نقدم حل البرمجيات لتتبع شبه الآلي من تركيز البروتين النسبي على طول نتوءات الخلوية الديناميكية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
واجهة المستخدم الرسومية لتتبع بمساعدة برنامج تركيز البروتين في النتوءات الخلوية الديناميكية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
فيلوبوديا هي ديناميكية، تشبه الإصبع النتوءات الخلوية المرتبطة الهجرة والاتصالات الخلوية الخلية. من أجل فهم أفضل لآليات الإشارات المعقدة الكامنة وراء بدء فيلودوديال، استطالة وتثبيت لاحق أو تراجع، فمن الأهمية بمكان لتحديد النشاط البروتيني الزماني المكاني في هذه الهياكل الحيوية. لتحليل وظيفة البروتين في فيلوبوديا، قمنا مؤخرا بتطوير خوارزمية التتبع شبه الآلي التي تتكيف مع فيلوبوديال شكل التغييرات، مما يسمح تحليل مواز للديناميات نتوء وتركيز البروتين النسبي على طول طول فيلوبوديال كله. هنا، نقدم بروتوكول مفصل خطوة بخطوة لتحسين التعامل مع الخلايا، والحصول على الصور وتحليل البرمجيات. كما نقدم إرشادات لاستخدام الميزات الاختيارية أثناء تحليل الصور وتمثيل البيانات، بالإضافة إلى إرشادات تحري الخلل وإصلاحه لجميع الخطوات المهمة على طول الطريق. وأخيرا، فإننا تشمل أيضا مقارنة دبرنامج تحليل الصور المقتبسة مع البرامج الأخرى المتاحة لتقدير فيلوبوديا. معا، يوفر البروتوكول المقدم إطارا لتحليل دقيق للديناميات البروتين في نتوءات فيلوبوديال باستخدام برنامج تحليل الصور.
المقدمة
وترتبط السيطرة المكانية والزمانية للبروتينات التنظيمية أكتين مع ديناميات فيلوبوديوم 1 ، 2 . تتبع مكانيا حل تركيز البروتين على طول طول فيلوبوديال كله من خلال الوقت هو بالتالي حاسمة لتعزيز فهمنا للآليات الكامنة بدء، استطالة، استقرار أو انهيار هذه الهياكل الديناميكية 3 ، 4 . على عكس تحليل البروتين في السيتوسول، حيث تحدث العديد من التغييرات شكل الخلية على نطاق أوسع، فيلوبوديا هي الهياكل الدقيقة الحيوية التي مشبك باستمرار 5 والانحناء، وبالتالي يحول دون تحليل باستخدام نهج بسيط مثل خط المسح الضوئي.
حلول البرمجيات المختلفة لتتبع شكل فيلوبوديال متاحة 6 ، 7 ، 8 ، 9 . Likewأيس، وقد تم تطوير البرمجيات لتتبع راتيوميتريك من ديناميات البروتين داخل الجسم الخلية 10 ، 11 . للجمع بين التتبع الآلي لشكل فيلوبوديال وتحليل البروتين المكاني والزماني، قمنا مؤخرا بتطوير برنامج تحليل الصور على أساس خوارزمية محدبة-بدن 12 . طريقة التحليل الرواية هذه، التي يتم تشغيلها من خلال واجهة المستخدم الرسومية (غوي)، تجمع لأول مرة، تركيز البروتين النسبي على طول طول الفيلوبوديال وسرعة النمو، مما يسمح بالقياس الدقيق لتوزيع البروتين المكاني الزماني المستقل عن حركة هذه الهياكل الديناميكية 12 .
الفكرة وراء البرنامج (شفرة المصدر متاحة بحرية، انظر أدناه) هو أن واحدة من القمم من بدن محدب سوف تتزامن مع غيض من فيلوبوديوم ( الشكل 1A ). من خلال النظر في الإطار اللاحق فوr أقرب قمة الرأس من محدب بدن، ويمكن تتبع طرف متحرك في جميع أنحاء الفيلم كله. مرة واحدة يتم الكشف عن طرف في كل إطار، يتم استخدام موقفها لرسم محور عن طريق الانضمام إلى طرف مع نقطة مرجعية في قاعدة فيلوبوديوم ( الشكل 1B ). وأخيرا، تستخدم النقاط العشرية متساوية البعد، التي يتم تحديد مواقفها من قبل بكسل المتوسط مع أقصى كثافة على طول خط متعامد للمحور، وتستخدم لتحديد العمود الفقري الذي يتبع شكل فيلوبوديال. الاستفادة من هذا العمود الفقري للتكيف، يتم إنشاء كيموجراف لتتبع نمو فيلوبوديال وتركيزات البروتين لمدة تصل إلى ثلاث قنوات على طول طول فيلوبوديال ( الشكل 1C ).
الشكل 1: مبدأ العمل من برامج تحليل الصور. ( A ) الخوارزمية وراءالبرنامج. في STEP1 يحدد المستخدم المرجع (قاعدة) و قمة الرأس (غيض) من فيلوبوديوم. في الخطوة 2-1 يتم الحصول على العمود الفقري للفيلوبوديوم باستخدام بكسل المتوسطة مع أقصى قيمة شدة. في الخطوة 3 يتم استخدام العمود الفقري لملامح كثافة البروتين المكاني. في الخطوة 2-2 يقوم البرنامج بتتبع الطرف تلقائيا في الإطار اللاحق. الإجراء بأكمله يتكرر. ( ب ) لقطة من الخوارزمية مع فيلوبوديوم الحقيقي إدخال عناصر هامة مثل الهيكل المحدب الذي يتم استخدامه للتتبع. ( C ) نظرة عامة على المعلمات التي يمكن قياسها مع الخوارزمية. وقد عدل هذا الرقم من المرجع 12 . الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
يتم تشغيل برنامج تحليل الصور في ماتلاب (المشار إليها باسم برمجة البرمجيات) عن طريق استخدام رسوميةr واجهة. لتحقيق أقصى قدر من المرونة والمتانة لإعداد تجريبي معين، يمكن للمستخدم ضبط سلسلة من المعلمات تتبع (على سبيل المثال يسمح زاوية الانحناء والحركة بين الإطار) وأيضا إجراء بعض التصحيحات على الأفلام ( مثل المحاصيل، والتناوب، وإزالة الأجسام غير المرغوب فيها) ( الشكل 2A والجدول 1) .
| واجهة المستخدم الرسومية | لا. | إلزامي | وصف | الاسم (في واجهة المستخدم الرسومية) | ||||
| # 1 | 1A | Y | تحميل ملف .tiff مكدسة تمثل الجسم الخلية (مع مربع فحص) أو إنشاء جسم خلية فرضه من القنوات | CellBody | ||||
| # 1 | 1B | Y | تحميل ملف صورة مكدسة المقابلة للبروتين 1 | البروتين 1 | ||||
| # 1 | 1C | Y | تحميل ملف صورة مكدسة المقابلة للبروتين 2 | بروتين 2 | ||||
| # 1 | 1D | Y | تحميل ملف صورة مكدسة المقابلة للبروتين 3 | بروتين 3 | ||||
| # 1 | 1E | N | إعادة تعيين كل شيء لتحميل مسبق ملفات الصور مكدسة | إعادة تعيين | ||||
| # 1 | 2A | Y | شريط التمرير لتحديد الإطار الأولي للتحليل في إطار واجهة المستخدم الرسومية # 2 | NA | ||||
| # 1 | 2B | Y | شريط التمرير لتحديد الإطار النهائي للتحليل في نافذة واجهة المستخدم الرسومية # 2 | NA | ||||
| # 1 | 2C | Y | شريط التمرير يمثل كيرنت الإطار | NA | ||||
| # 1 | 2D | N | القيمة الرمادية للبكسل التي سيتم تعيين جميع وحدات البكسل فيها على الصفر | NA | ||||
| # 1 | 2E | N | القيمة الرمادية للبكسل التي سيتم تعيين جميع وحدات البكسل فيها على القيم القصوى | NA | ||||
| # 1 | 2F | N | عين قيم شدة البكسل المحددة بواسطة <2e> & <2f> | جلس | ||||
| # 1 | 2G | N | تلعب الفيلم تعديل كثافة | لعب | ||||
| # 1 | 2H | N | قص الصوره | ا & قتصاص | ||||
| # 1 | 2I | N | تدوير الصورة | استدارة | ||||
| # 1 | 2J | N | احذف المناطق في المجموعة بأكملها | حذف المناطق | ||||
| # 1 | 3A | Y | انقر لفتح "نافذة التحليل" (نافذة واجهة المستخدم الرسومية رقم 2) | نافذة التتبع | ||||
| # 1 | 3B | Y | أدخل حجم بكسل في ميكرون | أدخل حجم بكسل | ||||
| # 2 | 4 | Y | انقر لتوليد صورة الحدود / حافة الجسم الخلية فرضه | حدود | ||||
| # 2 | 5 | Y | انقر لتحديد قاعدة و غيض من فيلوبوديا | Referernce | ||||
| # 2 | 6A | Y | أدخل عدد الشرائح أو العقد | لا من القطاعات | ||||
| # 2 | 6B | Y | أدخل طول المسح الضوئي (عمودي على المحور) | عرض المسح الضوئي | ||||
| # 2 | 6C | Y | أدخل طول أعلاه الذي فيلوبوديا يبدأ الانحناء | دقيقة دقيقة بعد | ||||
| # 2 | 6D | Y | أدخل نصف قطر الدائرة الكشف عن طرف (أي المنطقة حيث يمكن أن تكون موضعيا قمة الرأس في الإطار التالي) | نصف القطر للكشف عن طرف | ||||
| # 2 | 6E | Y | أدخل أقصى زاوية فيلوبوديوم يمكن أن ينحني من المحور الرأسي | زاوية العتبة | ||||
| # 2 | 6F | N | إضافة نقاط مرجعية للقاعدة والطرف لهذا الإطار المحدد | حدد المرجع | ||||
| # 2 | 6G | N | أدخل طول أعلاه الذي فيلوبوديا يبدأ الانحناء لهذا الإطار محددة | دقيقة دقيقة بعد | ||||
| # 2 | 6H | N | أدخل نصف قطر دائرة الكشف عن هذا الإطار المحدد | نصف القطر للكشف عن طرف | ||||
| # 2 | 6I | N | بعد إدخال كافة المعلمات لإطار محدد انقر لتخزين القيم إلى الذاكرة والملف لمزيد من المرجع | إضافة | ||||
| # 2 | 6J | N | انقر لحذف مجموعة المعلمات يدويا لهذا الإطار | حذف | ||||
| # 2 | 6K | N | انقر لحذف جميع المعلمات المخزنة يدويا باستخدام "لوحة الميزات الاختيارية" لجميع الإطارات | إعادة تعيين | ||||
| # 2 | 6L | N | تحقق قبل المتابعة لتخزين جميع نتائج التتبع في الذاكرة للرجوع إليها في المستقبل | تتبع التاريخ | ||||
| # 2 | 7 | Y | انقر لبدء التتبع | تتبع وتحليل | ||||
| # 2 | 8A | N | انقر لبدء تتبع كثافة قناة البروتين | تحليل كثافة البروتين | ||||
| # 2 | 8B | N | تحقق في لتتبع كثافة قناة البروتين على طول طول فيلوبوديال | فيلوبوديا كله | ||||
| # 2 | 8C | N | تحقق في لتتبع البروتين المرجعي أو البروتين A | ProteinA | ||||
| # 2 | 8D | N | تحقق في لتتبع البروتين B | ProteinB | ||||
| # 2 | 8E | N | تحقق في لتتبع البروتين C | ProteinC | ||||
| # 2 | 8F | N | تحقق في لتتبع متوسط كثافة البروتين في ثe تلميح | نصيحة رئيسية | ||||
| # 2 | 8G | N | أدخل طول الطرف | طول النصيحة | ||||
| # 2 | 8H | N | أدخل الحد الأدنى للمسافة من القاعدة أعلاه التي تبدأ غيض تشكيلها | عتبة | ||||
| # 2 | 8I | N | انقر لحفظ نتائج تحليل تلميح الرائدة للملف | اضغط الزر | ||||
| # 2 | 9A | N | انقر لبدء تحليل البروتين راتيوميتريك | قارن | ||||
| # 2 | 9B | N | تحقق في مقارنة البروتين B فيما يتعلق A | LOG10 (B / A) | ||||
| # 2 | 9C | N | تحقق في مقارنة البروتين C فيما يتعلق A | LOG10 (C / A) | ||||
| # 2 | 9D | N | تحقق في مقارنة البروتين B فيما يتعلق A في الطرف | LOG10 (B / A) | ||||
| # 2 | 9E | N | تحقق في مقارنة البروتين C فيما يتعلق A في الطرف | LOG10 (C / A) | ||||
| # 2 | 10A | N | اختر خريطة ألوان أخرى (افتراضي: جيتبلوت) | لون خريطة | ||||
| # 2 | 10B | N | عدل كولورماب | تحرير كولورماب | ||||
الجدول 1: نظرة عامة على جميع الوظائف الموجودة في واجهة المستخدم الرسومية ويندوز # 1 و # 2.
مرة واحدة يتم إنجاز هذا، البرنامج بإنشاء بدن محدب وتتبع تلقائيا طرف في جميع أنحاء الفيلم. المعلمات المستخرجة من الفيلم، مثل كيموغراف راتيوميتريك، سرعة النمو، وطول فيلوبوديالإعادة عرض وتخزينها أيضا في مجلد العمل كصور وملفات البيانات. ويمكن بعد ذلك استخراج غيرها من المعالم مثل فيلوبوديال العمر، ومعدل النمو ومعدل التراجع وتحليلها من ملفات البيانات المخزنة ( الشكل 2B ).
الشكل 2: واجهة المستخدم الرسومية لاستخدام برامج تحليل الصور. ( A ) يستخدم واجهة المستخدم الرسومية نافذة رقم 1 لتحميل الصور ومعالجتها. يمكن للبرنامج تحميل ما يصل إلى 3 قنوات البروتين، حيث يتم مقارنة 2 قنوات زوج من الحكمة. نافذة يأتي مع إلزامية (الأزرق) وميزات اختيارية (الأخضر) لمرحلة ما قبل تجهيز الصور قبل تتبع ( B ) يستخدم واجهة المستخدم الرسومية نافذة # 2 لتتبع فيلوبوديوم وكذلك المكاني الزماني وتحليل نسبة البروتين متري. مرة أخرى، يتم تمييز الميزات الاختيارية باللون الأخضر. وقد كان هذا الرقم معدلاإد من المرجع 12 . الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
هنا، نقدم بروتوكول مفصل لإعداد العينات والتعامل مع البرمجيات. نبدأ مع تعليمات مفصلة حول زراعة الخلايا والحصول على الأفلام الأمثل لتحليل الصور. ويتبع هذا القسم المتعلق باقتناء البيانات وصفا تفصيليا لتشغيل برمجيات تحليل الصور. في جميع أنحاء البروتوكول، ونحن نقدم خطوات حاسمة والميزات الاختيارية التي ينبغي النظر فيها عند جمع ومعالجة البيانات. وأخيرا، فإننا نحلل فيلوبوديا من أنظمة نموذجية مختلفة مع برنامج تحليل الصور، قبل أن يغلق مع مقارنة بين برامج تحليل الصور الموصوفة مع البرامج الأخرى المتاحة للقياس الكمي فيلوبوديال ومناقشة حول القيود والتوجه المستقبلي.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. خلية الثقافة
- ثقافة هيلا أو كوز الخلايا في دولبيكو تعديل النسر المتوسطة (دمم) التي تحتوي على 4.5 غرام / لتر D- الجلوكوز، L- ألانين- L- الجلوتامين الببتيد، البيروفات، 10٪ مصل بقري الجنين، و 10 وحدة / مل من البنسلين / الستربتومايسين. الخلايا العصبية الثقافة في الثقافة وسائل الإعلام دون L- الجلوتامين، حمض الجلوتاميك أو حمض الأسبارتيك، تستكمل مع 0.5 ملي L- ألانين- L- الجلوتامين ثنائي الببتيد، والمكملات العصبية خالية من المصل و 10 وحدة / مل من البنسلين / الستربتومايسين.
- مرة واحدة يتم التوصل 40٪ كونفلنسي، خلايا ترانسفكت مع بنيات الاختيار باستخدام كاشف ترنسفكأيشن وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. إبقاء الخلايا ترانزفكتد في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ كو 2 لمدة 15-18 ساعة.
- للحد من التغيرات في درجة الحموضة والأسمولية (بسبب التبخر) أثناء الحصول على الصور، وملء غرف زراعة الخلايا (قبل التصوير) تصل إلى 90٪ مع 37 درجة مئوية قبل تحسنت المتوسطة التي تحتوي على 20 ملم 4- (2-هيدروكسي إيثيل) -1 -piperazineethanesulfonic أسيد (هيبيس). لختمالغطاء، وتطبيق طبقة رقيقة من فراغ الشحوم على داخل الغطاء وضغط بلطف على غرفة الثقافة التي تحتوي على الخلايا ترانزفكتد.
2. صورة اكتساب
ملاحظة: طول فيلوبوديا يختلف من 2-10 ميكرون 13 . فيلوبوديا تنمو بمعدل سرعة 0.05-0.1 ميكرون / ث 13 ، 14 .
- الحصول على الصور باستخدام المجهر مع 60X أو الهدف 100X وليس بينينغ بكسل (هنا، قرص الغزل المجهر متحد البؤر). استخدام معدلات اكتساب أكبر من 1 هيرتز (هرتز) لتتبع ديناميات فيلوبوديال. لتقليل التحف خارج التركيز، صورة فيلوبوديا بالقرب من الغشاء القاعدي ( أي سطح الركيزة).
- لضمان التتبع السلس، وضبط وقت التعرض للكاميرا وكثافة الليزر بحيث أن نسبة الإشارة إلى الضوضاء (شنر) أكبر من 4. تجنب تشبع القنوات الفردية ( أي قيم بكسل من255 للصور 8 بت و 65،535 للصور 16 بت)، وهذا سوف يحول دون تحليل الصورة اللاحقة.
- لتجنب تنزف من خلال، فقط استخدام علامات مضان متوافقة مع خطوط ليزر والمرشحات من المجهر (لمزيد من التفاصيل انظر المرجع 15 ).
3. صورة المعالجة المسبقة
مالحظة: استخدم برنامج إيماجيج أو أي برنامج آخر متاح لمعالجة الصور قبل المعالجة 16 ، 17 .
- إذا كانت العينة تتحرك، الصحيح للانجراف الجانبي باستخدام البرامج المتاحة (على سبيل المثال https://github.com/NMSchneider/fixTranslation-Macro_for_ImageJ) قبل التحليل. استبعاد الأفلام مع الانجراف المحوري (أي حركة في الاتجاه Z).
- الخلفية الصحيحة ( أي القيم الرمادية للمناطق خارج الخلية)، التبييض ( أي فقدان مستمر إذا شدة مضان بسبب الأضرار التي لحقت بروتينات مضان) واحتمال تنزف الحوض الصغير ( أي إشارة من انفلونزا واحدةمسبار الإزهار في كلتا القناتين) باستخدام البرامج المتاحة (على سبيل المثال http://imagej.net/Category:Plugins و 16 ، 17 ).
ملاحظة: شدة مضان من القنوات الفردية لا تتغير من قبل البرنامج. - لضمان تحليل الصورة اللاحقة، حفظ الأفلام المقابلة لقنوات البروتين معينة في نطاق الرمادية باسم '.tiff' تنسيق ملف مكدسة في مجلد العمل.
ملاحظة: أبعاد ( أي حجم وطول) من الأكوام يجب أن تكون نفسها لجميع القنوات.
4. تحليل صورة - الخطوة 1: تحميل الصور
ملاحظة: تم وصف البرنامج الموصوف هنا في ماتلاب (المشار إليها باسم برمجة البرمجيات) وسوف تعمل فقط مع هذا البرنامج.
- تحميل مجلد مضغوط تحتوي على كافة الملفات المطلوبة لتحليل الصور من الموقع التالي: https://campus.uni-muenster.de/en/einrichtungen/impb0/nanoscale-forces-in-cells/softwهي /. قم بفك ضغط الملفات ونسخها إلى مجلد العمل.
- وبمجرد تركيب، فتح برنامج البرمجة وتشغيل 'filopodiaAnalysisM3.fig'. سوف واجهة المستخدم الرسومية نافذة # 1 فتح كما هو مبين في الشكل 2A .
- تحميل ملفات مكدسة 'تيف' المحفوظة المقابلة لبروتين معين من الفائدة في واجهة المستخدم الرسومية نافذة # 1 باستخدام أزرار <1b> للبروتين A، <1C> للبروتين B، <1d> للبروتين C. انظر الشكل 2 والجدول 1 للحصول على التفاصيل.
ملاحظة: البروتين A هو مبين في واجهة المستخدم الرسومية نافذة # 1 بمثابة القناة المرجعية لتحليل النسبية النهائية. - إنشاء صورة فرضه من الخلية من القنوات البروتين عن طريق النقر <1a>.
- انقر على <2a> لتعيين الإطار الأول و <2 b> للإطار الأخير المستخدم للتحليل.
- اختياريا، اقتصاص المنطقة من الفائدة (روي) التي تحتوي على فيلوبوديوم الفائدة باستخدام زر <2H>، تدوير الصورة شزر الغناء <2i>، أو حذف المناطق غير المرغوب فيها باستخدام أداة الرسم الحر <2j>.
ملاحظة: لتبسيط تحليل الصورة، فمن المستحسن لعزل العائد على الاستثمار ( أي المحاصيل، وتناوب، وحذف) جنبا إلى جنب مع خطوات المعالجة المسبقة الأخرى (الطرح الخلفية، وتصحيح التبييض، وما إلى ذلك) باستخدام إيماجيج. - حرك شريط التمرير <2c> لكل إطار لمراقبة الجودة والتحقق مما إذا كان فيلوبوديوم لا يزال مرئيا بوضوح في جميع أنحاء الفيلم كله.
5. تحليل صورة - الخطوة 2: توليد تتبع
- انقر على زر <3a> في واجهة المستخدم الرسومية نافذة # 1 لفتح واجهة المستخدم الرسومية نافذة # 2 (انظر الشكل 2B ).
- انقر على زر <4> في غوي ويندو # 2 لإنشاء قناع الجسم الخلية فرضه (ولدت في واجهة المستخدم الرسومية نافذة # 1 بعد النقر <1a>). كما يولد البرنامج حدود القناع، حيث يتم تنفيذ بدن محدب للحصول على نقاط قمة الرأس.
- المبادرة القطريةسك زر <5>؛ سيظهر المؤشر. استخدام المؤشر لتحديد القاعدة (من حيث يتم قياس المسافة من طرف فيلوبوديال) تليها غيض من فيلوبوديا في الإطار حيث يظهر لأول مرة. للقيام بذلك، حرك شريط التمرير في إطار # 2).
ملاحظة: لتقليل الأخطاء في إخراج البيانات، ضع نقطة الأساس عموديا تحت طرف فيلوبوديال على طول المحور. وضع نقطة الأساس على أماكن أخرى (على سبيل المثال تحولت أفقيا) قد يعرض تحيز اتجاهي في قيم مضان داخل الجسم الخلية. - حدد طول العتبة (فوق الذي سينحني فيلوبوديا) باستخدام <6C>.
ملاحظة: يتم تعريف هذا الطول على أنه المسافة بين نقطة الأساس (المحددة باستخدام <5>) وحدود الجسم الخلية ( أي المنطقة من حيث يبدأ فيلوبوديا النمو). وتقاس المسافة بالبكسل. - حدد عدد الشرائح المستخدمة لتقريب شكل فيلوبوديا في المربع <6a>.
ملاحظة: مالعدد الأقصى من القطاعات يعتمد على طول القصوى التي تم التوصل إليها من قبل فيلوبوديوم، ولكن أيضا كيف ينحني فيلوبوديوم. لا تقم بتحديد عدد من الشرائح أكبر من عدد البكسل بين القاعدة والطرف ( أي طول العتبة). تحديد شرائح أكثر من الحد الأقصى المحدد في الخطوة 5.4. ( أي عدد البكسلات بين القاعدة والطرف) سوف يؤدي إلى المبالغة في تقدير طول فيلوبوديوم. - حدد عرض المسح الضوئي، والذي يعمل كماسح أفقي لوضع العقد، في <6b>.
ملاحظة: يتم استخدام هذه العقد من قبل البرنامج لتناسب خط الانضمام إلى القاعدة و غيض مع الجسم من فيلوبوديوم ( أي لإنشاء العمود الفقري). كنقطة انطلاق، ضع قيمة بالبكسل تساوي الحد الأقصى للطول مضروبا بعامل
. - حدد نصف قطر المسح الضوئي (بالبكسل) في المربع <6d>. استخدام قيمة ما يقرب من 50٪ أكبر من أوبخدم بين الإطار النزوح طرف.
ملاحظة: استخدام دائرة نصف قطرها مسح كبير جدا قد انتزاع نقاط غير محدب-بدن محدب في الإطارات حيث لا توجد طرف فيلوبوديال الحقيقي (على سبيل المثال من حركة الطائرة أو انخفاض شنر). - حدد زاوية الانحناء في المربع <6e>.
ملاحظة: يتم تحديد عتبة زاوية من قبل أقصى زاوية فيلوبوديوم الانحناء خلال التحليل كله. تحديد عتبة زاوية يساعد البرنامج لاستبعاد تتبع الهياكل غير المرغوب فيها المتنامية من جانب فيلوبوديا عندما ينحني فيلوبوديا نحو جسم الخلية. يعمل البرنامج بشكل موثوق ل فيلوبوديا مع زوايا إمالة أقل من 45 درجة من المحور الرأسي. - لبدء التتبع، انقر على الزر <التتبع والتحليل> في نافذة واجهة المستخدم الرسومية # 2. انقر فوق المربع "تتبع التاريخ" في غوي ويندو # 2 لحفظ بروتوكول التتبع بأكمله للرجوع إليها في المستقبل.
ملاحظة: بعد اكتمال إجراء التتبع، يتم تخزين طول فيلوبوديوم في كل إطار فيورقة اسمها 'length_vel' من 'dynamics.xlsx' للمراجع في المستقبل. وبالمثل، يتم تخزين كافة معلمات التتبع الأخرى في الورقة المسماة 'باراميترز' أوف 'dynamics.xlsx'. - اختياريا، إذا لم يتم الكشف عن فيلوبوديا تلقائيا في جميع الإطارات، استخدم الخطوات التالية لتصحيح يدويا لذلك.
- قم بزيارة الإطار المعني باستخدام شريط التمرير في ويندو # 2 وتحديد يدويا غيض من فيلوبوديوم.
ملاحظة: سيتم تمثيل الإطارات، حيث لا يتم الكشف عن نقاط بدن محدب بمنطقة زرقاء في نافذة تتبع نافذة واجهة المستخدم الرسومية # 2. ومن الضروري التحقق من زر "تتبع التاريخ" قبل بدء برنامج التتبع للوصول إلى الإحداثيات العقدية في هذا الإطار. - حدد النقاط المرجعية (قاعدة متبوعة بالنص) باستخدام <6f> في نافذة واجهة المستخدم الرسومية # 2. حدد المعلمات الأخرى مثل 'طول المسح الضوئي'، 'قياس دقيق بعد'، و 'أقصى زاوية الانحناء'. لهذا الإطار كما هو موضح في الخطوات 5.4-5.8.
- انقر على زر <6i> لحفظ المعلمات الجديدة (الخاصة بهذا الإطار الواحد). يجب تكرار الخطوات لجميع الإطارات التي تشير إليها المنطقة الزرقاء.
- عند الانتهاء، أعد تهيئة إجراء التتبع باستخدام <7>.
ملاحظة: هذا التصحيح يمكن أن تستخدم أيضا إذا كان البرنامج يتحول فجأة من فيلوبوديال واحد إلى آخر داخل الفيلم. كبديل، النظر في زراعة الأفلام التي تحتوي على فيلوبوديا متعددة.
- قم بزيارة الإطار المعني باستخدام شريط التمرير في ويندو # 2 وتحديد يدويا غيض من فيلوبوديوم.
6. تحليل الصورة - الخطوة 3: تحليل البروتين المكاني والزماني
- من أجل التحليل المكاني والزماني، حدد المربع الذي يمثله <8b> متبوعا بقناة البروتين ذات الاهتمام (<8c> و / أو <8d> و / أو <8e>).
ملاحظة: من الضروري تحديد بروتين A قبل تحليل النسبية (<9a>، <9b> و / أو <9c>) لأن البروتين A يستخدم كمرجع. - انقر على <8a>لبدء تتبع البروتين على طول طول فيلوبوديال باستخدام أثر ولدت في الخطوة 5.9.
7. تحليل صورة - الخطوة 4: تحليل البروتين نسبة متري
- حدد خانة الاختيار <9b> أو <9c> وانقر على الزر <9a> للحصول على المؤامرة النسبية المكانية والزمانية.
ملاحظة: لتجنب تحريف تركيز البروتين النسبي، لا ترسم صورة رااتيوميتريك كما X / Y ولكن كما سجل (X / Y). لاستخدامها في المستقبل، يتم تصدير المؤامرة النسبية في ملفات ".png" و ".fig"، ويتم تخزين البيانات المؤامرة الخام داخل الملف "dynamics.xlsx".
8. تحليل صورة - الخطوة 5: تحليل تلميح فليوبوديال
- حدد مربع الاختيار <8f> وحدد طول الطرف وطول العتبة من القاعدة باستخدام <8g> و <8h>. انقر على <زر الضغط> لحفظ البيانات إلى الملف 'dynamics.xlsx'. انقر على <تحليل كثافة البروتين> لتوليدتتبع شدة البروتين من طرف فيلوبوديال وانقاذ للتحليل راتيوميتريك.
مالحظة: يحدد طول الطرف عدد البكسالت عند الطرف المستخدم للتحليل. سيقوم البرنامج بإرجاع متوسط قيمة الشدة للبكسل عند الطرف فوق كل إطار. يحدد طول العتبة الحد الأدنى للمسافة من القاعدة إلى الطرف أعلاه الذي فيلوبوديوم (فيلوبوديال طرف) يبدأ النمو (وعندما يبدأ البرنامج تتبع قيمة شدة طرف). لذا يجب أن يكون طول الطرف أصغر من طول العتبة. - انقر على النسبة المطلوبة لتحليلها باستخدام <9d> أو <9e>.
- انقر على زر المقارنة <9a> لإنشاء البيانات النسبية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
باستخدام خلايا كوز ترانزفكتد مع علامة للأكتين الخيطية (و- تراكتين 18 والأحمر) ومرجع عصاري خلوي (الأخضر)، وجدنا نتوءات فيلوبوديال الغنية أكتين ( الشكل 3A ، لوحة أعلى). وأظهرت سلسلة زمنية أن فيلوبوديا تمتد بسرعة وسحب ( الشكل 3A ، لوحة الأوسط). باستخدام برنامج تحليل الصور، ثم تتبعنا فيلوبوديا الفردية. مقارنة بين طول فيلوبوديال يقاس باليد مقابل برنامج تحليل الصور أظهرت ...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
هنا نقدم بروتوكول مفصل لتتبع ديناميات النمو فيلوبوديال وتحليل تركيزات البروتين النسبية في هذه الهياكل الديناميكية عبر خوارزمية محدبة-بدن. باستخدام البرنامج، يمكن مقارنة ما يصل إلى 3 قنوات زوج الحكمة في تشغيل واحد، حيث يتم تحديد التركيزات النسبية لقناتين ( أي البروتينات) طوال دورة التمديد / التراجع وتخزينها كملفات الصور والبيانات في مجلدات منفصلة. بالإضافة إلى العمليات الروتينية، ويوفر البرنامج أيضا عددا من المعلمات التي يمكن تعديلها لتحسين التحليل لتجربة منها. ويمكن الاطل...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
شكر وتقدير
يقر المؤلفون بتمويل من دفغ (إكسك-1003 إلى مغ).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| DMEM | Life Technologies | 31966-021 | |
| 10٪ مصل الأبقار الجنيني | Biochrom AG | L11-044 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-027 | |
| 1٪ بنسلين / ستربتومايسين | Biochrom AG | 12212 | |
| تقنيات العمر المتوسط العصبي | 21103-049 | ||
| B27 | Life Technologies | 17504-044 | |
| HEPES (حل مخزون 1M) | Life Technologies | 15630 | |
| Citrine-N1 | Addgene | 54593 | |
| Labtech | Thermo | 155411 | |
| Glutamax-I | Thermo | 35050-061 | |
| معهد هيلا | لايبنيز DSMZ | ACC-57 | |
| COS 7 | لايبنيز معهد DSMZ | ACC-60 | |
| 3T3 خلايا | معهد لايبنيز DSMZ | ACC-59 | |
| مجهر | كاميرا نيكون كسوف | ||
| أندور | DU888 وحدة متحد البؤر الفائقة | ||
| يوكاغاوا | CSU-X1 | ||
| بيروفات | جيبكو | 31966-021 |
المراجع
- Dunaevsky, A., Tashiro, A., Majewska, A., Mason, C., Yuste, R. Developmental regulation of spine motility in the mammalian central nervous system. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (23), 13438-13443 (1999).
- Matus, A., Brinkhaus, H., Wagner, U. Actin dynamics in dendritic spines: a form of regulated plasticity at excitatory synapses. Hippocampus. 10 (5), 555-560 (2000).
- Galic, M., et al. Dynamic recruitment of the curvature-sensitive protein ArhGAP44 to nanoscale membrane deformations limits exploratory filopodia initiation in neurons. Elife. 3, e03116(2014).
- Hotulainen, P., et al. Defining mechanisms of actin polymerization and depolymerization during dendritic spine morphogenesis. J Cell Biol. 185 (2), 323-339 (2009).
- Leijnse, N., Oddershede, L. B., Bendix, P. M. Helical buckling of actin inside filopodia generates traction. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (1), 136-141 (2015).
- Tsygankov, D., et al. CellGeo: a computational platform for the analysis of shape changes in cells with complex geometries. J Cell Biol. 204 (3), 443-460 (2014).
- Xiong, Y., et al. Automated characterization of cell shape changes during amoeboid motility by skeletonization. BMC Syst Biol. 4, 33(2010).
- Styner, M., Gerig, G., Lieberman, J., Jones, D., Weinberger, D. Statistical shape analysis of neuroanatomical structures based on medial models. Med Image Anal. 7 (3), 207-220 (2003).
- Blum, H. A transformation for extracting new descriptors of shape. Models for the Perception of Speech and Visual Form: Proceedings of a Symposium. Wathen-Dunn, W. , MIT Press. Cambridge, MA. 362-380 (1967).
- Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities. J Cell Biol. 209 (1), 163-180 (2015).
- Machacek, M., et al. Coordination of Rho GTPase activities during cell protrusion. Nature. 461 (7260), 99-103 (2009).
- Saha, T., et al. Automated analysis of filopodial length and spatially resolved protein concentration via adaptive shape tracking. Mol Biol Cell. 27 (22), 3616-3626 (2016).
- Argiro, V., Bunge, M. B., Johnson, M. I. A quantitative study of growth cone filopodial extension. J Neurosci Res. 13 (1-2), 149-162 (1985).
- Mogilner, A., Rubinstein, B. The physics of filopodial protrusion. Biophys J. 89 (2), 782-795 (2005).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
- Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).
- Courtney, J., Woods, E., Scholz, D., Hall, W. W., Gautier, V. W. MATtrack: A MATLAB-Based Quantitative Image Analysis Platform for Investigating Real-Time Photo-Converted Fluorescent Signals in Live Cells. PLoS One. 10 (10), e0140209(2015).
- Schell, M. J., Erneux, C., Irvine, R. F. Inositol 1,4,5-trisphosphate 3-kinase A associates with F-actin and dendritic spines via its N terminus. J Biol Chem. 276 (40), 37537-37546 (2001).
- Korobova, F., Svitkina, T. Molecular architecture of synaptic actin cytoskeleton in hippocampal neurons reveals a mechanism of dendritic spine morphogenesis. Mol Biol Cell. 21 (1), 165-176 (2010).
- Cheadle, L., Biederer, T. The novel synaptogenic protein Farp1 links postsynaptic cytoskeletal dynamics and transsynaptic organization. J Cell Biol. 199 (6), 985-1001 (2012).
- Tarnok, K., et al. A new tool for the quantitative analysis of dendritic filopodial motility. Cytometry A. 87 (1), 89-96 (2015).
- Hendricusdottir, R., Bergmann, J. H. F-dynamics: automated quantification of dendrite filopodia dynamics in living neurons. J Neurosci Methods. 236, 148-156 (2014).
- Fanti, Z., Martinez-Perez, M. E., De-Miguel, F. F. NeuronGrowth, a software for automatic quantification of neurite and filopodial dynamics from time-lapse sequences of digital images. Dev Neurobiol. 71 (10), 870-881 (2011).
- Costantino, S., et al. Semi-automated quantification of filopodial dynamics. J Neurosci Methods. 171 (1), 165-173 (2008).
- Nilufar, S., Morrow, A. A., Lee, J. M., Perkins, T. J. FiloDetect: automatic detection of filopodia from fluorescence microscopy images. BMC Syst Biol. 7, 66(2013).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
