مقالة منهجية

تشريح البنكرياس الماوس للتحليل النسيجي والتنميط الأيضية

39.6K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/55647

⸱

أغسطس 19, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry & Biochemistry, Miami University, 2College of Medicine, Central Michigan University

في هذه المقالة

ملخص

توفر هذه المقالة الفيديو مظاهرة تفصيلاً الإجراءات اللازمة لإزالة البنكرياس بنجاح من ماوس بتشريح للتحليل النسيجي والتنميط الأيضية.

الملخص

لقد تم التحقيق عامل النسخ المحددة البنكرياس، 1a cre-ريكومبيناسي؛ ساركومه لوكس-توقف-لوكس-كريستين الفئران، جليكاين لحمض الأسبارتيك في كودون 12 (Ptf1acre/+؛ لسلكراسG12D/+) الفأر سلالة كنموذج للبشرية سرطان البنكرياس. لدينا الدراسات الحالية يهدف إلى تحديد المؤشرات الحيوية الأيضية رواية لتطور سرطان البنكرياس. وقد أجرينا التنميط الأيضية للبول، والبراز، والدم، ومقتطفات أنسجة البنكرياس، فضلا عن تحليلات النسيجي لمرحلة تطور سرطان البنكرياس. البنكرياس الماوس ليس جهازا صلبة محددة تحديداً جيدا مثل البشر، ولكن بدلاً من ذلك هو أنسجة ناعمة تصطبغ موزعة التي لم تحدد بسهولة من الأفراد غير مألوف مع الماوس التشريح الداخلي أو عن طريق الأفراد التي لديها القليل أو لا القيام بتجربة تشريح جهاز الماوس. والغرض من هذه الوثيقة تقديم مفصل المجوعات مظاهرة البصرية دليل المبتدئين في إزالة البنكرياس الماوس بالتشريح. ينبغي أن تكون هذه المادة ذات قيمة خاصة للطلاب والباحثين جديدة للبحوث التي يتطلب الحصاد البنكرياس الماوس بتشريح للتنميط الأيضية أو تحليلات النسيجي.

المقدمة

وبرز الماوس حيوان نموذجا هاما لسرطان البنكرياس البشرية1،2. في Ptf1acre/+؛ LSL-كراسG12D/+ طراز الماوس، كريستين السرطاني كابوزي (ك-Ras) الفئران يتم تنشيط حصرا في البنكرياس، أسفر عن البدء بأورام في البنكرياس، المعروف باسم نيوبلاسياس للسيتولوجيا البنكرياس (بانينس)، أن التقدم للبنكرياس adenocarcinomas الأقنية، يشار إليها باسم بدأكس3. ويتيح هذا النظام النموذجي الماوس واحدة من أفضل النماذج الحيوانية المتاحة لسرطان البنكرياس البشرية4،5، مع ميزة إضافية التي تظهر بانينس خلال الأشهر الخمسة الأولى من الحياة، وكثيراً ما تقدم إلى بدك داخل واحد السنة4،5، في حين أن سرطان البنكرياس يحدث غالباً في البشر 60-70 سنة عمر.

استخراج البنكرياس بالتشريح من Ptf1acre/+؛ LSL-كراسG12D/+ الفئران في مختلف الإعمار يسمح لدراسة نسيجية طولية تفصيلية للتنمية سرطان في البنكرياس، بدءاً من أولى مراحل بانين من خلال التقدم إلى بدك3،4 , 5-حصاد البنكرياس في سن تتراوح ما بين خمسة إلى خمسة عشر شهرا يمكن أن تستخدم أيضا لإعداد الأنسجة مقتطفات لتوصيف التغيرات العالمية في البنكرياس4 الأيض التي تحدث أثناء الانتقال من صحية إلى الأنسجة المريضة 6،7.

هذه المقالة يعرض دليل مرئي كاملة للخطوات المطلوبة للقيام استخراج بنكرياس ماوس ويوفر مبادئ توجيهية للتخزين البنكرياس لمزيد من التحليل. هذا الدليل سوف تكون ذات قيمة متساوية للأفراد إجراء بحوث بشأن أمراض البنكرياس الأخرى، بما في ذلك مرض السكري من النوع الأول، وينبغي أن يكون مفيداً بشكل خاص للطلاب والباحثين جديدة للأبحاث المتعلقة بحصاد من البنكرياس الماوس باستخدام تشريح للتنميط الأيضية أو تحليلات النسيجي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

الإجراءات التي نفذت في شريط الفيديو وهو موضح أدناه عليها "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) في جامعة ميامي-

1-إعداد واختبار التحفيز

  1. تأسيس اثنين مجالات متميزة لإجراء العمليات الجراحية وطاولة العمليات والجدول بعد انتهاء العملية. المرحلة كلا المجالين مع جميع المواد والأدوات اللازمة. الجدول
    1. المرحلة تعمل تحت غطاء التهوية. ترتيب الجدول بالمعدات بطريقة تسمح بأداء الإجراء مستمر ودون عوائق.
      2. إنشاء
    2. جدول بعد العملية الجراحية في نفس الغرفة والقرب من الجدول الرئيسي للعملية. الحفاظ على كلا الجدولين بيئات معقمة طوال فترة الإجراءات.
  2. مكان ما يلي اللوازم على طاولة العمليات: جرة زجاج واحد مع غطاء وأنبوب 15 مل واحد وزوج واحد من مقص الجراحة، وضغط واحد زجاجة من الإيثانول 70%، والمجلسين الرغوة، الملقط اثنين، هما محاقن قياس 1 مل 21، أنبوبين 50 مل، أنبوب أحد أجهزة الطرد المركزي ، قنينة المبردة واحدة وأربع منصات الجراحية والدبابيس عشرة، موزع مناديل تعقيم وحاوية الأدوات الحادة-
  3. وضع الإمدادات التالية على الجدول بعد انتهاء العملية: واحد تحليلية التوازن، أحد ديوار ل 4 من النتروجين السائل، ضحلة واسعة الفم ديوار ورف microtube عائمة وزوج واحد من مقص الجراحة، الملقط اثنين، أربعة قنينات المبردة وموزع ل مناديل معقمة.
  4. ملء واحدة 50 مل وأنبوب 15 مل واحد بحجم 75% مع الفورمالين.
  5. استخدام pin في كل زاوية، إلصاق لوحة الجراحية واحد إلى هيئة رغوة تقريبي 30 × 30 سم ليكون بمثابة مجلس تشريح. استخدام دبابيس الأربع المتبقية خلال العملية. إعداد لوحة رغوة أصغر مع لوحة العمليات جراحية لنقل الأجهزة إلى الجدول بعد العملية.
    تنبيه: إيسوفلوراني (99.9%) المواد كيميائية سامة، وينبغي أن تستخدم في غطاء تنفيس لضمان أقصى مستوى من الأمان من مسح النفايات غاز مخدر 8. يمكن العثور على معلومات إضافية فيما يتعلق بالمخاطر التي يتعرض لها الباحثون المقترنة باستخدام الأسلوب فتح المنسدلة استخدام إيسوفلوراني في مقال ب تايلور وموك 8-
  6. وضع لوح الجراحية واحد في جرة زجاجية ونقع مع بضع قطرات من إيسوفلوراني (99.9%) ثم ضع منشفة ورقية عبر الجزء العلوي للحيلولة دون الاتصال المباشر للماوس مع إيسوفلوراني. وبالمثل، استخدام لوحة العمليات جراحية لخط الأنبوب المتبقي ونقع مع بضع قطرات من إيسوفلوراني ووضع لوحة إضافية عبر الجزء العلوي للحيلولة دون الاتصال المباشر بين الماوس وإيسوفلوراني.
  7. صب النتروجين السائل في فم واسعة الضحلة هو التوصل إلى ديوار حتى الحد الأقصى لملء خط-
  8. مكان الماوس المحدد للتشريح في التخدير للدائرة، أي قطرات جرة زجاج مع لوحة غارقة مع عدد قليل من إيسوفلوراني (99.9%) مغطاة بالغطاء، لدقيقة ~ 1
    ملاحظة: يختلف هذا الوقت من الماوس. مرة واحدة الماوس فاقد الوعي، إزالته من الدائرة ووضعه على لوحة التشغيل.
  9. توجيه الماوس حيث أن ذلك هو الكذب الجانب البطني ومع رئيسها وأشار بعيداً عن العالم. وضع الرأس داخل أنبوب مبطنة بوسادة جراحية غارقة مع بضع قطرات من إيسوفلوراني (99.9%)، وإجراء اختبار تحفيز برشة سيرا على أقدام التأكد من أن الماوس لا يستجيب للمنبهات.
    1. إذا فشل هذا الاختبار والماوس يستجيب لاختبار قرصه سيرا على الأقدام، كرر الخطوة 1.8.

2. الأولى شق وثقب القلب والقتل الرحيم

  1. دبوس أطرافه الماوس للمجلس رغوة الجراحية والرطب في الجانب البطني من الماوس مع الإيثانول 70%-
  2. قرصه الفراء/الجلد بالقرب من افتتاح الاحليل مع الملقط وسحب إلى أعلى قليلاً. جعل شق بالمقص الجراحي عن طريق تجويف البطن ابتداء من فتح الاحليل، خط الوسط وتنتهي في الذقن.
    1. قرب نقطة انطلاق لشق الأولى، الاستيلاء على جانب واحد من الجلد/الفراء مع الملقط وجعل شق آخر مع المقص إلى الأسفل وقطرياً نحو مخلب الظهر.
    2. كرر هذا بنفس الطريقة على الجانب الآخر-
      ملاحظة: قد يكون تمركزها إلى خلق فرصة أوسع الفراء/الجلد، ولكن ليس من الضروري-
  3. موقع القلب وإزالة تامور، وهو الكيس حول القلب، لتجنب انسداد من إبرة المحقن. فهم تامور مع الملقط
    1. وقطع عليه مع المقص. إجراء ثقب القلب بإدخال إبرة حقنه بعناية في قلب ينبض وتبدأ ببطء لسحب المكبس.
    2. لجمع الدم الأمثل، واستخدام المكبس الإبرة لتقليد عمل الضخ للقلب وتجنب الرسم بسرعة كبيرة جداً-
      ملاحظة: عادة حوالي 1 مل دم يمكن جمعها-
    3. بعد الانتهاء من جمع الدم، تبديد الدم في أنبوب جهاز الطرد المركزي والتخلص من المحاقن في حاوية الأدوات الحادة-
    4. بعد أن يتم إجراء ثقب القلب، القيام بالقتل الرحيم بإزالة المرفقات يربط القلب.
      ملاحظة: لم يتم إضافة الهيبارين، تخثر المضادة، لحقنه في هذا الإجراء قبل ثقب القلب للسماح للدم يتجمد لجمع المصل في هذه الدراسة المحددة. ومع ذلك، إذا أراد الباحث أن منع تخثر الدم جمع البلازما، يمكن إضافة الهيبارين للمحاقن قبل ثقب القلب-
  4. إذا كان ينطوي الدراسة الوراثي للفأرة، قص جزء من الإذن مع المقص ووضع في أنبوب الطرد مركزي لتحقق وراثي.

3-"استخراج البنكرياس"

  1. تحديد موقع المعدة على الجانب الأيسر للماوس. تبدأ بلطف (لتجنب تمزيق) فصل البنكرياس من المعدة والاثني عشر باستخدام الملقط اثنين.
    ملاحظة: عند فصل البنكرياس من المعدة والأمعاء، من المهم جداً أن الملقط تستخدم بلطف دليل نسيج البنكرياس بعيداً عن الأجهزة وعدم سحق أو المسيل للدموع البنكرياس مع الملقط.
    1. الاستمرار في فصل البنكرياس من أقسام الأمعاء صائم والدقاق، وأخيراً من الأعور الأمعاء الغليظة.
  2. في الأعور، تغيير موضع الملقط ومواصلة الفصل بين البنكرياس على طول القولون المتبقية نحو المستقيم.
    ملاحظة: عند هذه النقطة، أنها ملائمة لخفض وإزالة الجزء من المعدة إلى منطقة القولون السابقة مباشرة للمستقيم.
  3. تحديد موقع البنكرياس والطحال. شريحة البنكرياس نحو الجانب الأيمن من الماوس. فصل الاتصالات المتبقية بين البنكرياس وتجويف الصدر بالملقط لفصل كامل البنكرياس والطحال ملاصقة.
  4. إزالة البنكرياس وانتشرت للفحص. اترك الطحال يعلق على البنكرياس لأغراض تحديد الهوية. النسيج الضام
    1. إزالة الكل، والأنسجة والدهون والمساريقي العلوي من البنكرياس.
      ملاحظة: هذا النسيج بياضا في اللون وهكذا يمكن تمييزها بسهولة عن أنسجة البنكرياس هو وردي اللون. هذا مهم خاصة إذا كان البنكرياس كله يحتاج إلى إزالة. على سبيل المثال، إذا كان البنكرياس بحاجة إلى موازنة ومقارنة مع وزن الجسم، أو بين مجموعات من الحيوانات. في Ptf1a cre/+؛ LSL-كراس G12D/+ نموذج الماوس، وعلى وجه التحديد في الشهور القديمة، يمكن أن تكون أنسجة البنكرياس الليفي الثابت الحالي. وفي هذه الحالة، يجب أن تتم إزالة حذراً من البنكرياس كما يمكن أن يكون متشابك الأمعاء في أنسجة الورم. في الحالات المتقدمة، الطحال غير طبيعي ونسيج الكبد قد يكون أيضا هذا-
  5. إذا كان مطلوباً، إزالة الأجهزة الأخرى عند هذه النقطة.

4-جمع البيانات وتخزينها

  1. بعد استخراج الأجهزة، نقل العينات إلى منطقة ما بعد الجراحة للحفاظ على-
  2. تزن كل جهاز ووضعها في قنينة المبردة كل منهما.
    ملاحظة: على طول فيتح الشامل لكل عينة، ينبغي أن تسجل أي مخالفات للرجوع إليها في المستقبل-
  3. حالما يتم وزن الأجهزة، وضعها في النيتروجين السائل لتجميد المفاجئة.
  4. بعد تجميد المفاجئة، تخزين الأجهزة في-80 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.
  5. بوضع عينات الفورمالين المخزنة في أعلى هيئة بين عشية وضحاها، وصباح اليوم التالي بتغيير حل بهم من الفورمالين إلى إيثانول 70%-
    ملاحظة: يجب تخزين هذه العينات عند 4 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.
  6. للتخزين على المدى الطويل، تجميد لكمه الدم والإذن في-80 درجة مئوية. لجمع المصل من الدم، تسمح للدم أن يتجمد لمدة 30 دقيقة ثم الطرد المركزي أنه. إزالة الجزء المصل باستخدام ماصة ومن ثم تخزين في-80 درجة مئوية.

5. تنظيف

  1. سانيتيزي جميع تشريح مع مناديل تعقيم أدوات. غطاء أنبوب تصطف isoflurane غارقة في لوحة العمليات الجراحية. استبدال لوحة المفاتيح الجراحية على متن الرغوة مع لوحة جراحة طازجة. التصرف في أجزاء الماوس التي جمعت لا كل المرفق ' سياسة التخلص من الحيوانات s-

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

ويبين الشكل 1 نظرة عامة مجال البيئة التشغيلية، ويبين الشكل 2 في مجال تشغيل وظيفة. وبينما يوفر هذا الإعداد الحد الأدنى من المعدات والتدريج، يجوز اختيار الأفراد لتغيير هذا لتناسب الاحتياجات الفردية. ينبغي أن يكون الأمثل في البروتوكول وفقا للاحتياجات المحددة للتجربة. ويجري هذا الإجراء بطريقة ينهي حياة الفأر، التي تتطلب يوثانيزيشن السليم9. عند الباحث جاهزاً، يتم وضع الماوس في غرفة التخدير مع منصات غارقة في إيس...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

أهمية فيما يتعلق بالأساليب القائمة
على الرغم من وجود أشرطة فيديو أخرى غير رسمية لتشريح الفأر، توفر هذه المقالة الفيديو الجودة الفنية الأولى، واستعراض النظراء، مظاهرة البصرية لجميع الخطوات التفصيلية المطلوبة للاستخراج وحصاد البنكرياس الماوس بتشريح10 . مع البنكرياس جهاز الرئيسي للنشاط الأيضي والإنسولين ويجري إنتاج وتشريح وحصاد البنكرياس يسمح للحفاظ على الخصائص الفسيولوجية11. بعزل البنكرياس، يمكن إجراء التحليل في المستقبل على العينة. يسمح هذا الإجراء للمقار...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

MAK تعترف بتقديم الدعم لهذا العمل من "المعاهد الوطنية للصحة"/منح المعهد الوطني للسرطان رقم-1R15CA152985-01A1. كما دعمت هذا المشروع "ميامي جامعة الدراسات الجامعية البحوث جائزة البرنامج"، الفرص الجامعية الدكتوراه جامعة ميامي لبرنامج المنح الدراسية وبرنامج الباحثين الصيف جامعة ميامي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
جرة زجاجية Corning3140-150تم إيقاف الجرة الزجاجية المستخدمة في الفيديو. هذا هو بديله.
غطاء جرة زجاجيةCorning9985-150إيقاف غطاء البرطمان الزجاجي المستخدم في الفيديو. هذا هو بديله.
15 مل Falcon TubesFisher Scientific339650
مقص جراحيFisher Scientific9201
زجاجة ضغط   ؛فيشر ساينتفيك03-409-10DD
100٪ إيثانولفيشر ساینتفيك22-032-103
فورمالينفيشر Scientific245-684
ألواح الرغوةTherapak562908
ملقطفيشر Scientific200205SHN
1 مل 21G محاقنBD Biosciences309624
50 مل Falcon TubesFisher Scientific339652
2.0 مل أنابيب الطرد المركزي الدقيقة   ؛فيشر ساينتفيك02-681-258
منصات جراحيةفيشر ScientificS67011
T-Pins الطول:  2" منتجات المتجر المتقدمX32T-05
مناديل التعقيمالمهنية للمستهلكات الدوليةQ85084
حاويات الأدوات الحادةفيشر Scientific14-827-122
الميزان التحليليمارشال ScientificME-AE200
4L ديوارتايلور وارتون4LD
ضحل واسع الفم ديوارفيشر ScientificF3087-V
رف Microtube عائمVWR60986-100
قارورة مبردة 1.2 مل ، فيشرعلميمعقم 10-500-25
Isothesia (Isoflurane)   ؛هنري شاين صحة050033
النيتروجين السائلرايت براذرزNIT-60-XX
ماوس كراس سلالةمختبر جاكسونOO8179
Mouse Cre سلالةMMRRCOOO435-UNC
تم

المراجع

  1. Fesinmeyer, M. D., Austin, M. A., Li, C. I., De Roos, A. J., Bowen, D. J. Differences in Survival by Histologic Type of Pancreatic Cancer. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 14 (7), 1766-1773 (2005).
  2. Jackson-Grusby, L. Modeling cancer in mice. Oncogene. 21 (35), 5504-5514 (2002).
  3. Heid, I., et al. Early requirement of Rac1 in a mouse model of pancreatic cancer. Gastroenterology. 141 (2), 719-730 (2011).
  4. Hingorani, S. R., et al. Preinvasive and invasive ductal pancreatic cancer and its early detection in the mouse. Cancer cell. 4 (6), 437-450 (2003).
  5. Shi, C., et al. KRAS2 Mutations in Human Pancreatic Acinar-Ductal Metaplastic Lesions Are Limited to Those with PanIN Implications for the Human Pancreatic Cancer Cell of Origin. Mol Cancer Res. 7 (2), 230-236 (2009).
  6. LaConti, J. J., et al. Distinct serum metabolomics profiles associated with malignant progression in the KrasG12D mouse model of pancreatic ductal adenocarcinoma. BMC Genomics. 16 (1), 1-10 (2015).
  7. Ludwig, M. R., et al. Surveying the serologic proteome in a tissue-specific kras(G12D) knockin mouse model of pancreatic cancer. Proteomics. 16 (3), 516-531 (2016).
  8. Taylor, D. K., Mook, D. M. Isoflurane Waste Anesthetic Gas Concentrations Associated with the Open-Drop Method. J Am Assoc Lab Anim Sci. 48 (1), 61-64 (2009).
  9. Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. J Pharmacol Pharmacother. 1 (2), 87-93 (2010).
  10. Li, D. S., Yuan, Y. H., Tu, H. J., Liang, Q. L., Dai, L. J. A protocol for islet isolation from mouse pancreas. Nature Protocols. 4 (11), 1649-1652 (2009).
  11. Auer, H., et al. The effects of frozen tissue storage conditions on the integrity of RNA and protein. Biotech Histochem. 89 (7), 518-528 (2014).
  12. Ma, J., Leung, L. S. Limbic System Participates in Mediating the Effects of General Anesthetics. Neuropsychopharmacology. 31, 1177-1192 (2006).
  13. Ijichi, H., et al. Aggressive pancreatic ductal adenocarcinoma in mice caused by pancreas-specific blockade of transforming growth factor-β signaling in cooperation with active Kras expression. Genes Dev. 20 (22), 3147-3160 (2006).
  14. Abiatari, I., et al. Moesin-dependent cytoskeleton remodelling is associated with an anaplastic phenotype of pancreatic cancer. J Cell Mol Med. 14 (5), 1166-1179 (2010).
  15. Goodpaster, A. M., Romick-Rosendale, L. E., Kennedy, M. A. a Statistical significance analysis of nuclear magnetic resonance-based metabonomics data. Analytical biochemistry. 401, 134-143 (2010).
  16. Yadav, D., et al. Idiopathic Tumefactive Chronic Pancreatitis: Clinical Profile, Histology, and Natural History After Resection. Clin Gastroenterol Hepatol. 1 (2), 129-135 (2003).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة