Method Article

تصميم عالية تقارب الأجسام المضادة مستضد حركية ملزم باستخدام أربعة منصات جهاز الاستشعار البيولوجي

DOI:

10.3791/55659

⸱

April 17th, 2017

 ,  ,  , 
1Department of Biotherapeutics Discovery, Immune Modulation and Biotherapeutics Discovery, Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Inc., 2The Fu Foundation School of Engineering and Applied Science, Columbia University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن هنا وصف البروتوكولات لقياس الأجسام المضادة مستضد تقارب وحركية باستخدام أربع منصات جهاز الاستشعار البيولوجي تستخدم عادة ملزمة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أجهزة الاستشعار البصرية خالية من التسمية هي أدوات قوية في اكتشاف الأدوية لتوصيف التفاعلات الجزيئية البيولوجية. في هذه الدراسة، وصفنا استخدام أربع منصات جهاز الاستشعار البيولوجي تستخدم بشكل روتيني في مختبرنا لتقييم تقارب وحركية عشرة الأجسام المضادة وحيدة النسيلة عالية تقارب (MABS) ضد طليعة البروتين الإنسان كونفيرتاز سبتيليزين نوع كيكسن 9 (PCSK9) ملزمة. بينما تستمد كلا Biacore T100 وProteOn XPR36 من الرنين راسخة بلازمون السطحية (SPR) والتكنولوجيا، الرئيس السابق لديه أربعة تدفق الخلايا متصلة بواسطة التكوين تدفق المسلسل، في حين أن يعرض الأخيرة 36 ​​نقاط رد الفعل في موازاة ذلك من خلال مرتجلة 6 × 6 تتقاطع التكوين قناة ميكروفلويديك. وIBIS MX96 أيضا تعمل على أساس تكنولوجيا الاستشعار SPR، مع ميزة التصوير الإضافية التي تقدم كشف في التوجه المكاني. هذه التقنية الكشف عن جانب التدفق المستمر Microspotter (CFM) توسع الإنتاجية بشكل كبير عن طريق البريدnabling متعددة طباعة مجموعة والكشف عن 96 رياضية رد فعل في وقت واحد. في المقابل، يستند محاذية RED384 على BioLayer التداخل (BLI) مبدأ البصرية، مع تحقيقات الألياف البصرية بوصفها جهاز الاستشعار البيولوجي للكشف عن نمط التداخل التغييرات على التفاعلات ملزم على سطح الحافة. على عكس المنصات المرتكزة SPR، لا تعتمد على نظام BLI على FLUIDICS تدفق مستمر. بدلا من ذلك، نصائح استشعار جمع القراءات بينما هم منغمسين في حلول تحليلها من صفيحة 384 بئر خلال التحريض المداري.

كل من هذه المنصات جهاز الاستشعار البيولوجي مزاياه وعيوبه. لتوفير المقارنة المباشرة من قدرة هذه الصكوك على توفير البيانات الحركية الجودة، والبروتوكولات المذكورة توضح التجارب التي تستخدم نفس الشكل فحص ونفس الكواشف ذات جودة عالية للتميز حركية الضد مستضد التي تناسب بسيط 1: 1 نموذج التفاعل الجزيئي .

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد اكتساب معلمات حركية موثوقة لتوصيف تفاعلات الأجسام المضادة والمستضد مكونا أساسيا لعملية اكتشاف الدواء وتطويره < فئة sup = 'xref'>1. تم استخدام المستشعرات الحيوية لرنين البلازمون السطحي البصري (SPR) ، "المعيار الذهبي" للكشف في الوقت الفعلي عن هذه التفاعلات ، منذ ما يقرب من عقدين من الزمن لتمكين الاختيار المبكر للأجسام المضادة العلاجية المرشحة التي تلبي المعايير< فئة الدعم = 'xref'>2,3. بالإضافة إلى توفير تصنيف تقارب لمرشحي الأجسام المضادة عن طريق فحص الارتباط السريع للطافية الخام < فئة sup = 'xref'>4 ، والتحديدات الحركية الثابتة الصارمة للمستحضرات المنقاة < فئة الدعم = 'xref'>5 ، يمكن للأجهزة الاستشعار الحيوية التمييز بشكل أكبر بين النشاط الوظيفي للمرشحين الرئيسيين من خلال دراسات تجميع الحلقات < فئة الدعم = 'xref'>6,< sup class = 'xref'>7.

لتلبية الطلب المتزايد على المنتجات القائمة على الأجسام المضادة لمختلف المؤشرات العلاجية < sup class = 'xref'>8 ، تم تطوير مجموعة متنوعة من أدوات الاستشعار الحيوي المبتكرة في السنوات الأخيرة التي تزيد من كفاءة تحديد المرشح وتوصيفه< فئة سوب = 'xref'>9,< sup class = 'xref'>10. تختلف هذه الأدوات في تصميم تكوين قناة الموائع الدقيقة و / أو في المبادئ البصرية التي ينطوي عليها الكشف عن التفاعلات الجزيئية الحيوية. على وجه التحديد ، قامت Octet RED38411 و ProteOn XPR3612 و IBIS MX967 بتوسيع عدد التفاعلات المقاسة في دورة ربط واحدة إلى 16 و 36 و 96 على التوالي ، مما يمثل تحسينات كبيرة في الإنتاجية على منصة Biacore التقليدية. على الرغم من أن منصات الاستشعار الحيوي المختلفة هذه توفر جميعها بيانات حركية أساسية لتوصيف تفاعلات الأجسام المضادة والمستضد ، إلا أنها تختلف في الإعداد التجريبي والإجراءات التشغيلية بسبب الاختلافات في التكوينات الآلية. على سبيل المثال ، في منصة مصفوفة التصوير SPR الخاصة ب IBIS MX96 ، يتم تنفيذ خطوة تثبيت الترابط المتعدد في وضع غير متصل بالإنترنت في جهاز طباعة خارجي منفصل عن الكاشف < فئة sup = 'xref'>7,< sup class = 'xref'>13; في المقابل ، تستخدم منصات الاستشعار الحيوي الثلاثة الأخرى إعداد "الكل في واحد" ، حيث يتم تسجيل إضافة المكون على سطح المستشعر ، سواء كان كاشف التنشيط أو الترابط أو التحليل ، في الوقت الفعلي ومن خلال أوامر مبرمجة مسبقا بترتيب تسلسلي. في Octet RED384 ، تتمثل الميزة الفريدة لهذه المنصة القائمة على قياس تداخل الطبقة الحيوية (BLI) في توافر أجهزة استشعار حيوية للألياف الضوئية المطلية مسبقا للاستخدام الفوري "بالغمس والقراءة" < فئة sup = 'xref'>14 ، مما يلغي الحاجة إلى خطوات إعداد سطح الترابط والبدء / التكييف ، والتي غالبا ما تكون مطلوبة لرقائق المستشعر في الأنظمة الأساسية القائمة على SPR. كما يعمل التصميم الخالي من السوائل لهذه الأداة على تبسيط الميكانيكا وتجنب مخاوف الانسداد والتلوث عند التعامل مع العينات الخام. مع التصميم السائل المتقاطع الجديد مقاس 6 × 6 في ProteOn XPR36 ، يمكن تنفيذ نهج حركية "طلقة واحدة" عن طريق تبديل قنوات التدفق بين الاتجاهين الأفقي والرأسي لإنشاء 36 نقطة تفاعل < فئة sup = 'xref'>15. بدلا من تقييم حركية الربط تركيز رابط واحد أو تحليل واحد في كل مرة ، كما هو الحال في منصة التدفق التسلسلي التقليدية Biacore T100 ، يوفر هذا النهج القدرة على مراقبة ما يصل إلى 36 تفاعلا مختلفا في وقت واحد في دورة ربط واحدة.

على الرغم من اختلافاتها ، إلا أن منصات الاستشعار الحيوي الأربعة هذه تستخدم على نطاق واسع من قبل العديد من المختبرات في جميع أنحاء العالم. بالنسبة للمستخدمين الجدد الذين لديهم خبرة قليلة في الاستشعار الحيوي ، يمكن أن يكون تحديد الأداة التي يجب استخدامها مهمة صعبة نظرا للاختلافات في تصميم الأدوات. لتحديد الأداة الأنسب لأغراض البحث الخاصة بهم ، يجب النظر بشكل جماعي في عوامل مثل جودة البيانات واتساق الأداء والإنتاجية وسهولة التشغيل واستهلاك المواد. في حين أن العديد من الدراسات المعيارية قد استكشفت تباين ثوابت المعدل الحركي التي تم الحصول عليها من العديد من المختبرات وأجهزة الاستشعار الحيوية< sup class = 'xref'>5,16 ، فإن دراسة المقارنة المباشرة المنشورة مؤخرا تتناول العوامل المنهجية التي تؤثر على موثوقية البيانات من وجهة نظر الأداء الآلي< sup class = 'xref'>17,18. تركز البروتوكولات المتوفرة في هذا الفيديو على الإعداد والإجراءات التجريبية بالتفصيل ، وهي مصحوبة بمقال بحثي بعنوان "مقارنة منصات الاستشعار الحيوي في تقييم حركية ربط الأجسام المضادة والمستضد عالية التقارب" < فئة الدعم = 'xref'>17. لا تهدف هذه البروتوكولات إلى مساعدة مستخدمي أجهزة الاستشعار الحيوي الجدد على تنفيذ هذه الأدوات لأغراض بحثهم فحسب ، بل تهدف أيضا إلى توفير رؤى إضافية لمستخدمي أجهزة الاستشعار الحيوية الحاليين فيما يتعلق بالتحديات والاعتبارات التقنية في التصميمات التجريبية لتقييم تفاعلات الأجسام المضادة والمستضد عالية التقارب.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. البروتينات والأجسام المضادة

  1. إنتاج وتنقية سبتيليزين طليعة البروتين كونفيرتاز البشري كيكسن نوع 9 (PCSK9) وعشرة MABS مكافحة PCSK9 المستمدة الماوس كما هو موضح سابقا (17).
  2. تقييم نقاء منتجات النقاء عن طريق حقن بالتتابع 10 ميكروغرام من كل عينة إلى عمود التحليلية استبعاد حجم (SEC) باستخدام نظام UPLC 19.

2. القياسات الحركية في T100 Biacore

  1. الصك وإعداد الكاشف
    1. تتوازن رقاقة الاستشعار CM5 في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
    2. ذوبان الجليد اثنين 200 مكل من 200 ملي 1-إيثيل-3- (3-dimethylaminopropyl) هيدروكلوريد carbodiimide (EDC) واثنين من 200 مكل من 50 ملي N-hydroxysuccinimide (NHS) في درجة حرارة الغرفة.
    3. تحضير زجاجة 1-L من 1X HBS-EP (10 ملي HEPES [7.4 درجة الحموضة]، 150 مم كلوريد الصوديوم، 3 ملي EDTA، و 0.005٪ ت / ت بوليسوربات P20) تعمل العازلة ديالتطيين حل 10X الأسهم HBS-EP + في الماء.
    4. إعداد 1 مل من بروتين A / G في 30 ميكروغرام / مل في 10 ملي خلات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 4.5) و 500 ميكرولتر من كل عينة ماب في 0.063 ميكروغرام / مل في المنطقة العازلة HBS-EP الترشح. ذوبان الجليد قارورة المجمدة من PCSK9 البشري على الجليد.
    5. في برنامج التحكم، انقر فوق "أدوات | إخراج رقاقة"، وضع رقاقة الاستشعار في غمد وإغلاق. انقر على "أدوات | تعيين درجة الحرارة"، أدخل "25" درجة مئوية كما أن درجة حرارة تحليل و "10" درجة مئوية كما أن درجة حرارة المقصورة.
  2. الشلل السطح
    1. في برنامج التحكم، انقر فوق "ملف | فتح / نيو قالب معالج" وحدد "الشلل" من القائمة في اللوحة اليمنى.
    2. انقر على "الجديد" للدخول في إطار الإعداد الشلل. اختيار "CM5" كنوع الشريحة وحدد "1" خلية تدفق في كل دورة.
    3. ضع علامة في المربع بجانب بعضها "خلية تدفق شل 1/2/3/4" لACTIVAالشركة المصرية للاتصالات الخيارات. حدد "تهدف لمستوى يجمد" و "أمين" كأسلوب لجميع تدفق الخلايا.
    4. أدخل "30 ميكروغرام / مل بروا / G" كما يجند، تأكد من أن يتم تعيين مستوى الهدف إلى "10000" وحدات الاستجابة (RU) لجميع من تدفق الخلايا.
    5. تحقق "رئيس قبل تشغيل"، وانقر على "التالي". حدد "الكاشف الرف 2"، وتحديد الموقع لالكواشف وماصة في قوارير عينة الفردية وفقا لذلك. إدراج الرف مرة أخرى في الصك، ثم انقر فوق "ابدأ" وإدخال اسم التجربة ليتم حفظها لبدء التشغيل.
  3. الحليلة التجليد ودورات التجديد
    1. انقر فوق "ملف | فتح / طريقة جديدة"، حدد "20140812 هو جين تاو المضادة للPCSK9 الجماعات الحكومية الدولية ملزمة لهو جين تاو PCSK9" وفتح الأسلوب. مراجعة المعلمات في الأسلوب.
    2. في "خطوات الفحص"، تأكد من وجود 10 دورات التي "هو جين تاو PCSK9" هو الاسم مع "نموذج" المحدد في "Purpبيئة نظام التشغيل ". يتم تعيين عدد تكرار إلى" 1 ".
    3. في "أنواع دورة"، تعيين وقت الاتصال ب "220" ليالي لالتقاط 1 على مسار تدفق "2"، "110" ليالي لالتقاط 2 عبر مسار تدفق "3"، و "55" ليالي لالتقاط أكثر من 3 مسار تدفق "4". معدل التدفق هو "10" ميكرولتر / دقيقة لجميع دورات القبض عليه.
    4. حدد "عينة 1"، تحقق "حل نموذج" كما متغير. تعيين وقت الاتصال ب "600" ليالي والوقت التفكك إلى "2700" ليالي على مسار تدفق "1، 2، 3، 4". تم تعيين معدل التدفق إلى "30" ميكرولتر / دقيقة.
    5. حدد "تجديد 1"، أدخل "جليكاين، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 1.5" في مجال حل وتعيين وقت الاتصال إلى "20" ليالي على مسار تدفق "1، 2، 3، 4".
    6. في "إعدادات متغير"، أدخل 2 أضعاف المعايرة تركيزات من "100 نانومتر - 6.25 نانومتر" لدورة 1-3، "50 نانومتر - 3.12 نانومتر" لدورة 4-8، و "5 نانومتر - 0.323 نانومتر" وأو دورة 9-10.
    7. في "قم بتشغيل برنامج الإعداد"، واختيار مسار تدفق كشف "1/2، 1/3، 1/4"، انقر فوق "التالي"، تحقق "رئيس قبل تشغيل"، وانقر على "التالي".
    8. حدد "عينة والكاشف الرف 1"، وتحديد الموقع لالكواشف وماصة في قوارير عينة الفردية وفقا لذلك. إدراج رف في الصك، ثم انقر فوق "ابدأ" وإدخال اسم التجربة ليتم حفظها لبدء التشغيل.
  4. تحليل البيانات باستخدام BiaEvaluation
    1. انقر على "حركية / الانجذاب | ملزمة السطحية"، واختيار التيسير "2-1"، "3-1"، أو "01/04" على حدة وتحقق من كل من منحنيات المعروضة من تركيزات مختلفة تحليلها وكذلك "الصفر" تركيز فارغة.
    2. انقر على زر "التالي" للحصول الفراغ عازلة منحنيات تطرح. ثم انقر فوق "حركية" اختيار: نموذج "1 1 ملزم"، وانقر على "صالح" للحصول على parame الحركية المجهزةالنسب.
    3. لتركيب العالمي السطوح MAB متعددة، انقر فوق "R ماكس متعددة" في الجزء السفلي وإضافة منحنيات ملزمة من السفح أخرى لنفس ماب إلى القائمة.
    4. انقر فوق "التالي" للحصول على كافة المخزن المؤقت فارغا منحنيات ملزمة تطرح. ثم انقر فوق "حركية" اختيار "1: 1 التجليد" نموذج، واختيار "تناسب المحلية" لكل ماكس R في المعلمات للحصول على المعلمات الحركية تركيبها على الصعيد العالمي.

3. القياسات الحركية في XPR36 ProteOn

  1. الصك وإعداد الكاشف
    1. تتوازن رقاقة الاستشعار GLM وزجاجة 2-L من PBS-T-EDTA (PBS [7.4 درجة الحموضة]، 0.005٪ توين-20، و 3 ملي EDTA) العازلة على التوالي في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
    2. في برنامج التحكم، انقر فوق "إخراج" ثم تضاف شرائح GLM. ضبط درجة الحرارة رقاقة إلى "25" درجة مئوية ودرجة الحرارة الاوتوماتيكى إلى "10" درجة مئوية.انقر على "الجلسرين تهيئة" واتبع التعليمات مطالبتك تهيئة رقاقة.
    3. انقر فوق "ملف | فتح" بروتوكول شروط مسبقة من القائمة، وإعداد الحلول في لوحة 96-جيدا. ثم انقر فوق "تشغيل"، حدد البروتوكول وانقر على زر "ابدأ".
    4. ذوبان الجليد واحد 1 قسامة مل من 400 ملي EDC واحدة 1 قسامة مل من 100 ملي N-hydroxysulfosuccinimide (سلفو NHS) في درجة حرارة الغرفة.
    5. إعداد 2 مل من بروتين A / G في 60 ميكروغرام / مل في 10 ملي خلات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 4.5) و 500 ميكرولتر من كل عينة ماب عند 0.25 ميكروغرام / مل، 0.125 ميكروغرام / مل، و0.063 ميكروغرام / مل في PBS-T -EDTA العازلة على التوالي. ذوبان الجليد قارورة المجمدة من PCSK9 البشري على الجليد.
  2. الشلل، تحليلها وتجليد والتجديد
    1. انقر فوق "ملف جديد | بروتوكول جديد". في "تكوين"، أدخل اسم هذه التجربة، حدد "GLM" رقاقة، حدد "Microplates"، وأدخل "2.2" حجم مل.
    2. تحديد"بروتوكولات | عينات"، وتحديد "EDC / سلفو NHS" ك "المنشط" في الآبار H1-H6 "بروتين A / G" بأنه "يجند" في G1-G6 "الإيتانول" ك "Deactivator" في F1-F6 "جليكاين" ب "إعادة مولد" في E1-E6، PBS-T-EDTA "بأنها" فارغة "في D1-D6،" X عينة ماب "بأنه" يجند "في C1-C6، و" PCSK9 البشري "ك" الحليلة في الآبار H1-H6 في الثانية 96 لوحة جيدا.
    3. حدد "خطوات"، انقر نقرا مزدوجا فوق "الشلل" في "محرر البروتوكول"، تتضمن ثلاث خطوات الحقن اللاحقة الأفقية EDC / سلفو NHS، بروتين A / G، و 1 M إيثانولامين كل بمعدل تدفق "30" ميكرولتر / دقيقة ووقت الاتصال من "300" ق.
    4. انقر على "مجدد"، وضخ ثلاثة "18" -s نبضات من الجلايسين (درجة الحموضة 1.5) في "100" ميكرولتر / دقيقة في كل الاتجاهات الأفقية والرأسية، تليها اثنين من "60" -s نبضات PBS-T-EDTA في "25" ميكرولتر / دقيقةأيضا في كلا الاتجاهين.
    5. انقر على "يجند"، وضخ ماب 1 ماب 2 في الاتجاه الرأسي باستخدام معدل تدفق "25" ميكرولتر / دقيقة ووقت الاتصال من "160" ليالي.
    6. انقر على "الحليلة"، وضخ خمسة تجمعات PCSK9 البشرية (100 نانومتر إلى 6.25 نانومتر في 2 أضعاف التخفيفات المسلسل) ومنطقة عازلة فارغة أكثر من 6 قنوات أفقية في وقت واحد، في "40" ميكرولتر / دقيقة ل "600" ليالي من الزمن جمعية يتبع ب "2700" ليالي من الوقت التفكك.
    7. انقر على "مجدد"، وضخ اثنين من "18" -s نبضات من الجلايسين (درجة الحموضة 1.5) في "100" ميكرولتر / دقيقة في كل الاتجاهات الأفقية والعمودية.
    8. كرر الخطوات المذكورة أعلاه بعد كل دورة ملزمة لMABS المتبقية.
      ملاحظة: بالإضافة إلى نانومتر 100-6،25 نانومتر سلسلة تركيز PCSK9 البشري، 25 نانومتر - 1.56 نانومتر و 5 نانومتر - وتستخدم 0.313 سلسلة تركيز نانومتر.
    9. إعداد العينات والكواشف في اثنين من لوحات 96-جيدا وفقا لمواقف كاشفالمعرفة في الخطوة 3.2.2، ثم انقر فوق "تشغيل" علامة التبويب، حدد البروتوكول / التجربة وانقر على زر "ابدأ".
  3. تحليل البيانات باستخدام إدارة ProteOn
    1. انقر على "نوع لوحة" وحدد "تحليلها". ثم انقر فوق "الخطوة البروتوكول" وحدد كل منحنيات ملزمة في القائمة.
    2. انقر على "عملية تلقائي"، وانقر على "عملية | قناة المرجعي | Interspot". ثم انقر فوق "عملية | المرجعي مضاعفة | الصف | A6".
    3. انقر فوق "إنشاء مجموعة بيانات" لحفظ قواعد البيانات الفردية لكل ماب في جميع الأسطح الثلاثة للتحليل الحركي.
    4. انقر على "تحليل مجموعة بيانات"، تسليط الضوء على كل مجموعة بيانات ماب وانقر على "تحليل | الحركية". اختيار "انجمير" نموذج و "في وقت واحد كا / دينار" ثم انقر على "التالي".
    5. تسليط الضوء على كل من الجمعيات والتفكك مناسبا مجموعة، اختر "المحلي" R كحد أقصى، وانقر على "التالي" لتنفيذ مناسبا للحصول علىالمعلمات الحركية المجهزة.
    6. كرر الخطوة أعلاه ولكن اختيار "المجمعة" R ماكس لتركيب الحصول على التجريبية قيم R ماكس لحساب النشاط سطح يجند.

4. القياسات الحركية في محاذية RED384

  1. كاشف والتحضير لوحة نموذج
    1. تجهيز 50 مل من 1X KB (الحركية العازلة التي تحتوي على PBS الرقم الهيدروجيني [7،4]، 0.02٪ توين 20، 0.1٪ الزلال، و 0.05٪ أزيد الصوديوم) عن طريق تمييع الحل 10X الأسهم في برنامج تلفزيوني.
    2. الاستغناء عن 1X KB في لوحة 96-جيدا في 200 ميكرولتر لكل بئر. الهيدرات 48 المضادة للالبشري القبض على (AHC) نصائح جهاز الاستشعار البيولوجي في هذه الآبار الفردية لمدة 10 دقيقة على الأقل.
    3. إعداد كل عينة ماب في 20 ميكروغرام / مل و 10 ميكروغرام / مل، و 5 ميكروغرام / مل في 1X KB، وكذلك PCSK9 البشري في 7 تركيزات معاير من 100 نانومتر إلى 1.56 نانومتر في 2 أضعاف التخفيفات المسلسل.
    4. تحميل عينات ماب في صفيحة مائلة أسفل 384 بئر (referred على أنها لوحة الكاشف) والحلول PCSK9 الإنسان في صفيحة 384 بئر أخرى (ويشار إلى أن لوحة عينة) في 90 ميكرولتر لكل بئر.
    5. سلسلة حمولة من 1X KB والجلايسين (درجة الحموضة 1.5) الحلول في الآبار داخل لوحة عينة.
      ملاحظة: وتستخدم هذه الآبار KB 1X لشروط مسبقة رقاقة، وتثبيت خط الأساس، والتفكك تحليلها. ويستخدم الحل الجلايسين للتجديد.
  2. إعداد المنهج التجريبي
    1. في البرنامج الحصول على البيانات، انقر فوق "تجربة | معالج تجربة جديدة | جديد حركية تجربة | حركية الأساسية".
    2. في "لوحة تعريف"، اتبع الخطوات التالية لتحديد أنواع العينات والمواقف.
      1. تحديد قنوات "16" وشكل "384 بشكل جيد".
      2. تحديد العينة وكاشف مواقع في عرض لوحة عن طريق الضغط على مفتاح Shift أثناء النقر اليسار في البئر لتسليط الضوء على 16 بئرا في وقت واحد.
      3. انقر بزر الماوس الأيمن علىالآبار التي تحتوي على عينات ماب واختر "تحميل" للدلالة على الخطوة التي يتم تحميل MABS (أو أسر) على أجهزة استشعار AHC. أدخل أسماء ماب وتركيزات في الجدول على الجانب الأيمن.
      4. انقر بزر الماوس الأيمن على الآبار التي تحتوي على PCSK9 البشري وحدد "عينة" للإشارة إلى الخطوة التي يتم انخفض أجهزة الاستشعار القبض على ماب ويتم قياس التفاعلات ملزمة. أدخل تركيزات المولي المقابلة في الجدول على الجانب الأيمن.
      5. تحديد الآبار التي تحتوي 1X KB بأنه "مؤقت" أو "تحييد"، والآبار التي تحتوي على الجلايسين باسم "التجديد".
    3. في "تعريف الفحص"، اتبع الخطوات التالية لتحديد الإعداد التجريبية:
      1. انقر على "أضف" وحدد "الأساس"، "التجديد"، "موازنة"، "تحميل"، "جمعية"، والخطوات "التفكك" إلى قائمة مع أوقات "30" ليالي "30 "ليالي" 18 "ليالي" 200 "ليالي" 500 "ليالي، و" 1800 "ليالي على التوالي، وسرعة هزة هي" 1000 "دورة في الدقيقة.
      2. لإضافة خطوات ل"قائمة الفحص خطوات"، الأول انقر على هذه الخطوة، ثم انقر على الآبار تقع في أي عينة أو لوحة كاشف. والخطوات هي كما يلي:
        1. موازنة-التجديد: مسبق أجهزة الاستشعار AHC من ثلاث دورات من الانخفاضات "15" -s في الجلايسين (الرقم الهيدروجيني 1.5)، بالتناوب مع "15" -s الانخفاضات في 1X KB.
        2. التحميل: التقاط عينات ماب على أجهزة استشعار AHC ل "200" ق.
        3. خط الأساس: إنشاء إشارة BLI ل "60" ليالي قبل الخطوة تكوين الجمعيات.
        4. جمعية: DIP أجهزة الاستشعار في الآبار التي تحتوي على تركيزات مختلفة من PCSK9 البشري ل "500" فترة جمعية -s.
        5. التفكك: تراجع أجهزة استشعار محددة PCSK9 في آبار جديدة من 1X KB ل"1800" فترة التفكك -s.
        6. تجديد: تراجع ماب-PCSK9 بوالثانية أجهزة الاستشعار في آبار من الجلايسين (درجة الحموضة 1.5) مع اثنين من "18" -s نبضات بين كل دورة ملزمة.
    4. في "التجارب مراجعة"، مرر من خلال الخطوات وإجراء تغييرات عند الضرورة من خلال العودة إلى علامات التبويب السابقة.
    5. في "تجارب تشغيل" وتعبئة وقت "60" ليالي تأخير ويهز لوحة عينة بينما كان ينتظر. ضبط درجة الحرارة لوحة إلى "25" درجة مئوية ثم اضغط على "GO".
  3. تحليل البيانات باستخدام برامج تحليل البيانات ForteBio ل
    1. انقر على "اختيار البيانات | البيانات المحملة | حركية | الأجسام المضادة PCSK9 ملزمة لPCSK9 7.23.14"
    2. في "معالجة"، عملية البيانات على النحو التالي:
      1. في الخطوة 1: انقر على "الاستشعار اختيار" لتسليط الضوء على أجهزة استشعار في H1-H6، انقر بزر الماوس الأيمن عليها ثم انقر على "تغيير استشعار نوع | المرجعي الاستشعار."
      2. في الخطوة 2، تحقق "الطرح" وحدد "متوسط ​​مجسات المرجع". لطرح كل أجهزة الاستشعار عينة نشط من متوسط ​​6 أجهزة استشعار عازلة فارغة.
      3. في الخطوة 3، انقر فوق "محاذاة Y المحور" وحدد "الأساس" للتنسيق بين جميع منحنيات ملزمة للخطوة أساسية قبل الجمعية.
      4. في الخطوة 5، تحقق "سفيتسكي-غولي تصفية" لضمان سلاسة منحنيات ملزمة من خلال زيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء، وانقر على "عملية بيانات!".
      5. في الخطوة 6، انقر فوق "نتائج المصنعة" لعرض منحنيات ملزمة معالجتها.
      6. في الخطوة 7، واستعراض لوحات الأربعة على حق عرض منحنيات ملزمة بعد كل خطوة من خطوات التجهيز، وانقر على "حفظ البيانات المجهزة".
    3. في "تحليل"، تحقق "جمعية والتفكك" واختيار: نموذج "1 1".
    4. تسليط الضوء على منحنيات ملزمة ل "العالمية (الكامل)" تناسب وتجميعها من قبل "لون". استخدام "R ماكس مرتبطة" لتنفيذ مجموعة المناسب على أجهزة استشعار المغلفة مع نفس متركيز أب للحصول على قيم R ماكس تجريبية لحساب النشاط سطح يجند، و "R ماكس غير المرتبطة بواسطة جهاز استشعار" لتنفيذ تركيب العالمي على أجهزة استشعار المغلفة مع تركيزات ماب متعددة.
    5. انقر على "المنحنيات صالح" للحصول على حركية المعلمات تركيبها. حفظ النتائج في نهاية كل تحليل المناسب.

5. القياسات الحركية في IBIS MX96

  1. الصك وإعداد الكاشف
    1. تتوازن شريحة COOH-G في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
    2. تحضير زجاجة 1-L العازلة تشغيل النظام (PBS [7.4 درجة الحموضة]، 0.01٪ توين-20) والمخزن المؤقت تجميد (10 ملي خلات الصوديوم [الرقم الهيدروجيني 5.0]، 0.01٪ توين-20).
    3. إعداد كل ماب من 20 ميكروغرام / مل إلى 0.16 ميكروغرام / مل من التخفيفات المتسلسلة 2 أضعاف في كل من المخزن المؤقت نظام تشغيل وخلات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 5.0) عازلة الشلل.
    4. الاستغناء العينات ماب إلى قسمين سبتمبرarate 96-جيدا لوحات فيها كل ماب تحتل 8 آبار عمودية في تركيزات المعايرة في 200 ميكرولتر لكل بئر.
    5. أجزاء مأخوذة ذوبان الجليد من 400 ملي EDC و 100 ملي سلفو NHS في درجة حرارة الغرفة.
    6. إعداد 300 ميكرولتر من بروتين A / G في 50 ميكروغرام / مل في خلات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 5.0) عازلة تجميد وماصة عليه في قارورة.
    7. إعداد 200 ميكرولتر من PCSK9 البشري من 100 نانومتر إلى 0.39 نانومتر من التخفيفات المتسلسلة 2 أضعاف في نظام تشغيل العازلة. ماصة لهم في قارورة منفصلة.
  2. حركية دورة متعددة مع صفائف الأجسام المضادة إلى جانب أمين
    1. خلط EDC / أجزاء مأخوذة سلفو NHS (400 ملم / 100 ملم) والاستغناء عن الخليط في أعلى 48 آبار لوحة 96-جيدا جديدة في 200 ميكرولتر لكل بئر.
    2. وضع لوحة ماب المصدر (المخفف في خلات الصوديوم [الرقم الهيدروجيني 5.0]) في المركز 2 ولوحة كاشف EDC / سلفو NHS في الموضع 1 داخل الطابعة.
    3. تثبيت رقاقة الاستشعار في CFM. فتح سوفتواري "CFM 2.0"ه، ثم انقر فوق "إعدادات تحميل | 96 أمين زوجين". يتم إنشاء مجموعة 10 × 8 الأجسام المضادة على النحو التالي:
      1. تقديم EDC / سلفو NHS في النصف العلوي من لوحة كاشف للاستشعار باستخدام 48 microchannels، ودورة لهم على سطح مستشعر ل "5" دقائق.
      2. تقديم عينات ماب في النصف العلوي من لوحة المصدر إلى أجهزة الاستشعار ودورة لهم عبر السطوح تفعيلها للدقيقة "10".
      3. تسليم المخزن المؤقت الشلل من أنبوب مخروطي 50 مل على سطح الأجسام المضادة ل "5" دقائق.
      4. كرر الإجراءات المذكورة أعلاه لعينات ماب المتبقية في النصف السفلي من لوحة المصدر.
    4. إرساء رقاقة الاستشعار المطبوعة في الصك. في برنامج التحكم، انقر فوق "ملف | اتصال | المفتوح قياس | قياس الحالية" وحدد "2014/08/15".
    5. في "عام"، حدد "G - نظام رئيس" تحت عنوان "النصي نظام كامل". ثم حدد "G - Quencح "لإلغاء تنشيط السطوح ماب عن طريق حقن 150 ميكرولتر 1 M إيثانولامين.
    6. انقر على "كاميرا" لتصور صفائف ماب وضبط التباين إذا لزم الأمر. ضع مربعات مربعة الحمراء لتطويق بؤر ماب، ونقل صناديق مربع الخضراء إلى interspots تقع بين البقع MAB نشطة للالرجوع.
    7. في "دورة تحليل"، حدد "A - AP ستاندرد تشغيل" تحت عنوان "المخطوطات IBIS". تعيين 1.0 دقيقة عن خط الأساس، 10.0 دقيقة للجمعية، و 90 خطوات لتفكك بسرعة 8 ميكرولتر / ثانية.
    8. داخل "دورات"، وضخ PCSK9 البشري تركيز واحد في وقت واحد بعد خمس حقن العازلة. تجديد الأسطح ماب مع الجلايسين درجة الحموضة 2.0 بين كل دورة ملزمة.
  3. حركية دورة واحدة مع صفائف الأجسام المضادة القبض على التيسير
    1. تثبيت رقاقة الاستشعار الجديد في CFM. كرر الخطوات من 5.2.3 إلى 5.2.5 أعلاه باستبدال عينات ماب مع بروتين A / G.
    2. مسح الرقاقة الاستشعار من MX96 وأدخلها في الطابعة مرة أخرى CFM.
    3. تقديم MABS في النصف العلوي من لوحة للبروتين A / G سطح مستشعر باستخدام 48 microchannels، ودورة لهم عبر السطح باستخدام تدفق ثنائي الاتجاه لمدة 10 دقيقة.
    4. كرر الخطوة أعلاه لعينات ماب المتبقية في النصف السفلي من اللوحة.
    5. إرساء رقاقة الاستشعار المطبوعة في الصك MX96. في اقتناء البرمجيات بيانات، انقر فوق "ملف | اتصال | المفتوح قياس | قياس الحالية | التالي" وحدد "بروتين A + G kinetic7.30.14 ملزمة".
    6. انقر على "كاميرا" لتصور صفائف ماب وضبط التباين إذا لزم الأمر. ضع مربعات مربعة الحمراء لتطويق بؤر ماب، ونقل صناديق مربع الخضراء إلى interspots تقع بين البقع MAB نشطة للالرجوع.
    7. في "دورة تحليل"، حدد "A - AP ستاندرد تشغيل" تحت عنوان "المخطوطات IBIS". ضبط "1.0 دقيقة" عن خط الأساس، "10.0دقيقة "للجمعية، و" 10 "خطوات التفكك في" 8 ميكرولتر / ثانية "السرعة.
    8. داخل "دورات"، وضخ PCSK9 البشري تركيز واحد في وقت واحد بعد خمس حقن العازلة. يتم تنفيذ أي تجديد بين كل حقنة تحليلها.
  4. تحليل البيانات باستخدام سبرينت والغسيل
    1. في sofware SprintX، انقر فوق "ملف | المفتوحة المثلث ملف"، حدد كافة حقن عينة في القائمة، وتحقق "حفظ الملف SprintX"، "معايرة"، و "تقرير RLL" قبل النقر على "تحليل".
      ملاحظة: القيم RLL تشير إلى مستويات ماب يجمد / القبض على سطح جهاز الاستشعار.
    2. تحقق "المراجع" وحدد "المحلية" لاستخدام النقاط المرجعية المجاورة. كما تحقق "محاذاة" على الحقنة الأولى ومن ثم انقر فوق "أتمتة ابدأ."
    3. في علامة التبويب المسلسل، حدد "إظهار الحكام في شريط الأدوات،" تعديلهالتحديد منطقة صغيرة من خط الأساس مسبق على الفور إلى حقن العينة الأولى، وحدد "صفر".
    4. إنشاء ملف .IBMX للتحليل في الغسيل عن طريق اختيار "تصدير إلى ibmx ملف" ثم انقر فوق "أتمتة ابدأ."
    5. إطلاق الغسيل وتحميل الملف .IBMX. أدخل "100N" باسم "الأوراق المالية اضرب" و "2" باسم "عامل التخفيف".
    6. بيانات المحاصيل، وإزالة كل خط الأساس قبل بداية الحقن، والمواءمة بين منحنيات ملزمة في بداية تكوين الجمعيات.
      ملاحظة: للحصول على تجربة حركية دورة واحدة، لا محاذاة المنحنيات.
    7. انتقل إلى علامة التبويب "حركية"، وضبط الحاكم للمرة نهاية الحقن، وحدد "ك د" ومناسبا، ثم "الإصلاح ك د". حدد "ك في ك د" وأنها تناسب مرة أخرى.
    8. تعويم عمود ك د وتناسب مرة أخرى لزيادة تحسين لياقتهم.
      ملاحظة: للحصول على تركيب المنحنيات ملزمة دورة واحدة، انقر فوق "الأراضي الفلسطينية المحتلة" وإلغاء "طرح"، ثم حدد "منفصل" وتعويم عمود "بيغن ينج" لتناسب ملامح جمعية العودة إلى الأصل الأساس النظري.
    9. مراجعة المعلمات حركية تركيبها في علامة التبويب نتائج.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويبين الشكل 1 صورة الأجسام المضادة مجموعة من CFM ومستويات ماب رصدت من قبل وسائل تجميد اثنين، ويبين الشكل 2 sensorgrams ملزم المقابلة ولدت في MX96 من متعدد دورة الحركية ودورة واحدة القياسات الحركية على هذه المصفوفات ماب . وتظهر في الوقت الحقيقي ملزمة ومنحنيات المجهزة حركيا من الأسطح المغلفة الأجسام المضادة متعددة ولدت في منصات جهاز الاستشعار البيولوجي الأربعة في الأرقام 3-6. ويبين الشكل 7 مقارنة بين معدلات الحركية نهائية وملزمة التوازن الثوابت التي تم الحصول عليها من التحليل على المستوى العالمي من هذه المنحنيات ملزمة. جمعية الفردية (ك أ)، التفكك (ك د)، وتوازن (K D) يتم عرض ثوابت ملزمة في الجدول 1. للتدليل على تنوع قواعد البيانات المتولدة داخل الصك نفسه، ك لذلك، ك د، وK D على مختلف الكثافة السطحية ماب، والشكل 9 يقارن أيضا الأنشطة ملزمة حساب الأسطح ماب عبر منصات جهاز الاستشعار البيولوجي.

figure-results-1
الشكل 1. متعددة يجند صالحة للأمين يقترن (A) و FC القبض على (B) الأجسام المضادة السطوح من CFM الطباعة في IBIS MX96. وتظهر الصور من صفائف المطبوعة في لوحات اليسرى، حيث المناطق الرمادية محاطة المربعات الحمراء تشير إلى وجود الأجسام المضادة. وتستخدم interspots قتامة تقع بين البقع الأجسام المضادة النشطة للالطرح المرجعية. يحتوي كل عمود جسم مضاد المطبوعة في تركيزات المعايرة المحددة أدناه وعلى يسار الصورة. كميات الأجسام المضادة المطبوعة كميا عن طريق حساب ديوترد fference في نوبات السائبة بين المواقع النشطة ومرجعية في لوحات اليمين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2. مقارنة في الوقت الحقيقي Sensorgrams ملزم من متعدد دورة (A) ودورة واحدة (B) التجارب الحركية في IBIS MX96. يشار إلى أن حقن متتابعة من PCSK9 الإنسان إلى زيادة تركيزات عبر 10 × 8 صفائف الضد فوق كل شريحة sensorgram المقابلة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
أعلى) ومتوسطة (لوحات الوسطى)، والمنخفضة (لوحات أسفل) الأسطح كثافة. خطوط سوداء ناعمة مضافين تمثل تناسب الحركية للإشارات استجابة ملزمة في تركيزات مختلفة PCSK9 الإنسان (خطوط ملونة) إلى 1: نموذج التفاعل 1. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4. ربط Sensorgrams من الأجسام المضادة القبض على التفاعل مع PCSK9 الإنسان و1: 1 الحركية نموذج صالح الأغطية في ProteOn XPR36. يتم تقييم التفاعلات عبر عالية (أعلى لوحات)، ميديum- (لوحات الوسطى)، والمنخفضة (لوحات أسفل) الأسطح كثافة. خطوط سوداء ناعمة مضافين تمثل تناسب الحركية للإشارات استجابة ملزمة في تركيزات مختلفة PCSK9 الإنسان (خطوط ملونة) إلى 1: نموذج التفاعل 1. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5
الشكل 5. ربط Sensorgrams من الأجسام المضادة القبض على التفاعل مع PCSK9 الإنسان و1: 1 الحركية نموذج صالح الأغطية في محاذية RED384. يتم تقييم التفاعلات عبر عالية (لوحات أعلى) ومتوسطة (لوحات الوسطى)، والمنخفضة (لوحات أسفل) الأسطح كثافة. الخطوط الحمراء مضافين تمثل تناسب الحركية للإشارات استجابة ملزمة في تركيزات مختلفة PCSK9 الإنسان (خطوط ملونة) إلى 1: 1 نموذج التفاعل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-6
الشكل 6. ربط Sensorgrams للأمين يقترن (A) والقت القبض على التيسير (B) الأجسام المضادة التفاعل مع PCSK9 الإنسان و1: 1 الحركية نموذج صالح الأغطية في IBIS MX96. ويتم تنظيم لمحات ملزمة إلى 10 × 8 لوحات التي تتبع خريطة لوحة مجموعة في الشكل 1. خطوط سوداء تمثل إشارات استجابة ملزمة سجلت في تركيزات مختلفة PCSK9 الإنسان، والخطوط الحمراء مضافين تمثل منحنيات المجهزة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

جوري 7 "SRC =" / ملفات / ftp_upload / 55659 / 55659fig7.jpg "/>
الرقم 7. مقارنة بين جمعية K على (A)، التفكك ك د (B)، والاتزان K D (C) الثوابت الملزمة منشأ بواسطة أربع منصات جهاز الاستشعار البيولوجي. وتستمد المعلمات الحركية من تحليل عالمي للمنحنيات ملزمة في أرقام 3-6. يتم تمثيل الموجودات على النحو التالي: Biacore T100 (الأزرق)، ProteOn XPR36 (الأخضر)، محاذية RED384 (الحمراء)، IBIS MX96، يقترن أمين (اللون الأرجواني)، وIBIS MX96، FC-القبض على (برتقالي). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-7
الشكل 8. مقارنة بين تناسق الحركية الثوابت تقييم مدى متعددة كثافات سطح الأجسام المضادة في BIAC خام T100 (A)، ProteOn XPR36 (B)، محاذية RED384 (C)، IBIS MX96، يقترن أمين (D)، وIBIS MX96، التيسير القبض على (E). المعلمات الحركية K و(أعلى فريقي الباطن)، ك د (المتوسطة وحات فرعية)، وK D (أسفل لوحات فرعية) مستمدة من تحليل مجموعة في كثافة سطح الأجسام المضادة الفردية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-8
الشكل 9. الأنشطة ملزمة من الأجسام المضادة السطوح ومنها ستاندرد انحرافات (أشرطة الخطأ) في أربع منصات جهاز الاستشعار البيولوجي. يتم حساب القيم باستخدام المعادلات الموضحة في مقالات أبحاث 17.large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

ك ل ك د K D
(M -1 ق -1) (ق -1) (نانومتر)
ماب 1 11.7 (7.8) × 10 5 4.89 (4.18) × 10 -5 0،052 (0.05)
ماب 2 1.53 (0.28) × 10 5 1.30 (1.54) × 10 -5 0،092 (0.12)
ماب 3 11.4 (8.3) × 10 5 27.6 (11.0) × 10 -5 0،333 (0.20)
ماب 4 3.61 (1.6) × 10 5 20.1 (12.3) × 10 -5 0،659 (0.54)
ماب 5 0.59 (0.21) × 10 5 3.46 (2.50) × 10 -5 0،663 (0.46)
ماب 6 1.19 (0.78) × 10 5 7.21 (3.83) × 10 -5 0،894 (0.64)
ماب 7 1.29 (0.53) × 10 5 16.4 (5.63) × 10 -5 1.57 (1.02)
ماب 8 4.02 (2.23) × 10 5 22.8 (10.7) × 10 -5 0،768 (0.68)
ماب 9 4.20 (2.13) × 10 5 6.67 (4.3) × 10 -5 0،197 (0.16)
ماب 10 1.20 (0.49) × 10 5 12.5 (7.64) × 10 -5 1.27 (0.80)

الجدول 1: الحركية الأسعار والتوازن ملزم الثوابت من 10 MABS التي تحصل عليها تركيب العالمي للمنحنيات تجليد من أربعة أجهزة الاستشعار البيولوجي إلى 1: التفاعل نموذج 1.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتبين دراستنا المقارنة وجها لرئيس أن كل منصة جهاز الاستشعار البيولوجي لديه نقاط قوة ونقاط الضعف الخاصة بها. على الرغم من أن الشخصية ملزمة من الأجسام المضادة متشابهة من خلال المقارنة البصرية (أرقام 3-6)، وبالترتيب من الثوابت معدل الحركية المكتسبة ومتسقة للغاية عبر الصكوك (الشكل 7)، تظهر نتائجنا أن الصكوك SPR المستندة مع FLUIDICS تدفق مستمر) هي أفضل حل في التفاعلات عالية تقارب مع معدلات التفكك البطيء. ويلاحظ انحراف التصاعدي خلال مرحلة التفكك في قواعد البيانات (على سبيل المثال، ماب 2، ماب 5، وماب 9؛ الشكل 5) التي تم إنشاؤها من قبل حرة FLUIDICS-أداة BLI. ويمكن أن يعزى هذا الاستنتاج في جزء كبير منه إلى عينة تبخر مع مرور الوقت في صفيحة، وهو الحد الأساسي للنظام. مع هذا القيد الأصيل، ويقتصر الوقت التجريبية أيضا إلى أقل من 12 ساعة. لذا كانت مبرمجة التجارب مع شمرات orter (جمعية 500 ق و 30 دقيقة التفكك) مقارنة مع أولئك من منصات أخرى (جمعية 10 دقيقة و 45 دقيقة التفكك). ومع ذلك، وتقصير الوقت التجريبية لم تظهر للتخفيف من تأثير التبخر على نوعية البيانات / الاتساق، والثوابت معدل الناتجة عن أداة تستند BLI-تظهر أقل الخطي نتيجة للتقلبات في بعض من معدلات (الشكل 8C ). بالإضافة إلى عينة التبخر، وربما ساهمت الاختلافات في الكواشف القبض تستخدم أيضا للاختلافات في النتائج المتحصل عليها. في حين تم استخدام بروتين A / G في جميع منصات SPR الثلاث التي تتخذ من FLUIDICS، واستخدمت أجهزة الاستشعار AHC في منصة BLI غير FLUIDICS. منذ بروتين A / G من المحتمل أن يكون لها تقارب ضعف لMABS مما يفعل AHC، سطح جهاز الاستشعار البيولوجي القائم على الأجسام المضادة، وبعيدا عن معدلات مجمع ماب مستضد من البروتين A / أسطح G قد تظهر بشكل مصطنع أسرع من تلك التي تم الحصول عليها من سطح AHC. ويدعم هذا الاحتمال بذ البيانات التجريبية تبين أن قيم معدل خارج الناتجة عن منصة BLI كانت أقل باستمرار من تلك التي تم الحصول عليها من الأدوات الأخرى (الشكل 7، خط أحمر). ومع ذلك، فإن منصة BLI لها مزايا مختلفة على منصات أخرى. على سبيل المثال، هو درجة عالية من المرونة فيما يتعلق باختيار أجهزة الاستشعار والتكوين الفحص نظرا لمختلف أجهزة الاستشعار قبل المغلفة للاستخدام الفوري. في تجاربنا، واستخدام أجهزة الاستشعار AHC القضاء على الحاجة إلى اتخاذ خطوات يجند الشلل، مما يقلل من الوقت اللازم لإعداد. وعلاوة على ذلك، ومنصة BLI تتطلب صيانة أقل بكثير بالمقارنة مع منصات FLUIDICS SPR الأخرى، والتي تتميز معقدة أنابيب والتبديل قيمة تكوينات. هذه الميزة هي ميزة لالتجارب التي تنطوي على عينات الخام التي يمكن أن تسبب مشاكل انسداد والتلوث.

حيث أن الطلب لتحديد كفاءة، سريع، ودقيق للزيادات المرشحين العلاجية، والحاجة إلى ثنائيةosensor الإنتاجية آخذ في الارتفاع أيضا. بين منصات جهاز الاستشعار البيولوجي الأربعة، والإنتاجية من جهاز الاستشعار البيولوجي قادرة على 96 يجند طباعة مجموعة هي الأعلى، تليها جهاز الاستشعار البيولوجي إلى جانب ليتنقل شكل 36 يجند وجهاز الاستشعار البيولوجي استنادا BLI مع قراءات في وقت واحد 16 قناة، والتي تزيد في نهاية المطاف عدد التفاعلات قياس في دورة ملزمة واحدة إلى 96 و 36 و 16، على التوالي. هذه القدرات الإنتاجية هي أعلى بكثير من منصة SPR التقليدية، التي تقتصر من خلال وجود أربعة فقط تدفق الخلايا متصلة بواسطة تدفق تسلسلي واحد. منذ شملت تجاربنا مجموعة عينة صغيرة نسبيا من 10 MABS تقييم بكثافة سطح متعددة مع أوقات طويلة التفكك، لعبت دور فعال الانتاجية دورا معتدلا في تحديد كفاءة التجارب. لم تكن هناك فروق ذات دلالة إحصائية في الأوقات التجريبية للمنصات عالية الإنتاجية الثلاثة، وفي جميع الحالات تم الانتهاء من التجارب في يوم واحد. من ناحية أخرى، تتطلب التجارب التقليدية SPR تدفق التسلسلي 3 أيام لاستكمال، على الرغم من أتمتة سيرا على الأقدام من الحصول على البيانات بعد الإعداد. في الدراسات الأخرى التي تنطوي على عدد كبير من العينات (أي في مئات أو آلاف)، لأغراض ترتيب معدل خارج / الفحص الحركي أو binning حاتمة، تصبح الإنتاجية عاملا حاسما.

على الرغم من أن الإنتاجية في IBIS MX96 هي أوامر من حجم أعلى من ذلك من أجهزة الاستشعار الأخرى، وبالتالي هي الخيار الأمثل لهذه الأغراض، ولديها بعض أوجه القصور. على وجه الخصوص، وطباعة مجموعة من CFM تظهر التناقضات سطح الكبيرة (الشكل 1) وانخفاض استنساخ البيانات (الشكل 8D و8E). لقياس حركية دقيقة، ومقدار يجند على سطح جهاز الاستشعار البيولوجي معلمة الحرجة التي تحتاج إلى رقابة لضمان أن ردود ملزمة ليست منزعجة من العوامل الثانوية مثلنقل الجماعي أو عائق الفراغية. لBiacore T100 وProteOn XPR36، تم تحديد مستويات L الأمثل R على أساس حساب معيار القيم ماكس مجموعة R كما هو موضح في المادة 17 البحوث. من ناحية أخرى، لمنصات محاذية RED384 وIBIS MX96، وتم تحقيق مستويات القبض ماب تجريبيا باستخدام سلسلة من الأجسام المضادة 2 أضعاف المخفف متسلسل في أوقات ثابتة. أدى عدم المعرفة أو السيطرة على خطوة القبض في سطح ذات الكثافة السكانية العالية وإشارات عالية ملزمة استجابة (الشكل 2) التي قد يؤثر سلبا على دقة الثوابت معدل الحركية. وعلاوة على ذلك، وفصل الطابعة من كشف SPR يعرض أيضا تحديا عند إجراء قياسات متعددة دورة الملزمة التي تنطوي على regenerations. وكانت الطريقة الوحيدة لتنفيذ الإعداد حركية متعددة دورة من خلال اقتران أمين المباشر للMABS، بدلا من القبض على طريق ماب التيسير من قبل يجمد بروتين A / Gالسطح في منصات جهاز الاستشعار البيولوجي الثلاثة الأخرى. ونتيجة لذلك، كان مطلوبا تجربة إضافية تجديد الكشفية لتحديد الظروف المثلى تجديد. ارتبط نتيجة هذا الإعداد إلى ~ انخفاض 90٪ النشاط الملحوظ سطح بالمقارنة مع التيسير طريقة القبض على (الشكل 9)، بالإضافة إلى وقت أطول التجريبية. لتنفيذ أسلوب القبض على التيسير، اعتمد هذا النهج الحركي البديلة دورة واحدة. وينطوي هذا النهج على حقن متتابعة من تحليلها إلى زيادة تركيزات دون تجديد بين كل حقنة (الشكل 2). هذا النهج مريحة للغاية، ولكن أقل تطبق عادة ليس فقط تقصير الوقت التجريبية وخفض استهلاك كاشف، ولكن أيضا إنتاج الثوابت معدل الحركية مشابهة جدا لتلك من أجهزة الاستشعار الأخرى (الشكل 7). ولذلك، فإن تطبيق هذا النهج حركية واحدة دورة يتغلب على قيد التكوين الطبيعي للدول الصك ويقدم لفرصة للحصول على عالية الدقة الحركية الثوابت معدل بطريقة عالية الإنتاجية.

وعلى الرغم من الإنتاجية كونه قيدا رئيسيا في Biacore T100، نتائجنا تظهر بشكل جماعي أنها ولدت البيانات أكثر اتساقا مع أعلى مستويات الجودة. وأعقب ذلك في ProteOn XPR36، التي لديها أعلى ~ 10 أضعاف الإنتاجية. قدرتها على توليد بيانات عالية الجودة يصبح ميزة عند تميز عالية تقارب التفاعلات الضد مستضد التي يمكن أن يكون تحديا تقنيا عند الوصول إلى حدود الكشف الصكوك. في حين أن القيود المنهجية في الأجهزة من محاذية RED384 تعيق القياس الدقيق للثوابت معدل التفكك (أي مقصر من حساسية لحل كافية تسوس إشارة لبطء خارج الرسوم)، فإن كلا من Biacore T100 وProteOn XPR36 يمكن أن توفر حساسة وموثوق بها الكشف عن التمايز.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دفع رسوم النشر لهذا الفيديو المقال من قبل بورنغير إنغلهايم الصيدلة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب أشكر نواه ديتو وآدم مايلز للحصول على المساعدة الفنية على IBIS MX96.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
نظام Biacore T100GE Healthcare28975001تمت ترقية نظام T100 إلى
رقاقة مستشعر T200 CM5   ؛جنرال إلكتريك للرعاية الصحيةBR100012
تقييم BIA GE Healthcareالإصدار 4.1
Biacore T100 برنامج التحكمGE Healthcareتمت ترقية برنامج التحكم T100 إلى T200
Amine Coupling KitHealthcareBR100050 يحتوي على: 750 مجم 1-إيثيل -3- (3-ثنائي ميثيل أمينوبروبيل) كاربوديميد هيدروكلوريد (EDC) ، 115 مجم N-hydroxysuccinimide (NHS) ، 10.5 مل 1.0 M إيثانول أمين - حمض الهيدروكلوريك 8.5   ؛
HBS-EP + المخزن المؤقت 10 مرات ؛GE HealthcareBR100669حل المخزون المركز 
قوارير بلاستيكية ، OD 7 ممGE HealthcareBR100212 
أغطية مطاطية ، قواريرHealthcareBR100502
، OD 11 ممGE HealthcareBR100214  ؛
نظام مصفوفة تفاعل البروتين ProteOn XPR36Bio-Rad1760100
ProteOn Manager Software Bio-Rad1760200الإصدار 3.1.0.6
GLM Sensor ChipBio-Rad1765012
Amine Coupling KitBio-Rad1762410ويشمل EDAC (EDC) و sulfo-NHS و ethanolamine HCl & nbsp ؛
مجموعة التجديد والتكييف والمخازنالمؤقتة Bio-Rad1762210وتشمل 1 كل عازلة جلايسين (درجة الحموضة 1.5 ، 2.0 ، 2.5 ، 3.0) ، و NaOH ، SDS ، HCl ، حمض الفوسفوريك ، كلوريد الصوديوم ؛ 50 مل لكل محلول   ؛
2 لتر PBS / Tween / EDTA عازلةBio-Rad1762730وتشمل محلول ملحي مخزن (PBS) ، درجة الحموضة 7.4 ، 0.005٪ Tween 20 ، 3 mM EDTA   ؛
ثماني نظام RED384فورت & إيكوت. برنامج تحليل البيانات الحيوية
Fort & eacute; الإصدار الحيوي9.0.0.4
غمس وقراءة أجهزة الاستشعار الحيوية المضادة ل hIgG Fc Capture (AHC) Fort & eacute; Bio18-5060صينية واحدة تحتوي على 96 جهاز استشعار حيوي  
384-بئر مائلة أسفل لوحة فورت إيكوت. Bio18-5080
موزع الاستشعار الحيويFort & eacute ؛ Bio18-5016
Kinetics Buffer 10xFort & eacute ؛ Bio18-1092تركيز 10x. يحتوي على ProClin 300. 
IBIS MX96 SPRi SystemWasatch Microfluidics
Microfluidics التدفق المستمر Microspotter (CFM) طابعةWasatch Microfluidicsالإصدار 2.0
SensEye COOH-G رقاقةWasatch Microfluidics1-09-04-004
برنامج تحليل البياناتWasatch Microfluidicsالإصدار 6.19.3.17
SPRint برنامجتحليل البياناتWasatch Microfluidicsالإصدار 6.15.2.1
الغسيل 2برنامج BioLogicالإصدار 2
بيرس البروتين المؤتلف A / GThermoFisher Scientific21186
GE وأغطية بلاستيكية من النوع 3 GE جهاز

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cooper, M. A. Optical biosensors in drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 1 (7), 515-528 (2002).
  2. Van Regenmortel, M. H., et al. Measurement of antigen-antibody interactions with biosensors. J Mol Rec. 11 (1-6), 163-167 (1998).
  3. Davidoff, S. N., Ditto, N. T., Brooks, A. E., Eckman, J., Brooks, B. D. Surface Plasmon Resonance for Therapeutic Antibody Characterization. Label-Free Biosensor Methods in Drug Discovery. , Available from: http://link.springer.com/10.1007/978-1-4939-2617-6_3 35-76 (2015).
  4. Canziani, G. A., Klakamp, S., Myszka, D. G. Kinetic screening of antibodies from crude hybridoma samples using Biacore. Anal Biochem. 325 (2), 301-307 (2004).
  5. Katsamba, P. S., et al. Kinetic analysis of a high-affinity antibody/antigen interaction performed by multiple Biacore users. Anal Biochem. 352 (2), 208-221 (2006).
  6. Abdiche, Y. N., Malashock, D. S., Pinkerton, A., Pons, J. Exploring blocking assays using Octet, ProteOn, and Biacore biosensors. Anal Biochem. 386 (2), 172-180 (2009).
  7. Abdiche, Y. N., et al. High-Throughput Epitope Binning Assays on Label-Free Array-Based Biosensors Can Yield Exquisite Epitope Discrimination That Facilitates the Selection of Monoclonal Antibodies with Functional Activity. PLoS ONE. 9 (3), e92451(2014).
  8. Ecker, D. M., Jones, S. D., Levine, H. L. The therapeutic monoclonal antibody market. mAbs. 7 (1), 9-14 (2014).
  9. Rich, R. L., Myszka, D. G. Higher-throughput, label-free, real-time molecular interaction analysis. Anal Biochem. 361 (1), 1-6 (2007).
  10. Keighley, W. The need for high throughput kinetics early in the drug discovery process. Drug Disc World. 12 (3), 39-45 (2011).
  11. Lad, L., et al. High-throughput kinetic screening of hybridomas to identify high-affinity antibodies using bio-layer interferometry. J Biomol Screen. 20 (4), 498-507 (2015).
  12. Bravman, T., Bronner, V., Nahshol, O., Schreiber, G. The ProteOn XPR36TM Array System-High Throughput Kinetic Binding Analysis of Biomolecular Interactions. Cell Mol Bioeng. 1 (4), 216-228 (2008).
  13. Eddings, M. A., et al. Improved continuous-flow print head for micro-array deposition. Anal Biochem. 382 (1), 55-59 (2008).
  14. Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor the Octet. Anal Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).
  15. Abdiche, Y. N., Lindquist, K. C., Pinkerton, A., Pons, J., Rajpal, A. Expanding the ProteOn XPR36 biosensor into a 36-ligand array expedites protein interaction analysis. Anal Biochem. 411 (1), 139-151 (2011).
  16. Rich, R. L., et al. A global benchmark study using affinity-based biosensors. Anal Biochem. 386 (2), 194-216 (2009).
  17. Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. Comparison of biosensor platforms in the evaluation of high affinity antibody-antigen binding kinetics. Anal Biochem. 508, 78-96 (2016).
  18. Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. Dataset of the binding kinetic rate constants of anti-PCSK9 antibodies obtained using the Biacore T100 ProteOn XPR36, Octet RED384, and IBIS MX96 biosensor platforms. Data in Brief. 8, 1173-1183 (2016).
  19. Bouvier, E. S. P., Koza, S. M. Advances in size-exclusion separations of proteins and polymers by UHPLC. Trends Anal Chem. 63, 85-94 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Antibody antigen Binding KineticsBiosensor Platform ComparisonSurface Plasmon ResonanceBioLayer InterferometryHigh affinity Monoclonal AntibodiesPCSK9 Binding AnalysisKinetic Data ConsistencyMultiplex Array PrintingContinuous Flow MicrospotterOrbital Agitation Detection

Related Articles