هنا نقدم بروتوكول خطوة بخطوة من طول فترة طويلة للكهرباء-التنافر ماء التفاعل اللوني، جنبا إلى جنب قياس الطيف الكتلي (LERLIC-MS / MS) الأسلوب. هذا هو منهجية جديدة تمكن لتقدير مرة الأولى، وتوصيف الجلوتامين والأسباراجين الإسوية نزع الأميد من البروتينات طلقات نارية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
LERLIC-MS / MS للمتعمقة توصيف والكمي لالجلوتامين والهليونين نزع الأميد في البندقية البروتيوميات
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
توصيف نزع الأميد البروتين لا بد من فك دور (ق) وإمكانات هذا البروتين posttranslational تعديل (PTM) في علم الأمراض البشرية وغيرها من السياقات البيوكيميائية. من أجل أداء توصيف نزع الأميد البروتين، وقد وضعنا مؤخرا رواية طويل طول كهرباء-التنافر ماء التفاعل اللوني، جنبا إلى جنب الطيف الكتلي (LERLIC-MS / MS) الطريقة التي يمكن فصل الجلوتامين (GLN) والهليونين (الأسباراجين) شكل الإسوي منتجات نزع الأميد من المركبات نموذج لعينات بيولوجية معقدة للغاية. LERLIC-MS / MS هو، وبالتالي فإن أول استراتيجية البروتينات بندقية لفصل وتقدير من الأشكال الإسوية نزع الأميد GLN. علينا أن نبرهن أيضا، والجدة، أن البروتوكول تجهيز العينات المذكورة هنا تستقر succinimide سيطة السماح توصيف من خلال LERLIC-MS / MS. تطبيق LERLIC-MS / MS كما هو موضح في هذه المقالة الفيديو يمكن أن تساعد على توضيح أونكنوو حالياالمصفوفات ن الجزيئية لنزع الأميد البروتين. بالإضافة إلى ذلك، يوفر LERLIC-MS / MS مزيد من فهم التفاعلات الأنزيمية التي تشمل نزع الأميد في الخلفيات البيولوجية متميزة.
المقدمة
نزع الأميد هو تعديل البروتين posttranslational (PTM) الذي يقدم شحنة سالبة إلى العمود الفقري البروتين من خلال تعديل الهليونين (الأسباراجين) و / أو الجلوتامين (GLN) بقايا 1. هذا التعديل في حين تؤثر بقايا الأسباراجين يولد المنتجات ايزوميريا حمض isoaspartic (isoAsp) و n حمض -aspartic (الحية) في المشترك 3: نسبة 2 1. وعلى الرغم من أن هذه النسبة يمكن أن تتغير من خلال تدخل انزيم اصلاح-L isoaspartyl ناقلة الميثيل (PIMT) 3، 4. وبالمثل، نزع الأميد من بقايا GLN يولد الأحماض ايزوميريا جاما الجلوتاميك (γ-غلو) والأشكال الإسوية ح....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. التعبئة وطول طويل أنيون الصرف (LAX) شعري العمود
(ملاحظة: على الرغم من أن العمود LAX يمكن أن يكون في المنزل معبأة كما وصفنا في هذا البروتوكول، والأعمدة LAX كما تتوفر تجاريا، انظر الجدول المواد والكواشف لمزيد من التفاصيل).
- تعليق 50 ملغ من ضعف مواد التعبئة والتغليف الصرف أنيون في 3.5 مل من التعبئة عازلة (الجدول 1) لتحضير الطين.
- تجميع نهاية العمود الشعري (طول 50 سم - 200 ميكرون قط....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
ويعتبر نزع الأميد من GLN والأسباراجين بقايا تعديل البروتين التنكسية (DPM) متورط في العديد من الأمراض المزمنة والقاتلة 14. وقد ثبت أن هذا PTM يمكن التنبؤ دول نصف العمر والهادمة من الأجسام المضادة والجزيئات الأخرى في الجسم البشري والخلفيات البيولوجية مماثلة 1، 15. أهمية نزع الأميد البروتين، في الواقع، يتجاوز السياق الطب الحيوي، وبالتالي هذا التعديل موجود في proteomes م.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
في هذا الفيديو المقال نقدم بروتوكول خطوة بخطوة من LERLIC-MS / MS 3، وهي طريقة لأداء توصيف معمقة وتحديد دقيق لمدى نزع الأميد البروتين والعمليات الأنزيمية المعنية على هذا التعديل البروتين. ويستند LERLIC-MS / MS على استخدام طول طويلة (50 سم) LAX وفقا لمبدأ كهرباء-التنافر ماء التفاعل اللوني (ERLIC) 27. استخدام عمود طول المدى، كما هو مبين في دراستنا 3، يزيد من إمكانات ERLIC إلى الببتيدات منفصلة وفقا لنقطة تساوي الك.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
شكر وتقدير
وكان هذا العمل في جزء بدعم من المنح المقدمة من سنغافورة وزارة التربية والتعليم (المستوى 2: منح ARC9 / 15)، مجلس البحوث الطبية الوطنية في سنغافورة (NMRC-OF-IRG-0003-2016)، وجامعة تايوان الوطنية، NHG بحوث الشيخوخة غرانت ( منحة ARG / 14017). ونود أن نعرب عن امتناننا وشكرنا خالص للدكتور أندرو ألبرت وفريق PolyLC لتوفير تتكرم لنا مع مواد التعبئة والتغليف التي جعلت ذلك ممكنا هذه الدراسة.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| PolyCAT 3 & micro; م 100 - & أرينج; (المواد السائبة) | شركة PolyLC | طلب | |
| عمود شعري طويل الطول للتبادل الأيوني 50 سم - 200 & م معرف | PolyLC Inc. | طلب | |
| PEEKsil Tubing 1/16 "OD × 200 & micro; م معرف × 50 سم طول | SGE العلوم التحليلية تحت تراجان العلمية أستراليا ؛ | 620050 | |
| تركيب أنثى إلى أنثى لأنابيب OD 1/16 "OD | Upchurch Scientific | UPCHF-125 | |
| أنثى الجوز للميكروفيرول | Upchurch Scientific | UPCHP-416 | |
| Microferule | Upchurch Scientific | UPCHF-132 | |
| قنبلة ضغط NanoBaume | هندسة السوائل الغربية | SP-400 | |
| Shimadzu Prominence UFLC نظام | Shimadzu | Prominence UFLC | |
| Bullet Blender | Next Advance | BBX24 | |
| أنابيب القفل الآمن | Eppendorf ؛ | T9661-1000EA | |
| حبات من الفولاذ المقاوم للصدأ. 0.9 &ndash ؛ 2.0 مم 1 رطل غير معقمة. | Next Advance | SSB14B | |
| جهاز طرد مركزي على الطاولة | Hettich Zentrifugen | Rotina 380 R | |
| القياسية القياسية الرقمية الساخنة الحمام ، 120VAC | PolyScience 8006 6L | 8006A11B | |
| Sep-pack c18 خرطوشة تحلية المياه 50 مجم | Waters | WAT020805 | |
| مكثف فراغ | Eppendorf ؛ | نظام المكثف الإضافي | |
| Dionex UltiMate 3000 UHPLC | ديونيكس | UltiMate 3000 UHPLC | |
| مطياف الكتلة Orbitrap Elite | Thermo Fisher Scientific Inc. | ORBITRAP ELITE | |
| Michrom Thermo CaptiveSpray | شركة Michrom-Bruker | TCSI-SS2 | |
| حاضنة INCUCELL | MMM Group | INCUCELL111 | |
| Promega | V5111 | ||
| من الدرجة التسلسل Roche | 11836170001 (ROCHE) | ||
| محلول عازلة للفوسفات 10x (مخفف إلى 1x) | Sigma-Aldrich | P5493 | |
| أسيتات الأمونيوم | سيجما ألدريتش | A1542 | |
| ديوكسيكولات الصوديوم | سيجما ألدريتش | D6750 | |
| ديثيوثريتول | سيجما ألدريتش | D0632 | |
| يودوأسيتاميد | سيجما ألدريتش | i6125 | |
| حمض الفورميك | سيجما ألدريتش | F0507 (هانيويل) هيدروكسيد | |
| الأمونيوم | سيجما ألدريتش | 338818 (هانيويل) | |
| HPLC الصف | سيجما ألدريتش | 675415 | |
| الأيزوبروبانول HPLC الصف | سيجما ألدريتش | 675431 | |
| الماء HPLC الصف | سيجما ألدريتش | 14263 |
المراجع
- Hao, P., Adav, S. S., Gallart-Palau, X., Sze, S. K. Recent advances in mass spectrometric analysis of protein deamidation. Mass Spectrom Rev. , (2016).
- Geiger, T., Clarke, S. Deamidation, isomeri....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
