أندرو ألبرت وفريق PolyLC لتوفير تتكرم لنا مع مواد التعبئة والتغليف التي جعلت ذلك ممكنا هذه الدراسة.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number
PolyCAT 3 & micro; م 100 - & أرينج; (المواد السائبة)	شركة PolyLC	طلب
عمود شعري طويل الطول للتبادل الأيوني 50 سم - 200 & م معرف	PolyLC Inc.	طلب
PEEKsil Tubing 1/16 "OD × 200 & micro; م معرف × 50 سم طول	SGE العلوم التحليلية تحت تراجان العلمية أستراليا ؛	620050
تركيب أنثى إلى أنثى لأنابيب OD 1/16 "OD	Upchurch Scientific	UPCHF-125
أنثى الجوز للميكروفيرول	Upchurch Scientific	UPCHP-416
Microferule	Upchurch Scientific	UPCHF-132
قنبلة ضغط NanoBaume	هندسة السوائل الغربية	SP-400
Shimadzu Prominence UFLC نظام	Shimadzu	Prominence UFLC
Bullet Blender	Next Advance	BBX24
أنابيب القفل الآمن	Eppendorf ؛	T9661-1000EA
حبات من الفولاذ المقاوم للصدأ. 0.9 &ndash ؛ 2.0 مم 1 رطل غير معقمة.	Next Advance	SSB14B
جهاز طرد مركزي على الطاولة	Hettich Zentrifugen	Rotina 380 R
القياسية القياسية الرقمية الساخنة الحمام ، 120VAC	PolyScience 8006 6L	8006A11B
Sep-pack c18 خرطوشة تحلية المياه 50 مجم	Waters	WAT020805
مكثف فراغ	Eppendorf ؛	نظام المكثف الإضافي
Dionex UltiMate 3000 UHPLC	ديونيكس	UltiMate 3000 UHPLC
مطياف الكتلة Orbitrap Elite	Thermo Fisher Scientific Inc.	ORBITRAP ELITE
Michrom Thermo CaptiveSpray	شركة Michrom-Bruker	TCSI-SS2
حاضنة INCUCELL	MMM Group	INCUCELL111
	Promega	V5111
من الدرجة التسلسل Roche		11836170001 (ROCHE)
محلول عازلة للفوسفات 10x (مخفف إلى 1x)	Sigma-Aldrich	P5493
أسيتات الأمونيوم	سيجما ألدريتش	A1542
ديوكسيكولات الصوديوم	سيجما ألدريتش	D6750
ديثيوثريتول	سيجما ألدريتش	D0632
يودوأسيتاميد	سيجما ألدريتش	i6125
حمض الفورميك	سيجما ألدريتش	F0507 (هانيويل) هيدروكسيد
الأمونيوم	سيجما ألدريتش	338818 (هانيويل)
HPLC الصف	سيجما ألدريتش	675415
الأيزوبروبانول HPLC الصف	سيجما ألدريتش	675431
الماء HPLC الصف	سيجما ألدريتش	14263

خاصخاص أقراص كوكتيل مثبطات للبريتياز من التربسين المعدل أسيتونيتريل

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hao, P., Adav, S. S., Gallart-Palau, X., Sze, S. K. Recent advances in mass spectrometric analysis of protein deamidation. Mass Spectrom Rev. , (2016).
Geiger, T., Clarke, S. Deamidation, isomeri....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

LERLIC-MS / MS للمتعمقة توصيف والكمي لالجلوتامين والهليونين نزع الأميد في البندقية البروتيوميات

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles