إعداد الأدوية العشبية: إير-زيان ديكوتيون و إير-زيان التي تحتوي على مصل ل في فيفو و في المختبر التجارب

الاهتمام في دراسة وتطبيق الأدوية العشبية التقليدية ينمو حاليا. على عكس الأدوية الحديثة، التي المكونات الكيميائية هي محددة، الصيغ العشبية لديها بعض المكونات غير معروفة وتتطلب عمليات استخراج لتمكين تسليم المركبات النشطة. على الرغم من أن العديد من الدراسات في محاولة لتحديد مجمع صغير واحد مع بنية معروفة كممثل من عشب كامل أو صيغة العشبية، لا يمكن اعتبار أي فعالية الدوائية أو آليات يعادل ^{1 ، 2} . في حين أن البصمات تمكن من تحليل مكونات الصيغ العشبية المعقدة، وبعض المكونات لا تزال غير تحليلها بشكل واضح، مما يؤدي إلى تحدي عند الجمع بين جميع مقتطفات للدراسة ³ . التفاعلات من العديد من المكونات / مقتطفات توسط الآثار العلاجية للأدوية العشبية. للحفاظ على هذه الميزة، استخراج التقليدية شكل ديكوكت أيون-لا يزال يستخدم على نطاق واسع في العيادة. منذ إجراء استخراج له تأثير كبير على فعالية العلاجية، وبروتوكول قياسي من مغلي المياه التقليدية ضروري، وخاصة بالنسبة للدراسات في الجسم الحي ^{4 ، 5} .

من ناحية أخرى، عند استكشاف الآليات الدوائية، وإدارة الاستغناء العشبية أثناء الدراسات في المختبر أو خارج الجسم الحي هو أيضا تحديا. وقد اقترح تاشينو في عام 1988 مفهوم المصل الذي يحتوي على المخدرات ⁶ . ومنذ ذلك الحين، طبقت أعداد متزايدة من الباحثين على الأدوية العشبية ^{7 و 8 و 9} . على الرغم من أن طريقة المصل يحتوي على المخدرات لديها بعض القيود، مثل تأثير بعض مكونات المصل، فإنه لا يزال يعتبر أن الطريقة التي تحاكي عن كثب الظروف الفسيولوجية.

"jove_content"> تم تطوير مغلي إير-زيان في أوائل 1950s لتخفيف أعراض انقطاع الطمث ^{10 ، 11 ، 12 ، 13} . كما تم تطبيقه على علاج فقر الدم اللاتنسجي ¹⁴ ، هشاشة العظام بعد انقطاع الطمث ^{15 ، 16 ، 17} ، سابق لأوانه فشل المبيض ¹⁸ ، سرطان الثدي ¹⁹ ، سرطان المبيض ²⁰ ، وتأخر سن البلوغ ²¹ . هنا، نقدم بروتوكولات مفصلة لإعداد كل من مغلي إشيان (إكسد) والمصل الذي يحتوي على المخدرات. بالإضافة إلى ذلك، نحن تصف تطبيق إكسد و إكسد التي تحتوي على المصل إلى نماذج هشاشة العظام الفئران الفئران.

ويتكون إكسد من 9 غرام كل من كوركوليغو أورشيوادس غايرتن ، هيربا إبيمديي الرقم الأساسي مورينداي المخزنية ، والجذر انجليكا سينينسيس و 6 غرام كل من اللحاء فيلودندري و ريزوما أنيمارهيني لكل مريض بالغ يوميا. الجرعة المكافئة للفأرة هي 0.1418 إكسد / كغ / يوم استنادا إلى المعادلة التالية ²² : دب = دا * رب / را * (وا / وب) ^1/3 . دا و دب يشير إلى الجرعة لكل وزن الجسم (ملغ / كلغ) من الإنسان والفأر، على التوالي. يتم استبدال الجرعة، في ملغ / كغ، بعدد إكسد / كغ. ويمثل را و رب عامل الجسم البشري وعامل جسم الفأر، على التوالي، والتي تتناسب مع (مساحة سطح الجسم (م ² ) / وزن الجسم (كغ)) ^2/3 (انظر الجدول 1 ). وا و وب تشير إلى وزن الجسم (كلغ) من الإنسان والفأر، على التوالي.

بروتوكول يتبع المبادئ التوجيهية رعاية الحيوان من جامعة شنغهاي للطب الصيني التقليدي، وهي معتمدة من قبل التجربة الحيوانية لجنة الأخلاقيات الحيوانية شنغهاي.

1 - البروتوكول الأول: إعداد إكسد

1. عملية حسابية
   1. إدارة إكسد لمجموعة العلاج من 10 الفئران إمبرينتينغ السيطرة المنطقة (إكر) الفئران (0.02 كجم / ماوس)، 5 أيام في الأسبوع لمدة 12 أسبوعا.
      ملاحظة: هناك حاجة إلى ما مجموعه 1.702 إكسد. لأن إكسدس تقاس بزيادات منفصلة، ​​في الممارسة الحقيقية، إدارة 2 إكسدس.
   2. حساب حجم إكسد تطبيقها في الماوس ( أي V = (0.1418 إكسد / كغ • يوم) * (0.02 كجم / الماوس) * 50 مل / إكسد = 0.14 مل / ماوس • اليوم).
2. تمرغ
   1. وضع جميع المواد الخام من اثنين إكسدز ( أي، كوركوليغو أورشيوادس غايرتن (18 غرام)، هيربا إبيمديي (18 غرام)، الرقم الأساسي موريندي أوفيسيناليس (18 غرام)، Rأديكس أنجليسا سينينسيس (18 غراما)، اللحاء فيلودندري (12 غراما)، و ريزوما أنيمارهيني (12 غراما)، 96 غرام في المجموع) في وعاء مع غطاء.
      ملاحظة: يوصى بحاوية خزفية.
   2. مكررات الأعشاب الخام مع 500 مل من الماء المقطر لمدة 1 ساعة. يجب أن تغطي المياه الأعشاب بنحو بوصة واحدة. السماح لجميع الأعشاب نقع جيدا.
3. أول مغلي الماء
   1. تسخين الأعشاب باستخدام طباخ الغاز أو طباخ التعريفي على الطاقة العالية حتى يغلي الماء (حوالي 5-10 دقيقة؛ الفترة الزمنية يعتمد على قوة التدفئة، والحاوية، وكمية من الأعشاب والمياه). رفض السلطة إلى انخفاض ينضج لمدة 2 ساعة.
4. الترشيح الأول
   1. غطاء كوب 500 مل مع ورقة الترشيح العادية أو مع الشاش والقطن. صب بعناية قبالة مغلي في الدورق من خلال مرشح. ترك الأعشاب في الحاوية.
   2. إعادة بقايا الأعشاب المتبقية سn ورق الترشيح إلى الحاوية.
5. مغلي الماء الثاني
   1. إضافة الماء المقطر إلى الحاوية مع الأعشاب. والسماح لها تغطية الأعشاب بنحو بوصة واحدة.
   2. كرر الخطوة 1.3.
6. الترشيح الثاني
   1. كرر الخطوات 1.4.1 و 1.4.2.
   2. صب قبالة مغلي الثاني في نفس الدورق. خلط ديكوكتيونس الأولى والثانية معا.
7. تركيز
   1. وضع الكأس على طباخ الغاز مع الاسبستوس خالية من الشاش الأسلاك بينهما، حرارة ديكوتيون باستخدام ينضج منخفضة، وببطء وبشكل مستمر اثارة مع قضيب من الزجاج.
   2. عندما يقلل ديكوتيون إلى 200 مل، نقله إلى كوب 500 مل.
   3. كرر الخطوة 1.7.1 حتى ديكوتيون يقلل إلى 100 مل.
8. التخزين والإدارة
   1. نقل ديكوتيون المركزة إلى زجاجة معقمة. السماح لها باردة إلى غرفة تمبراتوري (رت). تخزين في 4 درجات مئوية إذا كان استخدامه في غضون أسبوع واحد أو في -70 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.
   2. باستخدام إبرة التزقيم، وإدارة 0.14 مل / الماوس من ديكوتيون ل أوفاريكتوميزد (أوفكس) الفئران مرة واحدة يوميا، 5 أيام في الأسبوع لمدة 12 أسبوعا.

2. البروتوكول الثاني: إعداد المصل المحتوي على إكسد

1. عملية حسابية
   1. حساب الجرعة المكافئة للفئران (ريد) باستخدام 0.15 كغ وزن الجسم لكل فئران (1 شهر من العمر): ديسيبل = (1/60) * (90/100) * (60 / 0.15) ^1/3 = 0.111 إكسد / كغ / يوم.
      ملاحظة: هناك حاجة إلى ما مجموعه 10 مل من المصل المحتوي على إكسد لإعداد 100 مل من الوسط الثقافي (10٪ من المصل يحتوي على إكسد). ومن المتوقع أن توفر 2 مل من الفئران كل الفئران. وبالتالي، هناك حاجة إلى 6 الفئران (خسارة 20٪ في الاعتبار) لإدارة إكسد مرة واحدة يوميا لمدة 3 أيام. عدد إكسدس هو: (0.111 إكسد / كغ • يوم) * (0.15 كجم / الفئران) * (6 الفئران) * (3 أيام) = 0.300 إكسد. مرة أخرى، لأن إكسدس يتم قياسها في زيادات منفصلة،استخدام 1 إكسد.
   2. حساب حجم إكسد تطبيقها في الفئران ( أي، V = (0.111 إكسد / كجم في اليوم) * (0.15 كجم / الفئران) * (50 مل / إكسد) = 0.83 مل / الفئران • اليوم).
2. تمرغ
   1. وضع المواد الخام ل 1 إكسد في وعاء مع غطاء. مكررات الأعشاب الخام في الماء المقطر لمدة 1 ساعة؛ يجب أن تغطي المياه الأعشاب بنحو بوصة واحدة. السماح لجميع الأعشاب نقع جيدا.
3. أول مغلي الماء
   1. تسخين الأعشاب باستخدام طباخ التعريفي على الطاقة العالية حتى يغلي الماء (حوالي 5-10 دقيقة؛ الفترة الزمنية يعتمد على الطاقة الحرارية، والحاوية، وكمية من الأعشاب والمياه). تحويل الطاقة إلى انخفاض ينضج لمدة 2 ساعة.
4. الترشيح الأول
   1. غطاء كوب 500 مل مع ورقة الترشيح العادية أو مع الشاش والقطن. صب بعناية قبالة مغلي في الدورق من خلال مرشح. ترك الأعشاب في الحاوية.
5. مغلي الماء الثاني
   1. إضافة الماء المقطر إلى الحاوية مع الأعشاب. والسماح لها تغطية الأعشاب بنحو بوصة واحدة.
   2. كرر الخطوة 2.4.
6. الترشيح الثاني
   1. كرر الخطوات 2.5.1 و 2.5.2.
   2. صب قبالة مغلي الثاني في نفس الدورق كما في الخطوة 2.4.1 وتخلط ديكوكتيونس الأولى والثانية معا.
7. تركيز
   1. وضع الكأس على طباخ الغاز مع الشاش الأسلاك خالية من الاسبستوس بينهما، حرارة ديكوتيون باستخدام ينضج منخفضة، وإثارة ببطء وبشكل مستمر مع قضيب من الزجاج.
   2. عندما يقلل ديكوتيون إلى 100 مل، نقله إلى كوب 100 مل.
   3. كرر الخطوة 2.7.1 حتى يقلل ديكوتيون إلى 50 مل.
8. التخزين والإدارة
   1. نقل ديكوتيون المركزة إلى سترإيل، قنينة الزجاج. السماح لتبرد ل رت. تخزين في 4 درجات مئوية إذا كان استخدامه في غضون أسبوع واحد أو في -70 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.
   2. إدارة عن طريق الفم 0.83 مل / الفئران مرة واحدة يوميا لمدة 3 أيام.
9. إكسد التي تحتوي على إعداد المصل
   1. تخدير الفئران عن طريق الحقن داخل الصفاق من 300 مل / 100 غرام من 80 ملغ / كغ من الكيتامين و 10 ملغ / كغ زيلازين في 1 ساعة بعد آخر إدارة إكسد. تأكيد التخدير الصحيح عن طريق قرصة أخمص قدميه.
   2. شق الجلد والبريتوني من الفئران من البطن إلى الجزء السفلي من الصدر باستخدام مشرط (أو مقص التشغيل على التوالي). إنشاء شق طول وعمق حوالي 5 سم و 0.5 سم، على التوالي. نقل أحشاء البطن إلى اليسار باستخدام ورقة الأنسجة.
   3. باستخدام ورقة الأنسجة، وإزالة النسيج الضام من الشريان الأورطي البطني للكشف بوضوح السفينة.
   4. رسم الدم ببطء من الشريان الأورطي البطني باستخدام 10 مل، 22-حقنة قياس. نقله إلىأنبوب معقم 15 مل بعد إزالة الإبرة. فئران واحدة يمكن أن تنتج 8-10 مل من الدم.
      ملاحظة: يجب أن يكون الفئران على قيد الحياة ( أي، مع البطن الشريان الأورطي النابض) عند بدء رسم الدم والموتى بعد اكتمال الرسم.
   5. تخثر الدم في وضع مستقيم لمدة 30 - 60 دقيقة في الغرفة رت. أجهزة الطرد المركزي في 500-600 x ج لمدة 20 دقيقة. وضع بعناية كل طاف (المصل) في أنبوب 50 مل واحد معقمة وتخلط كل المصل (من الحيوانات المختلفة) معا.
   6. أداء تعطيل الحرارة عن طريق احتضان المصل في حمام مائي 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. تصفية المصل باستخدام مرشح حقنة مع 0.22 ميكرون حجم المسام غشاء بوليثرزولفون ماء. استخدام المصل جديدة أو تخزينه في -20 درجة مئوية.
10. السيطرة على المخدرات التي تحتوي على إعداد المصل (المستخدمة في مجموعة السيطرة)
    1. إدارة كل الفئران مع نفس الحجم من المياه المالحة (0.83 مل) مرة واحدة يوميا لمدة 3 أيام. الخطوات الأخرى هي نفسها كما في الخطوة 2.9.
11. الوضعية
    1. إضافة 10 مل من المصل تحتوي على إكسد المصل أو المخدرات التي تحتوي على كل 100 مل من المتوسطة، بالإضافة إلى 1٪ البنسلين الستربتومايسين (بس) ²³ .

تأثير إكسد على كثافة العظام من الفئران أوفكس

يظهر هيماتوكسيلين ويوزين (H & E) تلطيخ القسم الفقرات القطنية زيادة ترابيك العظام بعد العلاج إكسد في الجسم الحي ( الشكل 1A ، اللوحة اليمنى) مقارنة مع تلك الموجودة في مجموعة أوفكس ( الشكل 1A ، اللوحة اليسرى). ويبين الشكل 1B الصور μCT ممثل القطني 4TH في الفئران أوفكس ( الشكل 1B ، اللوحة اليسرى) والفئران أوفس مع العلاج إكسد لمدة 12 أسبوعا ( الشكل 1B ، اللوحة اليمنى). وينظر أكثر العظام التربيقية داخل فقرة قطنية من الفئران المعالجة إكسد من تلك التي تسيطر عليها الفئران أوفكس. وتشير البيانات من التصوير μCT إلى زيادة حجم العظام / الأنسجة حجم (بف / تف)، عدد ترابيقي (تب N)، وسمك التربيقية (تب. ث) وانخفاض تباعد التربيقية (تب. سب) من القطني الرابع في الفئران إكسد ( الشكل 1C ).

تأثير إكسد على تكوين العظم من الخلايا الجذعية الوسيطة العظم (بمسك) من الفئران أوفكس

الشكل 2 يمثل إمكانات عظمية من بمسك. يتم تشكيل قطرات الدهون (النجمة، شكل غير منتظم من قطرة الدهون) تلقائيا عندما مثقبة بمسك من الفئران أوفس مثقف لمدة 7 أيام ( الشكل 2A ، اللوحة اليسرى). في الفئران المعالجة إكسد، تتشكل العقيدات العظام (السهم) بدلا من قطرة الدهون ( الشكل 2B ، اللوحة اليمنى). فحص الفوسفاتيز القلوية (ألب) يدل على أن المزيد من الخلايا إيجابية إيجابية (الأرجواني) يمكن الكشف عنها في بمسكس المعالجة إكسد ( الشكل 2B ، اللوحة اليمنى) مقارنة مع تلك في بمسك من الفئران أوفكس السيطرة ( الشكل 2B ، اللوحة اليسرى).

التغييرات في التعبير الجيني بين الفئران أوفكس و إكسدالصورة = "XREF"> 24

وتظهر التكتلات الهرمية أن التعبير عن 389 جينة كشفت عن طريق ميكروأري في بمسك تم تغيير أضعاف (> 1.5، تطبيع من قبل الفئران غير أوفكس) بين أوفكس و إكسد المعالجة الفئران في الجسم الحي (المجموع: 26،991 الجينات) ( الشكل 3 ). يشير اللون الأخضر إلى أن التعبير قد تم تنظيمه، في حين يشير اللون الأحمر إلى أن التعبير كان دونريغولاتد. يتم تجميع ثلاث عينات في نفس المجموعة معا أولا، مما يدل على صفات موثوقة من التشكيل الجانبي. ويبين الشكل 4 مسار الإشارات المتداخلة المستهدفة من قبل إكسد، سواء في الجسم الحي وفي المختبر .

الشكل 1: تأثير إكسد على مورفولوجيا العظام.
( A ) H & E تلطيخ الجزء القطني 4 ث من أوفكس و إكسد المعالجة الفئران. ( C ) الكمي ل μCT. بف: حجم العظام، التلفزيون: حجم الأنسجة، Tb.N: عدد ترابيقي، تب. ث: سمك التربيقي، و Tb.Sp: تباعد تربيقي. تمثل الأعمدة الوسائل ± سي. ن = 6 لكل مجموعة. * p <0.05، ** p <0.01 إكسد مقابل أوفكس (t تيست). ( أس ) تم تعديلها من شوفن ليو وآخرون. 24. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: تأثير إكسد على بمسك التمايز.
( A ) صور من بمسك مثقف لمدة 7 أيام بعد بينغ، عزل عزل، من، ال التعريف، عظم الفخذ، بسبب، أوفس، أو، إكسد-فوسد، مايس. * يشير إلى قطرة الدهون. يشير السهم إلى عقيدة عظم. ( B ) تلطيخ ألب أوفكس و بمسكس المعالجة إكسد مثقف لمدة 7 أيام (الأرجواني يمثل ألب إيجابية). ( C ) الكمي من ( B ). الأعمدة تمثل وسائل ± سي من ثلاثة أطباق (ستة الفئران) لكل مجموعة. ** p <0.01 إكسد مقابل أوفكس (t تيست للطالب). ( أس ) تم تعديلها من شوفن ليو وآخرون. 24. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: تأثير إكسد على ملف تعريف التعبير الجيني.
خريطة حرارية للتجمعات الهرمية للتعبير عن 389 الجينات في أوفس و بمسكس إكسد حصادها في اليوم السابع بعد التفكك. المقياس (صورة صغيرة) يشير إلى تغييرات أضعاف تطبيعها بمسكس غير أوفكس. وترد قائمة الجينات في الملف التكميلي 1 . تم تعديل هذا الرقم من شوفين ليو وآخرون. 24. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: تأثير إكسد على مسار الإشارات المتراكبة في كل من فيفو وفي المختبر التجارب.
أول 10 متداخلة مسارات الإشارات التي يتم عكسها من قبل إكسد في الجسم الحي والمصل التي تحتوي على إكسد في المختبر على أساس مسار كيغ. وتظهر الجينات المتعلقة بالمسارات في الملف التكميلي 2 ./files/ftp_upload/55654/55654fig4large.jpg "تارجيت =" _ بلانك "> الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: عامل R في أنواع مختلفة.
عامل R في 8 الأنواع التي تستخدم عادة في البحوث الدوائية. عامل R يتناسب مع: (مساحة سطح الجسم (م 2 ) / بأودي الوزن (كغالعلامة)) 2/3 .

الملف التكميلي 1.
معلومات عن 389 الجينات التي يتم تنظيمها أو دونريغولاتد ≥ 1.5 أضعاف ولكن يتم إنقاذها من قبل إكسد في الجسم الحي . الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.

ملف تكميلي 2.
معلومات عن مسار الإشارات (على أساس مسار كيغ) والجينات ذات الصلة في كل من فيفو والتجارب في المختبر . الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.

ويعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.