ويرد بروتوكول لإنتاج الحمض الريبي النووي النقال (وو) وتحليل الحمض الريبي النووي النقال (ووو) في مجمع مع تسدا انزيم من قبل الاغاروز فحوصات التخلف هلام.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
البروتين الحمض الريبي النووي النقال - أغروز فحوصات جل التخلف عن تحليل
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
علينا أن نظهر أساليب للتعبير وتنقية الحمض الريبي النووي النقال (أوو) في الإشريكية القولونية والتحليل من خلال المقايسات التخلف هلام من ربط الحمض الريبي النووي النقال (أوو) إلى تسدا، و N 6 -threonylcarbamoyladenosine (ر 6 A) ديهيدراتاس، الذي سيكليزس ثريونيلكاربامويل سلسلة جانبية تعلق على A37 في حلقة الجذعية أنتيكودون (أسل) من ترناس إلى دوري T 6 A (كت 6 A). ويتسبب النسخ من ترميز الحمض الريبي النووي النقال ترميز الحمض النووي الريبي (أوو) في E. القولونية مع 1 ملي الآيزوبروبيل β-D-1-ثيوغالاكتوبيرانوسيد (إيبت) ويتم حصاد الخلايا التي تحتوي على الحمض الريبي النووي النقال 24 ساعة بعد الاستقراء. يتم تنقية جزء الحمض النووي الريبي باستخدام طريقة استخراج الفينول حمض. يتم الحصول على الحمض الريبي النووي النقال النقي من قبل اللوني الترشيح هلام أن يفصل بكفاءة الجزيئات الحمض الريبي النووي النقال صغيرة الحجم من أكبر الأحماض النووية سليمة أو مجزأة. لتحليل تسدا ملزمة ل الحمض الريبي النووي النقال (وو)، يتم خلط تسدا مع الحمض الريبي النووي النقال (وو) وفصلها على هلام الاغاروز الأصلي في 4 درجات مئوية.الحمض الريبي النووي النقال مجانا (وو) يهاجر بشكل أسرع، في حين أن المجمعات تسدا-ترنا (وو) تخضع للتخلف التنقل التي يمكن ملاحظتها عند تلطيخ هلام. علينا أن نظهر أن تسدا هو الحمض الريبي النووي النقال (وو) - انزيم ملزمة. هذا الفحص هلام التخلف يمكن استخدامها لدراسة المسوخ تسدا وآثار الإضافات والبروتينات الأخرى على ملزمة.
المقدمة
اختبار التخثر هلام 1 (المعروف أيضا باسم التحولات الكهربي التحول التحول، إمزا) هو طريقة إليكتروفوريتيك مصممة لدراسة وتوصيف التفاعلات حمض البروتين النووي. فإنه يسمح لتحليل البروتين الحمض النووي، فضلا عن التفاعلات البروتين رنا وعلى وجه الخصوص، والتفاعلات بين الحمض الريبي النووي النقال والبروتينات ملزمة الحمض الريبي النووي النقال، وذلك باستخدام إما مكونات تنقية أو مخاليط معقدة من البروتينات (على سبيل المثال ، خلية لستيس) أو الأحماض النووية (على سبيل المثال ، الحمض الريبي النووي النقال حمامات). لقد قمنا بتطبيق مقايسات التخلف هلام لدراسة التفاعل بين الحمض الريبي النووي النقال المنقى (وو) و تسدا، و N 6- ثريونيلكاربامويلادينوسين (ر 6 A) ديهيدراتاز، الذي سيكليزس سلسلة جانبية ثريونيلكاربامويل تعلق على A37 في حلقة الجذعية أنتيكودون (أسل) من ترناس إلى دوري t 6 (ط 6 أ) 2 ، 3 . ومن المعروف أيضا تسدا كما سدل 3 ،f "> 4. يشكل الجين تسدا / كسدل كتلة مع جينات كسدا و كسد 5 ، التي ترميز ديسولفورياز السيستين والمتقبل الكبريت من سيستين سلفيناز ديسولفينات (كسد) النظام ومطلوب للحفاظ على وظيفة تكدا في الجسم الحي 3 .
الأساس المنطقي وراء المقايسات التخلف هلام هو أنه في حين أن جزيئات الحمض النووي الحرة تهاجر بسرعة إلى الجزء الأمامي من المواد الهلامية الأكريلاميد أو الاغاروز بحكم تهمة سلبية كبيرة، والتنقل الكهربي من المجمعات البروتين من نفس الأحماض النووية هو انخفاض كبير. يتم تصور الانخفاض في التنقل باعتباره "التحول" في المجمعات الحمض النووي البروتين، والتي حلت كما العصابات منفصلة. المشحونة إيجابيا وأكبر مجمع الحمض النووي البروتين تظهر زيادة التحول أو الحد في التنقل على هلام.
منذ تهمة تهمة المجمع هو ظاهرة عالميةلمجمعات حمض البروتين النووي، ويمكن تطبيق فحص التخثر هلام لمجموعة واسعة من المجمعات وأنواع الحمض النووي. طريقة بسيطة وغير مكلفة، ويمكن إجراءها في المختبرات مع الحد الأدنى من المعدات. فإنه يتطلب كميات صغيرة فقط من البروتينات والحمض النووي الريبي. وهذه ميزة على التقنيات الفيزيائية الحيوية البديلة التي تستهلك عادة كميات أكبر من العينة.
وقد استخدمت على نطاق واسع اختبار التخلف هلام لدراسة عوامل النسخ. وقد استخدمت مقايسة لتحليل حركية ملزمة، والقوة، وخصوصية عوامل النسخ للعديد من تسلسل الحمض النووي المختلفة. وكان في الواقع في هذا المجال أن إمسا وضعت لأول مرة 6 ، 7 . وقد استخدمت أيضا فحوصات التخلف هلام مع رنا 8 ، 9 ، 10 ، 11 والجزيئات الحمض الريبي النووي النقال في البحوث الريبوسوموتحليل، كما نفعل هنا، الإنزيمات التي تعدل نوكلأوسيدس الحمض الريبي النووي النقال بعد ترانسكريبتيونالي.
العديد من المعلمات المختلفة تؤثر على نتيجة لفحص هلام التخلف مثل درجة الحرارة، ونوعية البروتين وعينة الحمض الريبي النووي النقال، وقوة ملزمة. التخطيط الدقيق وتنفيذ التجربة أمر حاسم لتفسير نتائج الحمض النووي الحرة والأنواع المرتبطة بالبروتين. هنا، استخدمنا الجين الاصطناعية ترنا الحمض الريبي النووي النقال (أوو) المستنسخة في ناقلات التعبير الذي يفتقر المروج على شاين دالغارنو ريبوسوم موقع ملزم، مما يؤدي إلى تخليق كميات كبيرة من الحمض الريبي النووي النقال 2 . ويهدف هذا البروتوكول مفصل لتوفير دليل واضح لأداء الحمض النووي الريبي الحمض النووي الريبي التخلف التجارب مع تجنب الأخطاء الشائعة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تنبيه: استشر جميع صحائف بيانات سلامة المواد ذات الصلة (مسس) قبل الاستخدام. العديد من المواد الكيميائية المستخدمة في هذا البروتوكول هي سامة وتآكل. استخدام الممارسات المناسبة عند تنفيذ استخراج الحمض الريبي النووي النقال باستخدام الفينول، بما في ذلك استخدام غطاء الدخان ومعدات الحماية الشخصية (نظارات السلامة، والقفازات، معطف المختبر، والسراويل كامل طول، وأحذية مغلقة اصبع القدم، وما إلى ذلك ). يستخدم هذا البروتوكول وصمة عار الحمض النووي غير سامة. قد يتطلب استخدام البقع البديلة احتياطات إضافية والتخلص المتخصص من عامل تلطيخ إذا سامة و / أو مسرطنة (على سبيل المثال ، إيثيديوم بروميد).
1. إعداد أغاروس هلام
- تزن 2 غرام من الاغاروز وإضافته إلى زجاجة لإعداد 2٪ ث / الخامس الاغاروز هلام.
- إضافة 100 مل من 1X تريس-بورات-إثيلينديامينيتتراسيتيك حمض (إدتا) (تب) تشغيل عازلة إلى زجاجة تحتوي على الاغاروز. تذوب عن طريق التسخين في الميكروويف. على فترات 30 ثانية، دوامة محتويات لخلطجيدا وتكرار هذه الخطوة حتى يتم حل الاغاروز تماما. السماح حل الاغاروز يبرد إلى ما يقرب من 50-60 درجة مئوية.
- الشريط حواف مفتوحة من علبة هلام لخلق العفن، ووضع مشط مناسب لإنشاء الآبار ويلقي الاغاروز المنصهر في ذلك. تجنب تشكيل فقاعة والسماح لها ترسيخ في درجة حرارة الغرفة.
- مرة واحدة عزز، ضع علبة هلام في وحدة الكهربائي وملء مع تب العازلة حتى يتم تغطية هلام تماما.
2. إعداد الحمض الريبي النووي النقال
- التعبير عن الحمض الريبي النووي النقال (وو) في E. القولونية
- في الصباح، واستخدام قارورة من E.Coli القولونية BL21 (DE3) المجمدة تتحول مع ناقلات التعبير pET23d-إكوو 2 (المرافئ ترميز الجينات E. القولونية الحمض الريبي النووي النقال (ووو))، لخط منخفض الملح لوريا مرق (لب) لوحة تستكمل مع 100 ميكروغرام / مل أمبيسيلين. عكس لوحة ووضعه في حاضنة 37 درجة مئوية حتى تظهر المستعمرات (في وقت متأخر بعد الظهرأون).
- تطعيم واحدة نمت جيدا، مستعمرة واحدة في 5 مل لب بالإضافة إلى 100 ميكروغرام / مل أمبيسلين وتنمو بين عشية وضحاها في 220 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية.
- في صباح اليوم التالي، بيليه الخلايا (6،500 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية)، استبدال المتوسطة مع 5 مل لب الطازجة بالإضافة إلى 100 ميكروغرام / مل أمبيسيلين و ريسوسبيند. استخدام هذا التعليق لتطعيم 200 مل لب بالإضافة إلى 100 ميكروغرام / مل أمبيسيلين. تنمو لمدة 5 ساعات في 220 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية.
- عندما بلغت الكثافة البصرية للثقافة في 590 نانومتر (أود 590 ) 0.6 - 0.8، إضافة 1 ملي إيبت إلى الثقافة لتحريك التعبير عن الحمض الريبي النووي النقال (وو) الجينات. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 3 ساعات.
- حصاد الخلايا بواسطة الطرد المركزي الثقافة في 6،500 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية.
- تحلل واستخراج
- ريسوسبيند بيليه الخلية في 5 مل العازلة تحلل (0.3 M خلات الصوديوم، 10 ملي إدتا). من هذه النقطة فصاعدا، وتستخدم مخازن تعقيمها والحفاظ على جميع العينات التي تحتوي على الحمض الريبي النووي النقال عند 4 درجات مئوية لمنع تيتدهور الحمض النووي الريبي.
- إضافة 1 حجم الفينول حمض (الرقم الهيدروجيني 4.3) إلى بيليه الخلية معلق في غطاء الدخان. مزيج لمدة 1 دقيقة عن طريق عكس ل ليز الخلايا وأجهزة الطرد المركزي في 10،000 x ج (10 دقيقة، 4 درجات مئوية).
- جمع المرحلة المائية العليا التي تحتوي على الحمض الريبي النووي النقال ذوبان (وو) (وتركيزات أصغر من برك الحمض النووي الريبي الأخرى) باستخدام ماصة مع الحرص على عدم نضح المرحلة العضوية (القاع). تجاهل الطبقة السفلى وبيليه، والذي يتكون من المرحلة العضوية والحطام الخلية، في حاوية كافية.
- يعجل الحمض الريبي النووي النقال عن طريق خلط دقيق للذوبان (مائي) المرحلة مع 2.5 حجم 100٪ V / V الايثانول عن طريق انقلاب لمدة 1 ساعة عند 4 درجات مئوية. الطرد المركزي الخليط في 15،000 زغ (30 دقيقة، 4 درجات مئوية).
- صب طاف بعناية و ريسوسبيند بيليه الغنية الحمض الريبي النووي النقال في 4 مل العازلة الترشيح هلام (20 ملي فوسفات الصوديوم أو فوسفات البوتاسيوم، ودرجة الحموضة 7.4، 0.1 ملي إدتا). تشغيل 5 ميكرولتر من تجمع الحمض الريبي النووي النقال معلق على 2٪ ث / الخامس الاغاروز هلام.
ملحوظة:يظهر نوعية جيدة الحمض الريبي النووي النقال كما الفرقة واحدة (حجم الجزيئي بين 50-100 بي بي).
- تنقية الحمض الريبي النووي النقال (وو)
- بعد الممارسة الكروماتوغرافية القياسية 12 ، تحميل الحمض الريبي النووي النقال معلق (ووو) على عالية الدقة التحضير هلام الترشيح العمود (أبعاد: 16 × 600 مم، حجم السرير: 120 مل، نطاق القرار: 1،000-70،000 دا) سابقا معايرتها في العازلة الترشيح هلام (المرحلة المتنقلة). تعيين معدل التدفق إلى 1 مل / دقيقة إلى أزل العينات.
ملاحظة: الحمض الريبي النووي النقال (وو) الذروة إلوتس حوالي 75.5 مل. عادة، يمكن الحصول على العائد من 0.5-1.0 ملغ / لتر الحمض الريبي النووي النقال من الثقافة. - تحليل العينات في مجلدات شطف ممثل عن طريق إليكتروفوريسينغ 5-10 ميكرولتر من كل عينة على 2٪ ث / الخامس أغاروس هلام.
- بعد الممارسة الكروماتوغرافية القياسية 12 ، تحميل الحمض الريبي النووي النقال معلق (ووو) على عالية الدقة التحضير هلام الترشيح العمود (أبعاد: 16 × 600 مم، حجم السرير: 120 مل، نطاق القرار: 1،000-70،000 دا) سابقا معايرتها في العازلة الترشيح هلام (المرحلة المتنقلة). تعيين معدل التدفق إلى 1 مل / دقيقة إلى أزل العينات.
3. إعداد العينة
- اكسبرس وتنقية تكدا وفقا لوبيز-إستيبا وآخرون . 2 -
ملاحظة: ما يصل إلى 250 ميكرومترتسدا يمكن استخدامها للدراسة. - ماصة المبلغ المقابل من تكدا وفقا للجدول 1 في وصفها بشكل صحيح أنابيب 1.5 مل الطرد المركزي. إضافة 1.6 مم تريس (2-كاربوكسيثيل) الفوسفين (تسيب) (التركيز النهائي) وخلط بلطف باستخدام ماصة. إغلاق الغطاء واحتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
- إضافة 10 ميكرومتر من ثلاثي الفوسفات أدينوسين (أتب) و 50 ملي مغكل 2 (تركيزات النهائية). مزيج مع ماصة واحتضان الخليط لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- إضافة الحمض الريبي النووي النقال المنقى (أوو) (القسم 2.3) وفقا للجدول 1 ، مزيج مع ماصة واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
- إضافة الفوسفات مخزنة المالحة (بس) ما يصل إلى 100 ميكرولتر الحجم النهائي. مزيج بشكل صحيح وإضافة الجلسرين إلى تركيز النهائي من 10٪ الخامس / الخامس.
- دوامة العينة وتدور لفترة وجيزة أسفل محتويات الأنبوب (10،000 x ج، 1 دقيقة، 4 درجات مئوية).
4. جل تحميل والتنمية الكهربي
- مكان وحدة الكهربائي في علبة مليئة الجليد سحق للحفاظ على غرفة في 4 درجات مئوية خلال تشغيل الكهربائي.
- بعناية، ماصة 5 ميكرولتر من كل عينة في المقابلة جيدا. إضافة مناسبة حجم الحمض النووي علامة.
- توصيل الأقطاب في فتحات المقابلة من وحدة امدادات الطاقة. بدوره على وحدة امدادات الطاقة وضبط الجهد إلى 100 فولت وتشغيل هلام لمدة 90 دقيقة.
5. جل تلطيخ لمراقبة الحمض الريبي النووي النقال-البروتين التفاعل
- إعداد حل تلطيخ عن طريق خلط 50 مل من تب مع 1X من وصمة عار الحمض النووي المناسب. تجنب تعريض حل تلطيخ لأشعة الشمس من خلال تغطية حاوية تلطيخ مع رقائق الألومنيوم.
ملاحظة: عادة ما يتم تخزين البقع دنا كما 10،000 أو 20،000x الأسهم المركزة. - بعد 90 دقيقة من الكهربائي، وإزالة بعناية هلام من علبة ووضعه في وعاء مع حل تلطيخ. وضعه على الروك في انخفاض سرعة هزاز في غرفة تمبراتأور لمدة 30 دقيقة.
- إزالة هلام الاغاروز من حاوية تلطيخ، اضغط عليها بعناية على قطعة من الأنسجة السليلوز أو ورقة تصفية لإزالة السائل الزائد، ووضعه مباشرة على ترانزيلوميناتور. التبديل على ضوء الأشعة فوق البنفسجية لتصور العصابات التي تحتوي على الحمض الريبي النووي النقال. التقاط صورة من هلام.
- تلطيخ البروتين (اختياري).
- تجاهل حل تلطيخ الحمض النووي بأمان (وفقا لإجراءات السلامة) واستبدالها مع 50 مل كوماسي بريليانت الأزرق (كبب) الحل. وضع الدرج على الروك في درجة حرارة الغرفة وصمة عار بين عشية وضحاها (> 12 ساعة). تجاهل حل تلطيخ مصرف البحرين المركزي واستبدالها مع 50 مل برنامج تلفزيوني لإزالة الصبغة الزائدة. إزاحة لمدة 1 ساعة على الروك.
- تصور المجمعات التي تحتوي على البروتين الحمض الريبي النووي النقال التي تحتوي على ترانزيلوميناتور الضوء والتقاط صور من هلام للمقارنة مع الحمض الريبي النووي النقال الصورة هلام الأشعة فوق البنفسجية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
كميات كبيرة من الحمض الريبي النووي النقال (وو) يمكن الحصول عليها عن طريق التعبير عن الجينات الحمض الريبي النووي النقال في E. القولونية تحت سيطرة محفز T7 قوي محفز. الحمض الريبي النووي النقال أعرب (أوو) يتراكم في السيتوبلازم ويتم إثراء على بركة من الحمض الريبي النووي النقال وفيرة بشكل طبيعي. وقد تم استخدام عملية تنقية من خطوتين تتكون من خطوة التقاط / الاستخراج، والهلام الترشيح / خطوة تلميع للحصول على الحمض الريبي النووي النقال الصف إمزا. الخ...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
ويمكن تعديل البروتين الحمض الريبي النووي النقال الاغاروز مقايسة التخثر هلام وصفها هنا في عدد من الطرق. أولا، يمكن تخفيض نسبة الاغاروز في هلام للسماح للفصل والتصور من المجمعات البروتين الحمض الريبي النووي النقال أكبر بكثير من واحد تحليلها هنا (120 كيلو دالتون). ثانيا، إذا كان البروتين المستهدف هو ثيرمولابيل، يجب اتخاذ الاحتياطات الإضافية لضمان أن يتم الاحتفاظ درجة الحرارة تحت الحد الأقصى من درجة الحرارة المقبولة عن طريق تحريك جهاز الكهربائي إلى غرفة باردة أو باستخدام حزم الجليد داخ...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
شكر وتقدير
مكف هو عضو في برنامج سيب الداخلي "الآلات الجزيئية لحياة أفضل" (ماكبيت). وقد تلقت البحوث المؤدية إلى هذه النتائج تمويلا من المعهد الإسباني للسلود كارلوس الثالث (PI12 / 01667 إلى مكف)، والوزارة الإسبانية دي إكونوميا y كومبيتيتيفيداد (CTQ2015-66206-C2-2-R و SAF2015-72961-إكس إلى مكف )، والحكومة الإقليمية في مدريد (S2010 / بد-2316 إلى مكف)، والمفوضية الأوروبية (برنامج الإطار 7 (FP7)) كومبليكسينك (العقد رقم 279039 إلى مكف). ولم يكن للممولين دور في تصميم الدراسة، وجمع البيانات وتحليلها، أو قرار نشرها، أو إعداد المخطوطة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| الإشريكية القولونية < / em> BL21 (DE3) | Novagen | 70235 | DE3 lysogen يحتوي على بوليميراز T7 عند تحريض IPTG. |
| يمنح pET23d | Novagen | 69748-3 | pET23d مقاومة الأمبيسلين. مروج T7. |
| مرق LB ، قليل الملح (مرق لينوكس إل) ، | ميلفورد | GL1703 | التقليدي المحبب ، الملح العالي. |
| أمبيسلين | سيجما ألدريتش | 10419313 | |
| حاضنة شاكر (ترموستاتد) NBS | Excella E24 ؛ | يمكن استخدام أي حاضنة شاكر مع التحكم في درجة الحرارة. | |
| إيزوبروبيل بيتا دي ثيوجالاكتوبيرانوسيد (IPTG) ، > = 99٪ | أكروس أورجانكس | BP1755 | |
| أسيتات الصوديوم ، لا مائية ، >99٪ | ميلفورد | B4017 | |
| حمض إيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) ، ملح ثنائي الصوديوم ، >99٪ | أكروس أورجانيكس | AC327205000 | ضار إذا تم استنشاقه. |
| جهاز طرد مركزي (مبرد) | Eppendorf | 5430 | |
| طرد مركزي (مبرد) دوار | Eppendorf | 5430 / 5430P | |
| طرد مركزي | Sorvall | RC5C | |
| الدوار للطرد المركزي | محلول Sorvall | SLA-3000 | |
| Phenol ، مشبع بمحلول 0.1 متر سترات ، درجة الحموضة 4.3 & 0.2 | Sigma-Aldrich | P4682 | السمية الحادة (الفموية ، الجلدية ، الاستنشاق) ، |
| الإيثانول التآكل المطلق للتحليل ، 100٪ v / v | Merck Millipore | 100983 | |
| ثنائي هيدرات ثنائي القاعدة فوسفات الصوديوم ، Na2< / sub>HPO4< / sub> ، > = 99٪ | سيجما ألدريتش | 71643 | |
| فوسفات ثنائي هيدروجين البوتاسيوم ، KH2< / sub>PO4< / sub> | Merck | 48،730،250 | |
| هاي لود 16/60 سوبرديكس 75 ؛ | جنرال إلكتريك | للرعاية الصحية 28989333 | |
| Agarose | Melford | MB1200 | |
| Tris [تريس (هيدروكسي ميثيل) أمينوميثان HCl] | ميلفورد | T1513 | |
| حمض البوريك | ميلفورد | B0503 | |
| ميكروويف | هاير | HDA-2070M | |
| TCEP [تريس (2-كربوكسي إيثيل) هيدروكلوريد الفوسفين] | سيجما ألدريتش | C4706 | تآكل المعادن والجلد. |
| ATP [الأدينوزين 5 & رئيس ؛ -ثلاثي فوسفات هيدرات ملح الصوديوم] ، الدرجة الأولى ، > = 99٪ | سيجما ألدريتش | A2383 | |
| كلوريد المغنيسيوم (MgCl2< / sub>) ، لامائي ، > = 98٪ | سيجما ألدريتش | M8266 | |
| كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم) ، >99٪ | كواشف فيشر الحيوية | BP358 | |
| كلوريد البوتاسيوم (KCl) ، >99٪ | ميلفورد | P0515 | |
| NZYDNA سلم VI | NZYtech | MB8901 | |
| مزود الطاقة | وحدة | EV261 | |
| المختبر الحقيقي | RELSMINI10 | ||
| تلطيخ الحمض النووي الآمن | الحقيقي مختبر حقيقي | RBMSAFE | 20،000X مخزون |
| الأشعة فوق البنفسجية Transilluminator (G: Box / EF) | Syngene | 2216498 | |
| Coomassie Brilliant Blue G | Sigma-Aldrich | B0770 | |
| Rocker (Gyro-Rocker) | Stuart | SSL3 | |
| Mixer Vortex | 13214789 | ماركة فيشر |
المراجع
- Scott, V., Clark, A. R., Docherty, K. The gel retardation assay. Methods Mol Biol. 31, 339-347 (1994).
- López-Estepa, M., et al. The crystal structure and small-angle X-ray analysis of CsdL/TcdA reveal a new tRNA binding motif in the MoeB/E1 superfamily. Plos One. 10 (4), e0118606(2015).
- Miyauchi, K., Kimura, S., Suzuki, T. A cyclic form of N6-threonylcarbamoyladenosine as a widely distributed tRNA hypermodification. Nat Chem Biol. 9 (2), 105-111 (2013).
- Bolstad, H. M., Botelho, D. J., Wood, M. J. Proteomic analysis of protein-protein interactions within the Cysteine Sulfinate Desulfinase Fe-S cluster biogenesis system. J Proteome Res. 9 (10), 5358-5369 (2010).
- Loiseau, L., Ollagnier-de Choudens, S., Lascoux, D., Forest, E., Fontecave, M., Barras, F. Analysis of the heteromeric CsdA-CsdE cysteine desulfurase, assisting Fe-S cluster biogenesis in Escherichia coli. J Biol Chem. 280 (29), 26760-26769 (2005).
- Fried, M. G., Crothers, D. M. Equilibrium studies of the cyclic AMP receptor protein-DNA interaction. J Mol Biol. 172 (3), 241-262 (1984).
- Garner, M. M., Revzin, A. A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system. Nucleic Acids Res. 9 (13), 3047-3060 (1981).
- Rio, D. C. Electrophoretic mobility shift assays for RNA-protein complexes. Cold Spring Harb Protoc. 2014 (4), 435-440 (2014).
- Ryder, S. P., Recht, M. I., Williamson, J. R. Quantitative analysis of protein-RNA interactions by gel mobility shift. Methods Mol Biol. 488, 99-115 (2008).
- Yakhnin, A. V., Yakhnin, H., Babitzke, P. Gel mobility shift assays to detect protein-RNA interactions. Methods Mol Biol. 905, 201-211 (2012).
- Ream, J. A., Lewis, L. K., Lewis, K. A. Rapid agarose gel electrophoretic mobility shift assay for quantitating protein: RNA interactions. Anal Biochem. 511, 36-41 (2016).
- Hagel, L. Gel-filtration chromatography. Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 10, Unit 10.9 (2001).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
