ويرد بروتوكول لإنتاج الحمض الريبي النووي النقال (وو) وتحليل الحمض الريبي النووي النقال (ووو) في مجمع مع تسدا انزيم من قبل الاغاروز فحوصات التخلف هلام.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
البروتين الحمض الريبي النووي النقال - أغروز فحوصات جل التخلف عن تحليل
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
علينا أن نظهر أساليب للتعبير وتنقية الحمض الريبي النووي النقال (أوو) في الإشريكية القولونية والتحليل من خلال المقايسات التخلف هلام من ربط الحمض الريبي النووي النقال (أوو) إلى تسدا، و N 6 -threonylcarbamoyladenosine (ر 6 A) ديهيدراتاس، الذي سيكليزس ثريونيلكاربامويل سلسلة جانبية تعلق على A37 في حلقة الجذعية أنتيكودون (أسل) من ترناس إلى دوري T 6 A (كت 6 A). ويتسبب النسخ من ترميز الحمض الريبي النووي النقال ترميز الحمض النووي الريبي (أوو) في E. القولونية مع 1 ملي الآيزوبروبيل β-D-1-ثيوغالاكتوبيرانوسيد (إيبت) ويتم حصاد الخلايا التي تحتوي على الحمض الريبي النووي النقال 24 ساعة بعد الاستقراء. يتم تنقية جزء الحمض النووي الريبي باستخدام طريقة استخراج الفينول حمض. يتم الحصول على الحمض الريبي النووي النقال النقي من قبل اللوني الترشيح هلام أن يفصل بكفاءة الجزيئات الحمض الريبي النووي النقال صغيرة الحجم من أكبر الأحماض النووية سليمة أو مجزأة. لتحليل تسدا ملزمة ل الحمض الريبي النووي النقال (وو)، يتم خلط تسدا مع الحمض الريبي النووي النقال (وو) وفصلها على هلام الاغاروز الأصلي في 4 درجات مئوية.الحمض الريبي النووي النقال مجانا (وو) يهاجر بشكل أسرع، في حين أن المجمعات تسدا-ترنا (وو) تخضع للتخلف التنقل التي يمكن ملاحظتها عند تلطيخ هلام. علينا أن نظهر أن تسدا هو الحمض الريبي النووي النقال (وو) - انزيم ملزمة. هذا الفحص هلام التخلف يمكن استخدامها لدراسة المسوخ تسدا وآثار الإضافات والبروتينات الأخرى على ملزمة.
المقدمة
اختبار التخثر هلام 1 (المعروف أيضا باسم التحولات الكهربي التحول التحول، إمزا) هو طريقة إليكتروفوريتيك مصممة لدراسة وتوصيف التفاعلات حمض البروتين النووي. فإنه يسمح لتحليل البروتين الحمض النووي، فضلا عن التفاعلات البروتين رنا وعلى وجه الخصوص، والتفاعلات بين الحمض الريبي النووي النقال والبروتينات ملزمة الحمض الريبي النووي النقال، وذلك باستخدام إما مكونات تنقية أو مخاليط معقدة من البروتينات (على سبيل المثال ، خلية لستيس) أو الأحماض النووية (على سبيل المثال ، الحمض الريبي النووي النقال حمامات). لقد قمنا بتطبيق مقايسات التخلف هلام لدراسة التفاعل بين الحمض الريبي النووي النقال المنقى (وو....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تنبيه: استشر جميع صحائف بيانات سلامة المواد ذات الصلة (مسس) قبل الاستخدام. العديد من المواد الكيميائية المستخدمة في هذا البروتوكول هي سامة وتآكل. استخدام الممارسات المناسبة عند تنفيذ استخراج الحمض الريبي النووي النقال باستخدام الفينول، بما في ذلك استخدام غطاء الدخان ومعدات الحماية الشخصية (نظارات السلامة، والقفازات، معطف المختبر، والسراويل كامل طول، وأحذية مغلقة اصبع القدم، وما إلى ذلك ). يستخدم هذا البروتوكول وصمة عار الحمض النووي غير سامة. قد يتطلب استخدام البقع البديلة احتياطات إضافية والتخلص المتخصص من عامل تلطيخ إذا سامة و / أو مسرطنة (على سبيل المثال ، إيثيديوم بروميد).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
كميات كبيرة من الحمض الريبي النووي النقال (وو) يمكن الحصول عليها عن طريق التعبير عن الجينات الحمض الريبي النووي النقال في E. القولونية تحت سيطرة محفز T7 قوي محفز. الحمض الريبي النووي النقال أعرب (أوو) يتراكم في السيتوبلازم ويتم إثراء على بركة من الحمض الريبي النووي النقال وفيرة بشكل طبيعي. وقد تم استخدام عملية تنقية من خطوتين تتكون من خطوة التقاط / الاستخراج، والهلام الترشيح / خطوة تلميع للحصول على الحمض الريبي النووي النقال الصف إمزا. الخ.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
ويمكن تعديل البروتين الحمض الريبي النووي النقال الاغاروز مقايسة التخثر هلام وصفها هنا في عدد من الطرق. أولا، يمكن تخفيض نسبة الاغاروز في هلام للسماح للفصل والتصور من المجمعات البروتين الحمض الريبي النووي النقال أكبر بكثير من واحد تحليلها هنا (120 كيلو دالتون). ثانيا، إذا كان البروتين المستهدف هو ثيرمولابيل، يجب اتخاذ الاحتياطات الإضافية لضمان أن يتم الاحتفاظ درجة الحرارة تحت الحد الأقصى من درجة الحرارة المقبولة عن طريق تحريك جهاز الكهربائي إلى غرفة باردة أو باستخدام حزم الجليد داخ.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
شكر وتقدير
مكف هو عضو في برنامج سيب الداخلي "الآلات الجزيئية لحياة أفضل" (ماكبيت). وقد تلقت البحوث المؤدية إلى هذه النتائج تمويلا من المعهد الإسباني للسلود كارلوس الثالث (PI12 / 01667 إلى مكف)، والوزارة الإسبانية دي إكونوميا y كومبيتيتيفيداد (CTQ2015-66206-C2-2-R و SAF2015-72961-إكس إلى مكف )، والحكومة الإقليمية في مدريد (S2010 / بد-2316 إلى مكف)، والمفوضية الأوروبية (برنامج الإطار 7 (FP7)) كومبليكسينك (العقد رقم 279039 إلى مكف). ولم يكن للممولين دور في تصميم الدراسة، وجمع البيانات وتحليلها، أو قرار نشرها، أو إعداد المخطوطة.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| الإشريكية القولونية < / em> BL21 (DE3) | Novagen | 70235 | DE3 lysogen يحتوي على بوليميراز T7 عند تحريض IPTG. |
| يمنح pET23d | Novagen | 69748-3 | pET23d مقاومة الأمبيسلين. مروج T7. |
| مرق LB ، قليل الملح (مرق لينوكس إل) ، | ميلفورد | GL1703 | التقليدي المحبب ، الملح العالي. |
| أمبيسلين | سيجما ألدريتش | 10419313 | |
| حاضنة شاكر (ترموستاتد) NBS | Excella E24 ؛ | يمكن استخدام أي حاضنة شاكر مع التحكم في درجة الحرارة. | |
| إيزوبروبيل بيتا دي ثيوجالاكتوبيرانوسيد (IPTG) ، > = 99٪ | أكروس أورجانكس | BP1755 | |
| أسيتات الصوديوم ، لا مائية ، >99٪ | ميلفورد | B4017 | |
| حمض إيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) ، ملح ثنائي الصوديوم ، >99٪ | أكروس أورجانيكس | AC327205000 | ضار إذا تم استنشاقه. |
| جهاز طرد مركزي (مبرد) | Eppendorf | 5430 | |
| طرد مركزي (مبرد) دوار | Eppendorf | 5430 / 5430P | |
| طرد مركزي | Sorvall | RC5C | |
| الدوار للطرد المركزي | محلول Sorvall | SLA-3000 | |
| Phenol ، مشبع بمحلول 0.1 متر سترات ، درجة الحموضة 4.3 & 0.2 | Sigma-Aldrich | P4682 | السمية الحادة (الفموية ، الجلدية ، الاستنشاق) ، |
| الإيثانول التآكل المطلق للتحليل ، 100٪ v / v | Merck Millipore | 100983 | |
| ثنائي هيدرات ثنائي القاعدة فوسفات الصوديوم ، Na2< / sub>HPO4< / sub> ، > = 99٪ | سيجما ألدريتش | 71643 | |
| فوسفات ثنائي هيدروجين البوتاسيوم ، KH2< / sub>PO4< / sub> | Merck | 48،730،250 | |
| هاي لود 16/60 سوبرديكس 75 ؛ | جنرال إلكتريك | للرعاية الصحية 28989333 | |
| Agarose | Melford | MB1200 | |
| Tris [تريس (هيدروكسي ميثيل) أمينوميثان HCl] | ميلفورد | T1513 | |
| حمض البوريك | ميلفورد | B0503 | |
| ميكروويف | هاير | HDA-2070M | |
| TCEP [تريس (2-كربوكسي إيثيل) هيدروكلوريد الفوسفين] | سيجما ألدريتش | C4706 | تآكل المعادن والجلد. |
| ATP [الأدينوزين 5 & رئيس ؛ -ثلاثي فوسفات هيدرات ملح الصوديوم] ، الدرجة الأولى ، > = 99٪ | سيجما ألدريتش | A2383 | |
| كلوريد المغنيسيوم (MgCl2< / sub>) ، لامائي ، > = 98٪ | سيجما ألدريتش | M8266 | |
| كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم) ، >99٪ | كواشف فيشر الحيوية | BP358 | |
| كلوريد البوتاسيوم (KCl) ، >99٪ | ميلفورد | P0515 | |
| NZYDNA سلم VI | NZYtech | MB8901 | |
| مزود الطاقة | وحدة | EV261 | |
| المختبر الحقيقي | RELSMINI10 | ||
| تلطيخ الحمض النووي الآمن | الحقيقي مختبر حقيقي | RBMSAFE | 20،000X مخزون |
| الأشعة فوق البنفسجية Transilluminator (G: Box / EF) | Syngene | 2216498 | |
| Coomassie Brilliant Blue G | Sigma-Aldrich | B0770 | |
| Rocker (Gyro-Rocker) | Stuart | SSL3 | |
| Mixer Vortex | 13214789 | ماركة فيشر |
المراجع
- Scott, V., Clark, A. R., Docherty, K. The gel retardation assay. Methods Mol Biol. 31, 339-347 (1994).
- López-Estepa, M., et al. The crystal structure and small-angle X-ray analysis of CsdL/TcdA reveal a new tRNA binding motif in the MoeB/E1 superfamily.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
