القلب القائم على خلايا العضلات المحرك و بيوبوبوت الاستقرار الذاتي - الجزء 2

Neerajha Nagarajan; Merrel T. Holley; Christian Danielson; Kidong Park; Pinar Zorlutuna

doi:10.3791/55643

مقالة منهجية

القلب القائم على خلايا العضلات المحرك و بيوبوبوت الاستقرار الذاتي - الجزء 2

DOI:

10.3791/55643

⸱

مايو 9, 2017

Neerajha Nagarajan^*¹ , Merrel T. Holley^*² , Christian Danielson² , Kidong Park^*² , Pinar Zorlutuna^*¹

¹Department of Aerospace and Mechanical Engineering, Bioengineering Graduate Program, University of Notre Dame, ²Division of Electrical and Computer Engineering, Louisiana State University

^* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه الدراسة، يتم تصنيف المصنف البيولوجي و بيوبوبوت السباحة ذات الاستقرار الذاتي، والسباحة مع الأسلحة ناتستاليزد إلاستوميريك ناتئ مع كارديوميوسيتس، مثقف، وتتميز للخصائص البيوكيميائية والميكانيكا الحيوية مع مرور الوقت.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في السنوات الأخيرة، تم تطوير الأجهزة الهجينة التي تتكون من خلية حية أو مكون الأنسجة متكاملة مع العمود الفقري الميكانيكية الاصطناعية. هذه الأجهزة، وتسمى بيوروبوتس، مدعوم فقط من القوة الناتجة عن النشاط مقلص المكون الحي، وبسبب العديد من المزايا الكامنة، يمكن أن يكون بديلا للروبوتات الاصطناعية التقليدية تماما. هنا، نحن تصف أساليب البذور وتوصيف المحرك البيولوجي و بيوروبوت التي تم تصميمها، ملفقة، و فونكتيوناليزد في الجزء الأول من هذه المادة من جزأين. تم تشغيل فونكتيوناليزد المحرك البيولوجي ملفقة وأجهزة بيوروبوت تتكون من قاعدة بوليديميثيلزيلوكسان (بدمس) وكابيل رقيقة لمرفق الخلية مع فبرونيكتين. بعد فونكتيوناليزاشيون، تم تصنيف بذور العضلية الفئران حديثي الولادة على الذراع ناتئ بدمس في كثافة عالية، مما أدى إلى ورقة الخلية متموجة. تم تصوير الأجهزة كل يوم وحركة كانتيتم تحليل ذراع ذراع. في اليوم الثاني بعد البذر، لاحظنا الانحناء من الأسلحة ناتئ بسبب القوى التي تمارسها الخلايا خلال تقلصات عفوية. عند التحليل الكمي للثني ناتئ، لوحظت زيادة تدريجية في الإجهاد السطحي التي تمارسها الخلايا كما نضجت مع مرور الوقت. وبالمثل، لاحظنا حركة بيوروبوت بسبب يشتغل ذراع ناتئ بدمس، الذي تصرف بمثابة زعنفة. عند القياس الكمي لمحات السباحة من الأجهزة، لوحظت وسائط الدفع المختلفة، والتي تأثرت زاوية الراحة من الزعنفة. كما تم تحديد اتجاه الحركة وتكرار الضرب من زاوية استراح الزعنفة، وقد لوحظت أقصى سرعة للسباحة تبلغ 142 ميكرون / ثانية. في هذه المخطوطة، ونحن تصف الإجراء لملء الأجهزة ملفقة مع العضلية، وكذلك لتقييم المحرك البيولوجي والنشاط بيوروبوت.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بيوروبوتس هي الأجهزة القائمة على الخلايا الحية التي يتم تضمينها ضمن العمود الفقري الميكانيكية التي تتكون عادة من مواد لينة ومرنة، مثل بدمس أو الهلاميات المائية ¹ . وتخضع الخلايا للتقلصات الإيقاعية، إما بشكل تلقائي أو استجابة للمؤثرات، وبالتالي تعمل كمحرك. الطاقة المولدة من تقلص الخلية محركات بيوروبوتس مختلفة. وغالبا ما تستخدم خلايا الثدييات الثدييات (خلايا عضلية) وخلايا العضلات والهيكل العظمي ل يشتغل بيوروبوت بسبب خصائصها مقلص. وبصرف النظر عن كارديوميوسيت وخلايا العضلات والهيكل العظمي، وقد استخدمت أنواع الخلايا الأخرى، مثل أنسجة العضلات الحشرات ² و أنسجة العضلات ³ إكسلانتيد. الأنسجة العضلية الحشرات تمكن من تشغيل المحركات البيولوجية في درجة حرارة الغرفة.

يتم تحديد وظيفة وأداء بيوروبوت أساسا من قوة واتساق المحرك البيولوجي ( أي. خلايا العضلات)، في حين أن هيكل العمود الفقري الميكانيكية يحدد في المقام الأول آليات الحركة والاستقرار، والسلطة. وبما أن هذه الأجهزة هي وحدها التي تحركها القوى الناتجة عن الخلايا، فلا توجد ملوثات كيميائية أو ضوضاء تشغيلية. ولذلك، فإنها تشكل بديلا موفرا للطاقة للروبوتات التقليدية الأخرى. وقد ناقشت مصادر الأدب المختلفة الطرق المختلفة لدمج الخلايا الحية والأنسجة في بيوروبوتس ¹ ^، ⁴ ^، ⁵ . وقد مكنت التطورات في تقنيات التصنيع المجهرية وهندسة الأنسجة من تطوير بيوروبوتس التي يمكن المشي، قبضة، السباحة، أو مضخة ⁵ ^، ⁶ . بشكل عام، يتم استزراع الخلايا مباشرة على العمود الفقري الميكانيكي (البوليمري) كخلايا خلية متموجة أو يتم صياغتها في هياكل تشغيل ثلاثية الأبعاد داخل السقالات مثل الحلقات والشرائط. في معظم الأحيان، بيوروبوتس هيملفقة باستخدام ورقة كارديوميوسيت ⁶ ^، ⁷ ، وهذه الخلايا لديها القدرة الفطرية لإظهار انكماش عفوية دون المحفزات الخارجية. من ناحية أخرى، تقارير عن خلايا خلايا العضلات والهيكل العظمي محدودة بسبب حاجتهم إلى المحفزات لبدء تقلصات في المختبر من أجل الشروع في الاستقطاب الغشاء ⁸ .

يصف هذا البروتوكول أولا كيفية كارديوميوسيتس البذور على المحرك البيولوجي فونكتيوناليزد مصنوعة من ناتئ بدمس رقيقة. ثم يصف بالتفصيل البذر وتحليل ملامح السباحة. و ناتشوراليزد ناتئ فونكتيوناليزد مع بروتين لاصق الخلية مثل فبرونيكتين و يصنف كونفلنتلي مع كارديوميوسيتس. كما الخلايا المصنفة على عقد الجهاز، فإنها تتسبب في ناتئ لثني، وبالتالي لتكون بمثابة المحرك. مع مرور الوقت، كما تنضج الخلايا، ونحن تتبع التغيرات في الإجهاد السطحي على الجهاز من خلال تحليل أشرطة الفيديو منالانحناء ناتئ. المحرك البيولوجي المتقدمة هنا يمكن استخدامها لتحديد خصائص مقلص من أي نوع من الخلايا، مثل الخلايا الليفية أو الخلايا الجذعية المحفزة المستحثة، لأنها تخضع للتمايز.

وقد ركز الكثير من البحوث السابقة على بيوروبوتس على تطوير المحركات البيولوجية، في حين تم إهمال إلى أقصى حد من العمارة بيوروبوت والقدرات الوظيفية إلى حد كبير. في الآونة الأخيرة، وقد أظهرت دراسات قليلة تنفيذ أساليب السباحة في بيوروبوتس التي هي مستوحاة من الطبيعة. على سبيل المثال، تم تصميم بيوروبوتات السباحة مع الحركة القائمة على سيلا ⁶ ، دفع قنديل البحر ⁹ ، والأشعة الهجينة الحيوية ⁴ . خلافا لغيرها من الأعمال في الأدب، ونحن هنا نركز على اختلاف خصائص العمود الفقري الميكانيكية لخلق هيكل الاستقرار الذاتي. بيوروبوت وضعت في هذه الدراسة قادرة على الحفاظ على الملعب المستمر، لفة، و إمعمق التعمير كما أنها تسبح. هذه المعلمات يمكن تعديلها من خلال تغيير سمك كل قاعدة المركب. يتم وصف الخطوات تصنيع تشارك في تطوير المحرك بدمس، بيوروبوت الجوفية، و فونكتيوناليزاشيون من الجهاز بالتفصيل في الجزء 1 من هذه المادة من جزأين، وكذلك في عملنا مؤخرا ^{7. يمكن} للتقنية المتقدمة هنا تمهيد طريقة لتطوير رواية، بيوروبوتس عالية الكفاءة لمختلف التطبيقات، مثل تسليم البضائع.

عملية العزل المتبعة في هذه الدراسة مشابهة للعملية الموصوفة في عمل سابق ¹⁰ ، وكذلك في العمل المنشور مؤخرا ⁷ . يتم وصف أساليب التصنيع ميكروفابريكاتيون المستخدمة لتصنيع المحركات بدمس وأجهزة بيوروبوت بالتفصيل في الجزء 1 من هذه المخطوطة من جزئين. القسم بروتوكول من هذه المخطوطة يصف الخطوات التي ينطوي عليها زرع الخلايا العضلية على بدمس ملفقة أكتواتور و بيوروبوت بعد فونكتيوناليزاشيون مع البروتينات لاصقة الخلية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تم تنفيذ جميع الإجراءات المذكورة هنا باستخدام بروتوكول المعتمدة ووفقا للوائح اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام جامعة نوتردام.

1. خلية البذر والثقافة

قبل البدء، وإعداد العناصر المطلوبة: قمع صغير، الماصات، ودولبيكو تعديل النسر المتوسطة (دمم) تستكمل مع 10٪ مصل بقري الجنين (فبس) و 1٪ المضادات الحيوية البنسلين (دمم كاملة).
اتخاذ قوارير T-25 جنبا إلى جنب مع الجهاز فونكتيوناليزد (المحرك البيولوجي أو بيوروبوت) داخله. راجع القسم 4 من الجزء الأول من هذه المخطوطة المكونة من جزئين للحصول على تفاصيل حول إعداد الجهاز، فونكتيوناليزاشيون، والتخزين قبل زرع الخلايا.
إعداد قمع، والتي يمكن أن تكون عن طريق المتداول، ورقة بلاستيكية مربعة صغيرة. وضعه على المحرك البيولوجي أو بيوروبوت داخل قارورة T-25. ضبط قطر نهاية أوسع لتناسب الجهاز بأكملهوالارتفاع بحيث تناسبها بشكل مريح عندما يتم تشديد الجزء العلوي من قارورة.
1. ل بيوروبوتس، استخدام المغناطيس لعقد الجهاز في مكان في الجزء السفلي من قارورة طوال عملية البذر.
  ملاحظة: هنا، تم استخدام مغناطيس قرص النيوديميوم واحد (1.26 "في القطر)، ولكن أي مغناطيس من حجم مماثل وقوة يمكن أن تستخدم أيضا لعقد بيوروبوت مع قاعدة النيكل المغناطيسي بدمس المركبة.
2. الأشعة فوق البنفسجية تعقيم ورقة من البلاستيك لمدة 30 دقيقة على الأقل الاستخدام المسبق.
تأكد من عدم وجود فجوة كبيرة بين قاعدة القمع والقارورة.
ريسوسبيند كارديوميوسيتس في دمم كاملة بكثافة 1.6 × 10 ⁷ خلايا / مل وخفض ببطء 400 ميكرولتر من تعليق على الجهاز من خلال قمع. استخدام عدادة الكريات أو أي عداد خلية أخرى لتحديد عدد الخلايا التي تم الحصول عليها.
حرك ببطء النظام مرة أخرى إلى الحاضنة دون إزعاج الجهاز والطرافة القمعهين. الثقافة لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية.
بعد فترة الحضانة، وإزالة ببطء قمع، وغسل بلطف العينة مع برنامج تلفزيوني، وإعادة ملء قارورة مع 10 مل من دمم جديدة كاملة.
ملاحظة: ل بيوروبوتس، وإزالة المغناطيس بحيث يكون الجهاز واقفا على قدميه.

2. توصيف البيوكيميائية

فحص الفيضانات الكالسيوم
ملاحظة: يتم إجراء فحص تدفق الكالسيوم بها لتقييم الربط بين الخلايا. الإجراء لتحميل الخلايا مع الفلورسنت، والكالسيوم أيون صبغ محددة يتبع العملية الموصوفة في بروتوكول أنشئت سابقا ¹¹ .
1. أولا، إعداد المواد المطلوبة، والكالسيوم فلو -4 أسيتوميثيل (آم) استر، بوليول السطحي غير الأيونية (انظر جدول المواد )، وحل الملح تيرود .
2. باستخدام ملاقط طويلة، ونقل بلطف الجهاز من قارورة الثقافة إلى طبق بتري 35 ملم مع 2 مل من الملح تايرود سولو نشوئها.
3. في أنبوب الطرد المركزي منفصل، واتخاذ 1 مل من حل دافئ تيرود (تحسنت إلى 37 درجة مئوية) وإضافة 3-5 ميكرولتر من الأسهم الكالسيوم فلو -4 آم صبغ (تركيز العمل: 3-5 ميكرومتر) وعلى قدم المساواة جزء من السطحي غير الأيونية البوليول (تركيز العمل: 0.2٪). استبدال الحل عينة مع حل دافئ تيرود تستكمل مع صبغ مؤشر الكالسيوم، فلو -4، و 0.2٪ السطحي غير الأيونية. احتضان لمدة 25 - 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
4. إزالة محلول الصبغة وغسل بلطف العينة مع حل تايرود جديدة. إعادة احتضان العينة في 2 مل من دمم جديدة كاملة لمدة 30 دقيقة أخرى عند 37 درجة مئوية قبل التصوير.
  ملاحظة: يتم تقديم نتائج هذا الفحص والفيديو ذات الصلة في العمل المنشور سابقا ⁷ .
المناعي
ملاحظة: تم تنفيذ إمونوستينينغ مزدوجة من جميع العينات التالية بروتوكول أنشئت مسبقا> 12.
1. أولا، إعداد 10٪ مصل الماعز (غس) في محلول ملحي الفوسفات مخزنة (بس)، بارافورمالدهيد 4٪ (بفا) في ديه ₂ O، 0.1٪ منظفات ليز الخلية (انظر جدول المواد ) في برنامج تلفزيوني، الأجسام المضادة الأولية -Mouse الأجسام المضادة وحيدة النسيلة القلب تروبونين-I والأرنب المضادة للأرنب وحيدة النسيلة كونيكسينز -43)، الأجسام المضادة الثانوية (اليكسا 594 المتقارن والماعز المضادة للماوس مفتش (H + L) اليكسا 488 المتقارن)، و دابي.
  تنبيه: بارافورمالدهيد مسرطنة.
2. إزالة عينة من الفائدة من قارورة وغسل بلطف مرتين مع برنامج تلفزيوني. راجع القسم 4 في الجزء الأول من هذه المخطوطة المكونة من جزأين للحصول على تفاصيل حول إعداد العينات و فونكتيوناليزاشيون.
3. إضافة قطرة من بس على ساترة صغيرة (قطرها: 12 ملم أو 15 ملم). عقد بلطف قاعدة الجهاز مع ملاقط وقطع الأسلحة بدمس رقيقة (ناتئ، الشكل 1 ) باستخدام مقص من نهاية حيث يربط إلى الجزء العلوي من بسه. نقل الأسلحة ناتئ على قطرة مع الجانب الملتصقة الخلية التي تواجه التصاعدي. سوف قطرات برنامج تلفزيوني منع الخلايا من التجفيف.
4. إصلاح العينات مع 4٪ بفا وأداء المناعية مزدوجة من العينات، كما هو موضح سابقا ¹² .
5. بعد إمونوستينينغ، جبل العينات على شريحة زجاجية نظيفة باستخدام مكافحة تتلاشى كاشف تصاعد وتجنب جانبا، دون عائق، في الظلام لمدة 24 ساعة.
6. كرر الإجراء لجميع العينات.
  ملاحظة: نوقشت نتائج هذا الفحص والصور ذات الصلة في العمق في العمل المنشورة سابقا ⁷ .

3. التصوير

وضع قارورة T-25 تستقيم في حاضنة كو ₂ وإعداد نظام التصوير داخل الحاضنة. تسجيل الجهاز باستخدام كاميرا (انظر جدول المواد ) مع عدسة التكبير (انظر جدول المواد ). لمصدر الضوء،استخدام شريط من أضواء ليد.
ملاحظة: تم استخدام شريط من المصابيح البيضاء الضوء هنا، ولكن أي ليدس العادية سوف تعمل أيضا.
قم بتوصيل الكاميرا بنظام تشغيل وافتح البرنامج الخاص بالكاميرا (انظر جدول المواد ). انقر على صورة الكاميرا أسفل علامة التبويب "ملف"، في اللوحة العلوية، لفتح جميع خيارات الكاميرا، واختر الكاميرا الصحيحة.
اختر "مباشر" من قائمة علامات التبويب في اللوحة العلوية داخل البرنامج.
جلب الصورة يدويا إلى التركيز عن طريق ضبط قرص العدسة. حدد "الاقتصاص إلى منطقة الاهتمام (روي)" من اللوحة العليا. ثم، رسم مستطيل يدويا في إطار الفيديو، أرفق جهاز المحرك البيولوجي والأسلحة ناتئ، للاحتفال عائد الاستثمار.
ملاحظة: يؤدي تحديد عائد استثمار مناسب إلى تقليل حجم ملفات الصور.
1. في حالة بيوروبوتس، التقاط الشاشة بأكملها من أجل تسجيل حركة السباحة للجهاز.
  ملاحظة: ليست هناك حاجة لرسم عائد الاستثمار ل بيوروبوتس
قبل بدء التسجيل، حدد "إعدادات الكاميرا" من إحدى علامات التبويب في اللوحة العلوية على الشاشة. تعيين معدل الإطار عن طريق ضبط نسبة التعرض ونسبة بكسل الصورة الحية عن طريق تحريك شريط لكل أو عن طريق إدخال القيم يدويا. تعيين معدلات الإطار إلى حوالي 30 ± 2 إطارا في الثانية.
ملاحظة: يؤدي تغيير نسبة التعرض ونسبة البكسل إلى تغيير السطوع والتباين للصورة الحية.
انقر فوق الزر "تسجيل" من اللوحة العليا في البرنامج لبدء تسجيل أشرطة الفيديو من المحركات مع 1،000 × 1،000 بكسل بدقة 30 ثانية. كرر العملية لجميع العينات.

4. تحليل صورة للمحركات البيولوجية على قاعدة ثابتة

تحليل الصور باستخدام برنامج البرمجة (على سبيل المثال، ماتلاب) تشغيل البرنامج النصي مخصص. انظر جدول المواد والملحق التكميلي لمزيد من التفاصيل.
ملاحظة: يعرض البرنامج النصي كل إطار من أشرطة الفيديو المسجلة، يتلقى المدخلات الماوس المستخدم لتسجيل تنسيق نقاط الكابولي على الصور، ويحسب قطر ومركز الدائرة التي تمر النقاط المدخلة عن طريق أقل مربع المناسب، و تصدير جميع البيانات المدخلة والمحسوبة لمزيد من الاستخدام.
1. افتح برنامج البرمجة بالنقر على الرمز. انقر فوق "ملف" -> "فتح" من شريط القوائم في الجزء العلوي وحدد ملف النصي .m لتحليل الصور. تأكد من أن الصور تيف المسجلة في نفس المجلد مثل ملف .m. انقر فوق "تشغيل" لتشغيل البرنامج النصي.
  ملاحظة: عرض تفاعلي سوف يطفو على السطح لتغيير.
2. اضغط على "تشغيل" لبدء البرنامج الفعلي. انقر على زر "فتح" وتحديد موقع ملف تيف التي سيتم تحليلها.
3. انقر على الزر "أساسي & #34؛ زر ثم انقر على النقطة التي تعلق ناتئ إلى قاعدة في الأعلى. ضرب دخول. وهذا وضع علامة مربع على الصورة لكل إطار للدلالة على موقع قاعدة ناتئ.
4. انقر على زر "مقياس" ثم انقر يدويا على حافة واحدة من حبة الزجاج. جلب مؤشر الماوس إلى الجانب الآخر من حبة الزجاج واضغط على "إنتر".
  ملاحظة: هذا يجب رسم خط يقيس قطر حبة الزجاج. منذ حبة الزجاج هو 3 ملم في القطر، وهذا سوف تتصل 3 ملم إلى بكسل المعروضة.
5. انقر على الزر "تحليل". انقر على طول ناتئ على مسافة قصيرة من علامة مربع الأول الذي يمثل قاعدة ناتئ.
6. انقر على الزر "تحليل". ثم، انقر على طول ناتئ على مسافة قصيرة من علامة مربع الأول الذي يمثل قاعدة ناتئ. الاستمرار في النقر على طول ناتئ، بما في ذلك طرف، واضغط على إنتر عندمافعله. وهذا وضع "س" على كل نقطة النقر على ناتئ.
  ملاحظة: استنادا إلى تنسيق علامة مربع وعلامات x، سيتم حساب مركز وقطر الدائرة باستخدام وظيفة تركيب مربع أقل (راجع الملف الملحق المرفق للنص المستخدم). الدائرة، الذي يمر علامات x وصانع مربع، سيتم فرضه على الصورة تلقائيا.
7. تحقق مما إذا كانت الدائرة فرضه يتتبع بشكل صحيح الملف الشخصي ناتئ.
  ملاحظة: عندما يكون ناتئ مسطح جدا، فمن الصعب أن نحكم إذا تم تعريف ملف ناتئ بشكل صحيح. راجع الشكل 3 .
8. انقر على زر "الإطار التالي". سيتحول هذا إلى الإطار التالي في ملف تيف. تم تعيين القاعدة والحجم بالفعل من الخطوة السابقة.
9. كرر الخطوات من 4.1.5 إلى 4.1.7 حتى يتم الانتهاء من كافة الإطارات في ملف تيف. مرة واحدة وقد تم جميع الإطارات بروسسسد، انقر فوق الزر "تصدير".
  ملاحظة: هذا سيجعل ملف جدول بيانات مع اسم ملف تيف ل ناتئ التي تم تحليلها فقط. قم بتحرير اسم الملف لتضمين أي جانب (من اليسار أو اليمين) من ناتئ تم تحليله.
حساب الإجهاد في جدول البيانات.
1. حساب الإجهاد السطحي، "σ"، على ناتئ باستخدام المعادلة التالية:
  
  حيث E، R، v ، و h هي معامل يونغ، نصف قطر الانحناء، نسبة بواسون، وسمك ناتئ، على التوالي.
  ملاحظة: سمك ناتئ يمكن تغييرها لتغيير حساسية. في هذه الدراسة، كانت القيم كما يلي: E = 750 كيلو باسكال، v = 0.49، و h = 25 ميكرون ¹³ ^، ¹⁴ .
2. حساب الإجهاد السطحي باستخدام المعادلة في الخطوة 4.2.1. افتح ال .ملف جداول بيانات زلس. لاحظ أن الإخراج يحتوي على أعمدة متعددة تظهر أولا x و y إحداثيات قاعدة ودائرة ثم دائرة نصف قطرها من انحناء. احسب إحداثيات x و y لكل نقطة تم النقر عليها استنادا إلى هذه.
  ملاحظة: وتآمر الضغوط على إطارات الوقت الفاصل بين الصور يظهر التغييرات في القوة التي تمارس على ناتئ مع مرور الوقت. وتظهر الأحواض الضغط على ناتئ أثناء استرخاء الخلايا العضلية أو الإجهاد ثابت تمارس على ناتئ بسبب قوى الجر الخلية. تظهر قمم الضغط الديناميكي على ناتئ، الذي كان يمارسه الضرب من العضلية. هذه القيمة يتوافق مع أقصى قدر من القوة الناتجة عن تقلص العضلية.

5. تحليل بيوروبوتس السباحة

تسجيل موقف بيوروبوت باستخدام برنامج تحليل الصور.
ملاحظة: راجع قائمة المواد للبرامج المستخدمة في ثهو القسم.
1. فتح برنامج تحليل الصور (على سبيل المثال، إيماجيج). اضغط على "ملف" و "فتح" وحدد ملف الفيديو بيوروبوت السباحة. انقر فوق "موافق" والسماح للبرنامج تحميل الملف. افتح برنامج جدول البيانات.
2. في الفيديو بيوروبوت تحميل، والعثور على مرجع من أبعاد معروفة (على سبيل المثال، حبة الزجاج 3 ملم في القطر الذي كان جزءا لا يتجزأ من المحرك البيولوجي).
  ملاحظة: سيعمل أي عنصر ذي بعد معروف. سيحدد ذلك نسب البكسل إلى الطول في كل مقطع فيديو.
3. استخدام أداة "مستقيم" لرسم خط عبر حبة الزجاج. انقر على "تحليل" وحدد "تعيين المقياس". تعيين حقل "المسافة المعروفة" إلى "3000 ميكرون" وانقر على "موافق".
  ملاحظة: سيؤدي هذا إلى تعيين إحداثيات x و y إلى ميكرومتر.
4. اختيار نقطة على الجهاز الذي لا تمايل بين الإطارات ليكون بمثابة علامة.
  ملحوظة:فمن المستحسن اختيار زاوية من القاعدة.
5. أشر إلى النقطة المحددة في 5.1.4 في الإطار الأول. سجل إحداثيات x و y على جدول البيانات.
6. ارجع إلى نافذة برنامج تحليل الصور واضغط على مفتاح السهم لليمين للتغيير إلى الإطار التالي. أشر إلى العلامة مرة أخرى (من الخطوة 5.1.4) وسجل إحداثيات x و y على جدول البيانات.
7. كرر الخطوة 5.1.6 لجميع الإطارات.
حساب المعلمات السباحة من بيوروبوت باستخدام جدول الإحداثيات ⁷ .
1. احسب الفترة بين الأطر من معدل الرتل المعروف لكل مقطع فيديو.
2. حساب التغير في إحداثيات x و y بين الإطارات للعثور على المسافة المنقولة، بما في ذلك المسافة الإجمالية.
3. حساب اتساع الانكماش من التغيير الأقصى على طول المحور ص. تحديد تردد الضرب لكل بيوروبوت من معكوس الفترة بين اثنين من تقلصات.
4. Cألكولات سرعة السباحة من كل جهاز من مجموع الوقت والمسافة انتقلت في الاتجاه س.
5. كرر الخطوة 5.2 لكل فيديو بيوروبوت التي تم تحليلها.
6. تطبيع كل معلمة المقاسة.
  ملاحظة: تطبيع جميع القيم لتصور أفضل الاختلافات. هذا البروتوكول يوضح التطبيع فيما يتعلق بيوروبوت وضع أفقي مع تقلصات التردد المنخفض (لف الأفقي) ( الشكل 4 ) ⁷ .

6. تحليل التعبير البروتين

ملاحظة: تم تصوير العينات التي تم إعدادها في خطوات 2.2.4 و 2.2.5 باستخدام المجهر متحد البؤر. تم الحصول على الصور في 20X، 40X، و 60 X التكبير بالتتابع في ثلاث قنوات في وقت واحد: 460 نانومتر، 488 نانومتر، و 594 نانومتر. تم التقاط مجموعة من 5 صور في التكبير 40X، من مواقع مختلفة لكل عينة، وتم حفظ كل قناة كفرد .TIFFملف. تم تحديد إعداد التعرض عن طريق تكبير الهدف المستخدم وتم تعيين ثابت لجميع التقاطات في هذا التكبير.

افتح برنامج تحليل الصور وحدد "فيل" -> "أوبين" لتحميل الصور.
ارسم مضلعا مستطيلا على إطار الصورة لتحديد عائد الاستثمار. حدد "تحليل" -> "قياس" لقياس متوسط كثافة الفلورسنت.
كرر الخطوة 6.2 لجمع القياسات شدة من جميع العينات وحساب كثافة المتوسط لكل حالة.
ملاحظة: هنا، تشير حالة مختلفة إلى نقاط زمنية مختلفة، كما في، يوم 1، يوم 2، وحتى يوم 6.
تصدير النتائج على جدول بيانات لمزيد من التحليل الإحصائي وإنتاج المؤامرات البيانات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المحرك البيولوجي مصنوعة من ناتئ بدمس رقيقة (25 ميكرون في سمك) و كارديوميوسيتس تشكل جوهر بيوروبوت السباحة، كما هو مبين في التخطيطي ولقطة من الأجهزة في الشكل 1 . تبدأ الخلايا في عرض انقباضات بعد 24 ساعة في الثقافة، والانحناء من الأسلحة ناتئ لوحظت في اليوم 2. تم تسجيل الجانب الجانبي للجهاز كل يوم، وتم قياس الإجهاد السطحي من الانحناء من الأسلحة ناتئ باستخدام صورة مخصصة تحليل السيناريو ⁷ . تم استخراج الضغوط ثابتة...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الإجراء الموضح هنا يصف طريقة البذر الناجحة للمشغلات القائمة على بدمس والبيوروبوتات، مما يسهل مرفق الخلايا العضلية. وعلاوة على ذلك، وصفت عملية الحصول على الصور والتحليل اللاحق الذي يميز سلوك الخلايا وأداء الأجهزة.

لاحظنا انكماش عفوية من الخلايا على الأسلحة ناتئ بعد 24 ساعة؛ استمرت شدة الانقباضات في الزيادة باطراد مع مرور الوقت ووصلت إلى الحد الأقصى في اليوم السادس، وبعد ذلك انخفضت الكثافة ببطء. على الرغم من أن الأ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويدعم مت هولي من قبل برنامج الزملاء الدراسات العليا من مجلس ولاية لويزيانا من الحكام، و C. دانيلسون بدعم من برنامج هوارد هيوز الطبية أساتذة المعهد. ويدعم هذه الدراسة من قبل جبهة الخلاص الوطني منحة رقم: 1530884.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
<قوية > مواد كيميائية وكواشف < / قوية >
عضلة القلب (خلايا القلب الأولية) نهر	تشارلز	NA	معزولة عن فئران Sprague Dawley البالغة من العمر يومين من حديثي الولادة
Dulbecco ' النسر المعدل s media (DMEM)	مختبرات Hyclone	16750-074	مع 4500 مجم / لتر جلوكوز ، 4.0 ملي مولار L-glutamine ، و 110 مجم / لتر بيروفات الصوديوم
Fetalclone III مصل	Hyclone Industries ، GE	16777-240	مصل بوفين الجنين (FBS)
Dulbecco ' عازلة الفوسفات (PBS)	Sigma-Aldrich	D1408-100ML
ملح الصوديوم بنسلين	Sigma-Aldrich	P3032
مصل الماعز	Sigma-Aldrich	G9023
4،6-diamidino-2-phenylindole dihydrocholride powder (DAPI)	Sigma-Aldrich	D9542
Fibronectin من محلول بلازما البقر	Sigma-Aldrich	F1141	(1 مجم / مل)
مجموعة الكالسين-AM والإيثيديوم homodimer-1 (المقايسة الحية / الميتة)	المجسات الجزيئية	L3224
الكالسيوم فلو -4 ،	المجسات الجزيئية	AM F14217	صبغة مؤشر الكالسيوم
ملح Tyrodes محلول الملح	Sigma-Aldrich	T2397
المجسات الجزيئية	Pluronic F-127	P3000MP	محلول خافض للتوتر السطحي غير أيوني -20٪ في ثنائي ميثيل سيلوكسان (DMSO)
الفحص المجهري الإلكتروني	بارافومالديهايد	15710	تحذير: مهيج وقابل للاحتراق
Triton x-100	Sigma-Aldrich	X-100 100 مل	منظف تحلل الخلايا ، (4- (1،1،3،3-Tetramethylbutyl) فينيل بولي إيثيلين جلايكول ، t-Octylphenoxypolyethoxyethanol ، بولي إيثيلين جلايكول ثلاثي الأوكتيل الأثير)
ProLong كاشف الذهب المضاد للبهتان	المجسات الجزيئية	P10144	عامل التركيب
Alexa Fluor 594	المجسات الجزيئية	A12381	علامة خيوط الأكتين
الماعز المضادة للأرانب IgG (H + L) الجسم المضاد الثانوي ، Alexa Fluor 594	المجسات الجزيئية	المترافقة A-11012
PHA	المجسات الجزيئية	A-11001
Anti-connexin 43 الجسم المضاد	Abcam	ab11370	علامة تقاطع الفجوة
المضادة للتروبونين القلبي I الجسم المضاد	Abcam	ab10231	بروتين مقلص
16٪ محلول بارافورمالدهيد من الدرجة EM	المجهر	100503-916
بولي ثنائي ميثيل سيلوكسان (PDMS)	Elsevier		Sylgard 184
<قوي > المواد والمعدات < / قوي >
الكاميرا	Thor Labs	DCC1545M
ضوء LED شريط	NA	NA	أي LED أبيض بدون انبعاث طيف
مجهر متحد البؤر	Nikkon C2	NA	مجهر متحد البؤر مع ثلاثة مجموعة مرشحات.
عدسة التكبير	Infinity	Model # 252120
Software
Matlab	Mathworks	NA	المستخدمة في القسم 4) لتحليل المحرك البيولوجي.
Image J	المعهد الوطني للصحة		NA برنامج معالجة الصور المستند إلى Java. تستخدم في القسم 5) لتحليل الروبوت الحيوي. برنامج مجاني لمعالجة وتحليل الصور في جافا. (https://imagej.nih.gov/ij/)
تشغيل كاميرا	Thor Cam	Thor Labs	NA

خلايا G محلول 16٪ Phalloidin الإلكتروني برنامج

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Feinberg, A. W. Biological Soft Robotics. Annu. Rev. Biomed. Eng. 17, 243-265 (2015).
Akiyama, Y., et al. Room Temperature Operable Autonomously Moving Bio-Microrobot Powered by Insect Dorsal Vessel Tissue. PLOS ONE. 7, 38274(2012).
Herr, H., Dennis, R. G. A swimming robot actuated by living muscle tissue. J. NeuroEng Rehabil. 1, 6(2004).
Park, S., et al. Phototactic guidance of a tissue-engineered soft-robotic ray. Science. 353 (6295), 158-162 (2016).
Cvetkovic, C., et al. Three-dimensionally printed biological machines powered by skeletal muscle. Proc. Natl. Acad. Sci. 111, 10125-10130 (2014).
Williams, B. J., Anand, S. V., Rajagopalan, J., Saif, M. T. A. A self-propelled biohybrid swimmer at low Reynolds number. Nat. Commun. 5, (2014).
Holley, M. T., Nagarajan, N., Danielson, C., Zorlutuna, P., Park, K. Development and characterization of muscle-based actuators for self-stabilizing swimming biorobots. Lab. Chip. 16, 3473-3484 (2016).
Hopkins, P. M. Skeletal muscle physiology. Contin Educ Anaesth Crit Care Pain. 6, 1-6 (2006).
Nawroth, J., et al. A tissue-engineered jellyfish with biomimetic propulsion. Nat Biotechnol. 30 (8), 729-797 (2012).
Ehler, E., Moore-Morris, T., Lange, S. Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes. J. Vis. Exp. JoVE. (79), e50154(2013).
Bers, D. M. Calcium Fluxes Involved in Control of Cardiac Myocyte Contraction. Circ. Res. 87, 275-281 (2000).
Shin, S. R., et al. Carbon-Nanotube-Embedded Hydrogel Sheets for Engineering Cardiac Constructs and Biological actuators. ACS Nano. 7, 2369-2380 (2013).
Park, J., et al. Real-Time Measurement of the Contractile Forces of Self-Organized Cardiomyocytes on Hybrid Biopolymer Microcantilevers. Anal. Chem. 77, 6571-6580 (2005).
Tamayo, J., et al. Quantification of the surface stress in microcantilever biosensors: revisiting Stoney's equation. Nanotechnology. 23, 475702(2012).
Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nat. Methods. 10, 781-787 (2013).
Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. Methods in Cardiomyocyte Isolation, Culture, and Gene Transfer. J. Mol. Cell. Cardiol. 51, 288-298 (2011).
Alford, P. W., Feinberg, A. W., Sheehy, S. P., Parker, K. K. Biohybrid thin films for measuring contractility in engineered cardiovascular muscle. Biomaterials. 31, 3613-3621 (2010).
Sfakiotakis, M., Lane, D. M., Davies, J. B. C. Review of fish swimming modes for aquatic locomotion. IEEE J. Ocean. Eng. 24, 237-252 (1999).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

PDMS

القلب القائم على خلايا العضلات المحرك و بيوبوبوت الاستقرار الذاتي - الجزء 2

في هذه المقالة

ملخص

الملخص

المقدمة

البروتوكول

النتائج

المناقشة

الإفصاحات

شكر وتقدير

المواد

المراجع

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

مقالات ذات صلة