Method Article

وهناك طريقة لاختبار تأثير الإشارات البيئية على سلوك التزاوج في ذبابة الفاكهة ميلانوغاستر

DOI:

10.3791/55690

⸱

July 17th, 2017

 , 
1Groningen Institute for Evolutionary Life Sciences, University of Groningen

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

علينا أن نظهر فحص لتحليل الإشارات البيئية والجينية التي تؤثر على سلوك التزاوج في ذبابة الفاكهة ذبابة الفاكهة ميلانوغاستر .

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تتأثر القيادة الجنسية للفرد بالنمط الجيني والخبرة والظروف البيئية. كيف أن هذه العوامل تتفاعل لتعديل السلوكيات الجنسية لا يزال غير مفهومة. في ذبابة الفاكهة ذبابة الفاكهة ، الإشارات البيئية، مثل توافر الغذاء، تؤثر على نشاط التزاوج تقديم نظام قابل للسحب للتحقيق في آليات تحوير السلوك الجنسي. في D. ميلانوغاستر ، غالبا ما تكون الإشارات البيئية مستشعر عن طريق النظم الذقنية الحسية و الشم. هنا، نقدم طريقة لاختبار تأثير الإشارات الكيميائية البيئية على سلوك التزاوج. يتكون الفحص من الساحة التزاوج الصغيرة التي تحتوي على المتوسطة الغذاء وزوجين التزاوج. يتم رصد تردد التزاوج لكل زوجين باستمرار لمدة 24 ساعة. هنا نقدم تطبيق هذا الاختبار لاختبار المركبات البيئية من مصدر خارجي من خلال نظام الهواء المضغوط وكذلك التلاعب في المكونات البيئية مباشرة في ساحة التزاوج. شسي من نظام الهواء المضغوط مفيد بشكل خاص لاختبار تأثير المركبات المتطايرة جدا، في حين أن التلاعب المكونات مباشرة في الساحة التزاوج يمكن أن تكون ذات قيمة للتأكد من وجود المركب. ويمكن تكييف هذا الفحص للرد على أسئلة حول تأثير الإشارات الوراثية والبيئية على السلوك التزاوج والخصوبة وكذلك السلوكيات الإنجابية الأخرى للذكور والإناث.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وعادة ما يكون للسلوك التناسلي تكاليف عالية للطاقة، وخاصة بالنسبة للإناث، الذين ينتجون أشجار أكبر من الذكور، ويجب عليهم أن يختاروا بعناية ظروف تربية ذريتهم النامية. بسبب تكلفة الطاقة، فإنه ليس من المستغرب أن الإنجاب يرتبط الظروف التغذوية. وهذا صحيح في معظم، إن لم يكن كلها، والحيوانات بما فيها الثدييات، التي يمكن أن تتأخر بسبب سوء التغذية، والتي يمكن أن تتأثر سلبا الغذائية تقييد 1 الدافع الجنسي البلوغ.

ويتأثر استنساخ الكائن الحي النموذجي ذبابة الفاكهة ميلانوغاستر أيضا بالظروف التغذوية. محكمة الذكور على مستوى أعلى في وجود المواد الغذائية المتطايرة 2 ، والإناث أكثر تقبلا جنسيا في وجود الخميرة، والمغذيات الرئيسية لإنتاج البيض والبقاء على قيد الحياة بقاء 3 ، 4 ، 5 . هذهتوفر الاستجابة التنموية للإنجاب للأغذية الفرصة لدراسة الآليات التي تربط توافر الأغذية البيئية بالتكاثر الجنسي في كائن حي وراثيا قابل للوقت وفعال. في الواقع، العمل في D. ميلانوغاستر تورط مسار الأنسولين كمنظم مهم من الصلة بين الغذاء والسلوك التزاوج 6 . وقد أظهرت أيضا أن فعل التزاوج نفسه يغير تفضيلات الطعام للإناث وكذلك الخلايا العصبية الحسية الكيميائية المرتبطة 7 ، 8 ، 9 .

ومن الواضح أن الإشارات الغذائية تؤثر على السلوكيات الإنجابية في D. ميلانوغاستر . ويبدو أن هذه التأثيرات تؤثر بشكل رئيسي على الإناث، وتحديدا أولئك الذين تزاوجوا بالفعل 5 . ومع ذلك، لاختبار هذه الآثار الحادة للظروف البيئية الفحص كلاسيكيا المستخدمة لسلوك التزاوج الإناث قدلا تكون مناسبة جدا بسبب انقطاعات طويلة بين حلقات التزاوج. في مقايسة ريميناتينغ الكلاسيكية، وهي أنثى البكر الأولى الاصحاب مع الذكور، وعزل على الفور وقدم مع ذكر جديد 24 إلى 48 ساعة في وقت لاحق. وقد استخدمت هذه المقايسة الكلاسيكية مع نجاح كبير لتحديد مكونات من الذكور القذف التي تعدل سلوك الأنثى والاستجابة الأنثوية 12 ، 13 ، 14 ، 15 ، 16 ، 17 ، 18 . وبالتالي فإن فحص التزاوج المستمر يظهر هنا، وبالتالي، إضافة إلى المقايسات التزاوج الكلاسيكية التي يمكن استخدامها لدراسة التأثير الحاد للظروف البيئية على السلوكيات الإنجابية.

باستخدام الفحص المستمر لسلوك التزاوج التي تم شرحها هنا، أظهرنا سابقا أن زوج من الذباب المعرضة للخميرة سوف ريمات sعلى مدى 24 ساعة من فترة المراقبة 5 ، 19 ، 20 ، 21 ، في حين أن الذباب غير المعرضة للأغذية سوف تكرر مرة واحدة فقط 5 . هذه النتيجة يمكن أن تكون محيرة في ضوء جزء كبير من الأدب D. ميلانوغاستر مشيرا إلى أن الإناث لا ريمات لعدة أيام بعد التزاوج الأولي (استعرض في المراجع 10 ، 11 ). ومع ذلك، يمكن تفسير هذا التباين بسهولة عن طريق ظروف الفحص، حيث يتم عزل الإناث لمدة تتراوح بين يوم واحد إلى عدة أيام قبل توفير فرصة التزاوج الجديدة. إذا كان الزوج لا يتزاوج في هذه الفترة المراقبة لمدة ساعة، وتتميز الأنثى بأنها ليست تقبلا. وعلاوة على ذلك، لا ينبغي أن يكون ارتفاع تزاوج التزاوج مفاجئا نظرا لأن البيانات من الذباب اشتعلت البرية تظهر أن الإناث تحتوي على الحيوانات المنوية من 4 إلى 6 ذكور في أجهزة التخزين الخاصة بهم؛ وبالتالي فيديكاتينغ أن الإناث بطبيعة الحال ريمات عدة مرات 22 ، 23 .

هنا، علينا أن نظهر استخدام هذا الفحص التزاوج المستمر لكشف كيفية جمع الذباب والجمع بين المعلومات حول الظروف البيئية لتعديل تردد التزاوج. يسمح هذا الفحص واحد لاختبار عدد كبير نسبيا من الأزواج التزاوج للدراسات الجينية واختبار تأثير الإشارات البيئية المتقلبة وغير المتطايرة. المقياس عادة ما يعمل لمدة 24 ساعة، ولكن يمكن أن تمتد إلى 48 ساعة، مما يسمح لاختبار الإشارات البيئية الدراجات مثل دورة ضوء الظلام (لد). علينا أن نظهر هذا الاختبار من خلال اختبار تأثير الإشارات المتطايرة من ثقافة الخميرة داخل نظام الهواء المضغوط في تركيبة مع توافر غير المتطايرة المغذيات الخميرة في الركيزة الغذاء.

نظام الهواء المضغوط باستمرار المضخات المتطايرة في ساحة التزاوج التي تحتوي علىالركيزة الغذائية و زوجين اختبار (الذي يتم رصد سلوك التزاوج). لتحديد مزيد من التفاصيل التي من خلالها الخميرة تؤثر على التزاوج، ونحن اختبار مجمع متقلبة كبيرة من الخميرة، وهي حمض الخليك 24 ، جنبا إلى جنب مع محتوى الأحماض الأمينية التي تتطابق مع الخميرة في الركيزة الغذاء، في شكل الببتون (الأمينية الأحماض المستمدة من الهضم الأنزيمي للبروتينات الحيوانية). وتظهر هذه التجارب معا كيف يمكن اختبار تأثير الإشارات البيئية على سلوك التزاوج من D. ميلانوغاستر مع هذا الفحص.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. مربع التزاوج التي تسيطر عليها بيئيا

  1. لضمان تسيطر عليها وسهلة التنظيف منطقة الاختبار، وإعداد المقاوم للصدأ المطبخ مجلس الوزراء من 120 سم × 64 سم × 85 سم كما هو موضح في الشكل 1A.
    1. حفر ثقب واحد في الجزء الخلفي من مجلس الوزراء أسفل السقف وأربع مجموعات من أربعة ثقوب في الجانبين، كل منها يبلغ قطرها 2 سم. حفر أول مجموعتين من أربعة ثقوب، على كل جانب من مربع على ارتفاع 7 سم من الجزء السفلي من مربع ومع 12.5 سم بين الثقوب. حفر المجموعتين الأخريين على كل جانب من مربع على ارتفاع 35 سم من القاع.
      ملاحظة: يتم استخدام أربع مجموعات من أربعة ثقوب لكاميرات الطاقة الكاميرا وأنابيب مضخة الهواء للدخول والخروج من مجلس الوزراء. يتم استخدام الثقب في الجزء الخلفي لكابلات الطاقة من لوحة ضوء.
    2. بناء لوحة ضوء مع 18 صفوف من 40 بالتناوب الثنائيات الباعثة للضوء الأبيض والأحمر (ليد) مع مساحة 2.5 سم بين كل ضوء.العد المصابيح البيضاء والحمراء في سيركوير مع امدادات الطاقة. ربط كل ليد في سلسلة مع المقاوم من 560 Ω، 0.25W و 5٪ التسامح.
      ملاحظة: موجات الانبعاثات من الضوء الأحمر امتدت من 590-661 نانومتر مع ذروة حادة في 627 نانومتر. إن شدة الضوء الناتجة في المنطقة التجريبية حوالي 900 لوكس مع كل من الأضواء على و 90 لوكس فقط مع أضواء حمراء على؛ وقد تم قياس هذا باستخدام التطبيق الذكي ضوء متر.
    3. إرفاق مجلس الضوء إلى الجزء العلوي من الفولاذ المقاوم للصدأ مجلس الوزراء وتمرير كابلات الطاقة من خلال ثقب في الجزء الخلفي.
    4. قم بتوصیل مھایئ المصابیح البیضاء الأبیض إلی موقت تحکم في الطاقة للسماح بإیقاف تشغیل ليد الأبیض أثناء المرحلة المظلمة من التجربة. قم بتوصيل محول الضوء الأحمر، الذي الذباب أعمى إلى 25 ، إلى إمدادات الطاقة العادية للحفاظ عليها لمدة كاملة من التجربة.
    5. إصلاح واحد 110 سم واثنين من قوسين 54 سم طويلة معدنية، ولكل منها عرض 0.5 سم، إلى الجانبين الداخلي من مربع على ارتفاع 50سم من أسفل المربع. وضع لوحة نشر الزجاج بلوري (أبعاد 119.0 سم × 54.5 سم × 0.5 سم) على هذه الأقواس.
    6. إضافة ثلاث طبقات من ورق الترشيح (120 سم × 50 سم) بين لوحة الضوء واللوحة الزجاجية لنشر الضوء والحد من الوهج على سطح ساحات التزاوج (الموصوفة في القسم 4). دبوس اثنين ورقة مرشح ورقة معا على الحافة طويلة على 120 سم طويلة قضبان خشبية باستخدام المغناطيس (على الجانب)، التمسك بها إلى الدواخل من مجلس الوزراء المعادن؛ تنفيذ هذا الإجراء 3 مرات.
    7. إرفاق أربعة المشجعين على جانبي مربع لإنشاء تيار الهواء التي تفتح باستمرار مربع التزاوج. إرفاق المجموعة الأولى من 8 سم المشجعين بين لوحة الضوء واللوحة الزجاجية، مع مدخل الهواء في الجانب الأيسر والعادم في الجانب الأيمن من مربع، للحد من بناء ارتفاع الحرارة الناتجة عن لوحة الضوء.
    8. إرفاق المجموعة الثانية من 12 سم المشجعين 25 سم فوق الجزء السفلي من مجلس الوزراء لخلق تدفق الهواء إلى الخارج أن فتحات طنزيد من مجلس الوزراء ويبرد إلى مستقرة 26 درجة مئوية. إرفاق المشجعين في الجانب العادم إلى خرطوم شفط وقيادة تيار الهواء من الغرفة لمنع إعادة تدوير الهواء في مجلس الوزراء.
  2. إعداد اثنين من المدرجات (حوالي 48 سم طويل القامة) التي شنت مع اثنين من المشابك، واحد في 28 سم واحد في 30 سم من قاعدة من الحامل. إصلاح كاميرا ويب على كل من المشابك. قم بتوصيل الكاميرات 4 بجهاز كمبيوتر يقوم بتشغيل برنامج المراقبة.
  3. ضع A4 ورقة تحت كل كاميرا ويب. استخدام أوراق بيضاء أو صحائف غير مطبوع مع شبكة مرقمة مسبقا من 7 بنسبة 5 مربعات مع 4 سم محاور لاستيعاب ساحات التزاوج (الموصوفة في القسم 4).
    ملاحظة: كاميرا هد كاميرا ويب مع 78 درجة زاوية واسعة الرؤية و 5 مليون بكسل القرار يمكن أن تغطي مساحة 21 سم × 30 سم المقابلة ل A4 ورقة ورصد ما بين 20 و 35 ساحات التزاوج.

2. يطير تربية وجمع

  1. وضع 20 الذكور و 20 أنثى البرية من نوع كانتون- Sيطير في زجاجات تربية ذبابة تحتوي على 45 مل ذبابة غنية المتوسطة الغذاء (انظر القسم 3) لمدة ثلاثة إلى أربعة أيام. نقل نفس البالغين ثلاث مرات من قبل التنصت عليها أولا ثم إلى زجاجات جديدة.
    1. وضع الزجاجات في حاضنة عند 25 درجة مئوية، و 12 ساعة: 12 ساعة ضوء الظلام دورة مع أضواء في الساعة 09:00 (زيتجيبر الوقت (زت) 0). سيظهر جيل جديد بعد حوالي 10 أيام.
  2. تخدير الناجم حديثا الذباب إكلوسد على منصات ثاني أكسيد الكربون لمدة لا تزيد عن 5 دقائق وجمعها في قوارير الطعام يطير باستخدام فرشاة الطلاء.
    1. جمع البكر (إكلوسد حديثا) الإناث والذكور البكر من البرية من نوع كانتون- S زجاجات الأسهم في 2.5 سم × 9.5 سم قوارير تربية يطير مع 6.5 مل من الأغذية الغنية الطيران المتوسطة.
  3. العمر الذباب في مجموعات الجنس نفسه من 20 يطير كل في قارورة تربية الطيران لمدة 5 إلى 8 أيام عند 25 درجة مئوية و 12 ساعة: 12 ساعة ضوء الظلام دورة والأضواء في الساعة 09:00 (زت 0).
  4. Transfإيه الذباب لقوارير تربية ذبابة طازجة في اليوم السابق للتجربة.

3. إعداد الطعام المتوسطة

  1. إعداد 1 لتر من ذبابة المتوسطة المتوسطة على النحو التالي.
    1. صب 1 لتر من ماء الصنبور في كوب زجاجي 2 لتر مع شريط مغناطيسي ووضع الكأس على لوحة ساخنة المغناطيسي. الحفاظ على التحريك قبالة وتحويل التدفئة تصل إلى 300 درجة مئوية حتى يتم التوصل إلى درجة حرارة الغليان.
      ملاحظة: خلال فترة الغليان الطويلة في الخطوات التالية سوف تتبخر نسبة من الماء، ولكن جنبا إلى جنب مع المكونات المضافة هذا البروتوكول النتائج في 1 لتر من المتوسطة ذبابة غنية عندما أعدت في درجة حرارة الغرفة حوالي 22 درجة مئوية.
    2. بدوره على التحريك إلى 500 طلقة في الدقيقة (دورة في الدقيقة) وإضافة المكونات التالية إلى الماء المغلي: 10 غرام أجار، 30 غرام من الجلوكوز، 15 غ سكروز، 15 غرام من الذرة، و 10 غرام من القمح الجرثومية، و 10 غرام من دقيق الصويا، و 30 غراما دبس السكر، 35 جم نشط الخميرة الجافة. انتظر الخميرة إلى رغوة بقوة، ثم رفض درجة الحرارة لوحة الساخنةإراتور إلى 120 درجة مئوية.
    3. بعد 10 دقيقة تحويل لوحة الساخنة وصولا الى 30 درجة مئوية والسماح للخليط ضجة حتى يبرد إلى 48 درجة مئوية. مراقبة درجة الحرارة عن طريق إدراج ميزان الحرارة مباشرة في الطعام.
    4. حل 2 غرام من P- هيدروكسي-بنزويك حمض استر الميثيل (تيغوسيبت، 100٪) إلى 10 مل من الإيثانول 96٪. إضافة هذا و 5 مل من 1 M حمض البروبيونيك إلى الخليط. تحريك لمدة 3 دقائق.
    5. صب المتوسطة الغذاء يطير في الساحات (وصفها في القسم 4) لخلق طبقة سميكة 0.3 سم في الجزء السفلي من الساحة.
      1. استخدام كوب زجاجي 200 مل لسكب. عندما كميات دقيقة مهمة، استخدام ماصة 10 مل المصلية.
  2. إعداد المتوسطة يطير ناقص الخميرة بالضبط كما هو موضح في الخطوة 3.1.1 حتى 3.1.5، ولكن تترك الخميرة في الخطوة 3.1.2.
  3. إعداد وسط مع أجار مع أو بدون الببتون عن طريق خلط 10 غرام أجار و 35 غرام الببتون في 1 لتر من الماء المغلي وتنفيذ الخطوات 3.1.4 إلى 3.1.5.

4 - ماتينز إعداد الساحة

  1. بيرس حفرة حوالي 0.3 سم في القطر على الجانب العلوي من 3.5 سم × 1.0 سم طبق بتري البلاستيك باستخدام إبرة إعداد ساخنة (ساخنة إلى احمرار في الموقد بنسن). بدلا من ذلك، استخدام الحديد لحام.
  2. عند إعداد المواد الغذائية المتوسطة مع المركبات الرائحة، ماصة الأولى 30 ميكرولتر (1٪ من المتوسطة الغذاء النهائي، على سبيل المثال حمض الخليك الجليدية 100٪) من المركب المطلوب في الطبق لنصف من الأطباق التجريبية. ترك النصف الآخر من الأطباق فارغة للمقارنة.
    ملاحظة: مع الإعداد الموصوفة هنا، يمكن اختبار بحد أقصى 140 الساحات في آن واحد.
  3. باستخدام ماصة 10 مل المصلية، صب 3 مل من الغذاء المتوسطة في الجزء السفلي من الطبق على رأس المجمع المطلوب. قم بتغطيته بقطعة قماش من الجبن لمنع التلوث، وترك الوسط لتصلب لمدة 1 ساعة تقريبا في درجة حرارة الغرفة.
  4. وضع غطاء على الأطباق والشريط كل اغلاق على الجانبين. إعداد المقابس فيلم البارافين صغيرة لتغطية ثقوبوالأطباق من قبل قطع المتداول من فيلم البارافين إلى 0.2 سم لفات سميكة ثم قطعها إلى 0.5 سم شرائح.

5. الخميرة الثقافة للرائحة

  1. تنمو الخميرة النشطة الجافة على الخميرة استخراج بيبتون سكر العنب (يبد) أجار في 14.0 سم × 2.06 سم طبق بتري. ارتداء قفازات لمنع التلوث في هذه الخطوة.
    1. إعداد يارد أجار لوحات بإضافة 10 غرام استخراج الخميرة، 20 غرام الببتون، 22 غرام من الجلوكوز (0 (+) - مونوهيدرات الجلوكوز) و 15 غرام أجار (نقية) إلى 1 لتر من الماء المغلي عالى النقاء. طبقة الجزء السفلي من طبق بتري مرة واحدة يتم حل كل شيء وتخزين رأسا على عقب في الثلاجة عند 4 درجات مئوية، لمدة تصل إلى 2 أشهر.
    2. رش بعض الحبوب من الخميرة المجففة على لوحة متوسطة يبد، والسماح لهم تذوب. ثم خط لوحة متوسطة باستخدام حلقة معقمة. تخزين لوحة في حاضنة 30 درجة مئوية بين عشية وضحاها. بعد ذلك، تخزين الثقافة في الثلاجة لمدة لا تزيد عن 1 أسبوع.
  2. إعداد يبد السائل المتوسطة طن 1 لتر زجاجات بإضافة 10 غرام استخراج الخميرة، 20 غرام الببتون، 22 غرام من الجلوكوز (0 (+) - مونوهيدرات الجلوكوز) وحلقة ضجة إلى 1 L الماء عالى النقاء.
    1. الأوتوكلاف لمدة 25 دقيقة عند 120 درجة مئوية و 1 بار الضغط. بعد ذلك، تخزين الزجاجات في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 2 أشهر حتى الاستخدام.
  3. تناسب قبعات زجاجة مفتوحة (4.5 سم) مع 0.32 سم سيليكون الحاجز السميك.
    1. قطع اثنين من الثقوب الصغيرة في الحاجز لتلائم بشكل مريح التجهيزات الحاجز الشائكة. إرفاق أنابيب البولي فينيل الصغيرة (بك) (أقطار: الخارجي 0.8 سم والداخلية 0.5 سم) لكلا المنافذ التي تخرج من زجاجة واحدة فقط من مداخل دخول زجاجة. انظر الشكل 1B للتوضيح.
    2. التفاف قبعات المجهزة والأنابيب في رقائق الألومنيوم والأوتوكلاف لمدة 25 دقيقة عند 120 درجة مئوية و 1 بار الضغط.
  4. ارتداء قفازات للحماية من التلوث في هذه الخطوة. تراجع عقيمة ماصة ميكرولتر 100 طرف في واحدة من المستعمرات الخميرة من لوحة يجار يبد (دالمكشوف في 5.1) وإسقاطه في زجاجة يبد المتوسطة السائل تعقيمها.
    1. كاب هذا الخميرة الملقحة يبد زجاجة السائل المتوسطة وكذلك يبد زجاجة التحكم المتوسط ​​(الخميرة لم تضاف) مع قبعات تعقيمها شنت مع في ومخرج (وصفها في الخطوة 5.3). وضع كل من الزجاجات على لوحات مغناطيسية منفصلة ويقلب في 100 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة قبل بدء التجربة للسماح للثقافة الخميرة في النمو.
    2. ربط مداخل كل من زجاجات لفصل مضخات الحوض لتزويد الهواء إلى ثقافة الخميرة. تأكد من توصيل منفذ من زجاجة الخميرة التجريبية إلى أنبوب تنفيس الخميرة رائحة من الغرفة التجريبية لمنع التدخل مع التجربة.

6. مضخة الهواء مجموعة المتابعة

  1. إرفاق أنابيب بك كبيرة (أقطار: الخارجي 1.2 سم والداخلية 0.9 سم) لتوريد الهواء المضغوط وقيادة ذلك من خلال اثنين من زجاجات L 1 إرلنمير مليئة الفحم المنشط إلى 800 ملخط لتنقية الهواء. استخدام الهواء المضغوط عادة ما يتم توفيره في المختبرات كإمدادات الهواء، أو توصيل الأنابيب إلى مضخة الهواء (الهواء المضغوط كان يستخدم هنا).
    ملاحظة: يجب اختيار المواد الأنابيب استنادا إلى الخصائص الكيميائية للالمتطايرة، واختبارها لمنع متقلبة من التمسك بطانة الأنابيب (على سبيل المثال بولي تيترافلوروإيثيلين، النايلون أو الفولاذ المقاوم للصدأ).
  2. جعل اثنين من الخائن الهواء من أنابيب 15 مل وثلاثة 1،000 ميكرولتر نصائح ماصة لكل منهما.
    1. جعل ثلاثة ثقوب من ~ 1 سم القطر. أولا حرق اثنين من الثقوب، وذلك باستخدام إبرة إعداد ساخنة (ساخنة الأحمر في الموقد بنسن)، المتاخمة لبعضها البعض تحت غطاء أنبوب 15 مل. ثم جعل الثقب الثالث عن طريق إزالة الجزء السفلي من الأنبوب.
    2. الغراء نصائح ماصة ميكرولتر 1،000 في الثقوب مع نهاية ضيقة لافتا إلى الخارج. قطع نهاية نصائح ماصة للسماح أكبر تدفق الهواء.
  3. ربط أنابيب بك كبيرة من منفذ من جقارورة إرلنماير مليئة بالخروق إلى طرف ماصة في الجزء السفلي من أنبوب 15 مل. إضافة منافذ الأنابيب البلاستيكية الصغيرة إلى اثنين من نصائح ماصة الأفقية وتقودهم نحو السيطرة وزجاجة التجريبية.
  4. لمنع التلوث من وسط يبد مع الكائنات الحية الدقيقة، ونعلق أنابيب صغيرة إلى مرشح حقنة معقمة (0.45 ميكرون حجم المسام) مع دفع البلاستيك على موصل أنابيب الحاجز الذهاب نحو مرشح، ومسمار على موصل الحاجز البلاستيك ترك مرشح. ثم، نعلق الأنابيب إلى مدخل زجاجة الثقافة يبد (انظر الشكل 1B ).
  5. لمنع الخميرة المحمولة جوا من السفر من قارورة الثقافة إلى الساحة التجريبية، إرفاق أنبوب زجاجي (6.5 سم، القطر الخارجي = 0.5 سم والقطر الداخلي = 0.3 سم) إلى مخرج كل زجاجة الثقافة يبد باستخدام أنابيب صغيرة. نعلق الأنابيب البلاستيكية إلى الجانب الآخر من أنبوب الزجاج وتؤدي هذا نحو الثقوب السفلى (حفر في كل جانب) من مربع التجربة.
    1. ملء أنبوب مع الألياف الزجاجية والأوتوكلاف قبل الاستخدام.
  6. إضافة آخر 15 مل أنبوب الخائن (وصفها في القسم 6.2) إلى أنابيب بك الصغيرة، في كل جانب من المربع التجريبي، للحصول على أنابيب اثنين في مربع في كل من الجانب التجريبي (الأقرب لاستنفاد تيار الهواء مروحة، والحق) وجانب التحكم (الأقرب إلى مدخل تيار مروحة الهواء، اليسار).
  7. إعداد 8x 25 مل الماصات المصلية مع كل 10 منافذ لاختبار 80 الأزواج التزاوج في نفس الوقت، أي 40 لكل حالة الجو.
    1. حرق 10 ثقوب من ~ 0.8 سم القطر، 2 سم بعيدا في ماصة.
    2. قطع الجزء الخارجي من حقنة 1 مل في واحدة صغيرة (2.5 سم) واحد كبير (5 سم) منفذ.
    3. الغراء هذه المنافذ في الثقوب مع الغراء الساخن.
    4. التفاف مجموعة صغيرة من البلاستيك فيلم البارافين حول نهاية منافذ وإرفاق 1،000 ميكرولتر ماصة طرف. قطر فتح طرف هو 0.1 سم. استخدم نصائح نظيفة لكل تجربة.
    5. نعلق اثنين ماصات المصلية، وذلك باستخدام T- الخائن مع القطر الخارجي ≥0.5 سم وقطع قصيرة من الأنابيب البلاستيكية الصغيرة، إلى كل من اثنين من منافذ في كلا الجانبين. الشريط الماصات مسطحة على ورقة بيضاء ورقة (تحت الكاميرات في مربع الصلب).
    6. باستخدام رصد تدفق الهواء، تعيين تدفق الهواء بحيث سرعة الهواء عند الخروج من 1000 ميكرولتر ماصة طرف هو 0.5 م / ث. وهذا يتوافق مع تدفق الهواء من 0.0017 لتر / ثانية لكل طرف.

    7. مراقبة سلوك التزاوج

    1. استخدام ماصة الفم (كما هو موضح في المرجع 26 ) لوضع أنثى تجريبية واحدة في طبق بتري صغير (وصفها في القسم 4) في 15:00 ظهرا (زت 6) وتعطي لها 1 ساعة للتأقلم إلى الساحة التزاوج.
    2. قم بإعداد المربع التجريبي (الموضح في القسم 1) كما يلي:
      1. تشغيل الأضواء، أي المصابيح ضوء أبيض على 12h: 12 ساعة ضوء الظلام دورة متصلة الموقت الذي يتحول علىضوء في 09:00 (ZT0) ومصابيح الضوء الأحمر المستمر للسماح رصد الذباب خلال المرحلة المظلمة من التجربة. بدوره على المشجعين للحد من تسخين من مجلس الوزراء من مصدر الضوء وضمان تنفيس الروائح الزائدة خارج منطقة الاختبار.
      2. قم بتوصيل كاميرات كاميرات الويب بجهاز كمبيوتر وابدأها برصد برنامج مراقبة الصور.
      3. لكل كاميرا، تعيين التركيز والسطوع، والتكبير في برنامج الرصد.
        1. انقر بزر الماوس الأيمن على شاشة الكاميرا، وافتح "خصائص الكاميرا"، وانقر على "التركيز التلقائي". ضبط "التركيز" لتوضيح الشبكة أو أي كلمات مكتوبة على ورقة ورقة. إذا لزم الأمر، قم بتغيير "السطوع" و "التكبير".
      4. تعيين برنامج برنامج الرصد لالتقاط 1 صورة كل 2 دقيقة. انقر بزر الماوس الأيمن على كل شاشة الكاميرا واختر "تحرير الكاميرا" ثم خيار "الإجراءات". انقر لبدء الإجراءات "في إنت العاديةإرفالس "وتغيير الوقت إلى" 2 دقيقة ". اختر" أخذ صورة "لاتخاذ إجراءات محددة لأداء وأخيرا انقر على" موافق ".
      5. انقر بزر الماوس الأيمن على كل شاشة الكاميرا وحدد "بدء الرصد".
    3. بعد 1 ساعة (في زت 7)، نقل الذكور ويلديب إلى طبق بتري باستخدام ماصة الفم، ضع الطبق على ورقة ورقة A4 تحت كاميرات كاميرا ويب، وانقر على "بدء الرصد" لمدة 24 ساعة. لتجربة مضخة الهواء، ضع الطبق في مثل هذه الطريقة التي يتم توصيل ماصة منفذ إلى ثقب مدخل الحلبة التزاوج.
    4. لتحليل سلوك تزاوج الزوجين، قم بما يلي.
      1. حدد وفتح جميع الصور في برنامج عرض الصور والصفحة من خلالها في الترتيب الزمني.
      2. اكتب التاريخ ورقم التجربة ورقم الطبق ووقت البدء في جدول بيانات داخل الصف نفسه. تأخذ وقت البدء من كل الساحة من اللحظة التي يتم وضعها تحت ويبكاm. تسجيل الطابع الزمني من الصور.
      3. حدد وقت بدء كل عملية تكاثر في الصف نفسه في جدول البيانات. عد التزاوج كحدث عندما كان الذكور قد شنت الإناث ويبقى الزوجان معتدلة ثابتة وفي نفس الموقف لمدة لا يقل عن خمسة إطارات متتالية (10 دقيقة).
        ملاحظة: ويستند هذا المعيار على طول المبلغ عنها من الجماع، تتراوح بين 12 إلى 27 دقيقة في D. ميلانوغاستر ، والملاحظة التي كوبولاتيونس من 10 دقيقة وأكثر هي خصبة 27 ، 28 .
      4. قم بحساب عدد الثقافات لكل صف في جدول البيانات لتحديد تردد التزاوج. بدلا من ذلك، طرح وقت البدء من التجربة من وقت التزاوج الأول لكل صف كمقياس للتزاوج الكمون، أو طرح الوقت من التزاوج الأول من وقت التزاوج الثاني كمقياس للتكرار الكمون.
        1. لحساب زمن الاستجابة، تأكد منتحديد تواريخ التزاوج الأول والثاني كأيام متتالية في برنامج جداول البيانات.
      5. تحليل البيانات مع نماذج الآثار المختلطة، على افتراض التوزيع الطبيعي للبيانات، بما في ذلك تاريخ التجربة كعامل عشوائي، وذلك باستخدام برنامج إحصائي (انظر جدول المواد) لتحديد الدلالة الإحصائية للمتغيرات المستقلة - الوسط الغذائي، نوع الهواء، والتفاعل - كما هو موضح سابقا 5 .
      6. حدد أفضل نموذج شرح عن طريق تنفيذ القضاء الوراء للمتغيرات المستقلة غير الهامة باستخدام اختبارات نسبة احتمال السجل والمعلومات أكيك المرتبطة بها. بعد تشغيل النموذج، فحص بصريا بقايا البيانات لتأكيد الحياة الطبيعية. تأكد من تجانس الفروق باستخدام اختبار ليفين. في حالة التجانس غير المتكافئ، تحويل جذر مربع البيانات.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

باستخدام هذا الفحص المستمر، السلوك التزاوج، وتزاوج التزاوج في محددة، يمكن تحديدها في ظل الظروف البيئية التجريبية. للسيطرة على الظروف البيئية، قمنا بتحويل مجلس الوزراء المطبخ الفولاذ المقاوم للصدأ في منطقة الاختبار، مع مصدر الضوء الخاصة بها ونشرها، مما يضمن وفرة عالية من الضوء وكمية الحد الأدنى من وهج من أعلى الساحات التزاوج ( الشكل 1A ) . منطقة الاختبار الداخلي مغطاة تماما من الفولاذ المقاوم للصدأ والزجاج، والذي يسمح للتنظيف مع الم...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول فحص لاختبار السلوك التزاوج أكثر من 24 ساعة في حين تسيطر باستمرار على الإشارات البيئية التي يفترض أن زوجين التزاوج لاستخدامها لتحديد تردد التزاوج. فمن الممكن لزيادة تردد التزاوج ردا على الهواء الخميرة تسليمها من خلال نظام الهواء المضغوط عندما يحتوي المتوسطة الخميرة كذلك ( الشكل 2B ). بالإضافة إلى ذلك، يمكن ملاحظة استجابة مماثلة في تردد التزاوج مع المتوسطة الغذائية مبسطة تحتوي فقط أجار، الببتون، ورائحة حمض الخليك مباشرة في المتوسطة ( الشكل...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفين ليس لديهم مصالح المتنافسة للكشف.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر مركز الأسهم بلومينغتون ذبابة الفاكهة للأسهم ذبابة. C. غهر، جت ألكيما، و S. فان هاسلت لمحاولتهم المبكرة في تطوير مقايسة الهواء المضغوط؛ جاسبر بوسمان للحصول على المشورة بشأن زراعة الخميرة. و ريززا أزانشي وجويل ليفين لتطوير أصلا رصد الفاصل الزمني للسلوك التزاوج ذبابة الفاكهة . تم دعم جا غورتر من قبل مدرسة أبحاث علم الأعصاب بن / نو برنامج الدراسات العليا. وأيد هذا العمل جزئيا من قبل المنظمة الهولندية للبحث العلمي (نو) (المرجع: 821.02.020) إلى جس بيليتر.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
خزانة مطبخ <قوية> خزانة < / قوية >
من الفولاذ المقاومHorecaworld7412.0105
مصابيح LED بيضاءلاكي لايتll-583wc2c-001أبيض بارد ، 20 مللي أمبير و 2 فولت
أحمر مصابيحLED Lucky Ligtll-583vc2c-v1-4daالطول الموجي بين 625 نانومتر و 20 مللي أمبير و 6 فولت
المقاومالملكي أومCFR0W4J0561A50560 أوم ، 0.25 واط ، 250 فولت و 5٪ تسامح
تطبيق عداد إضاءة الهاتف الذكيباتريك جوديتشيليلايت / لوكس متر مجاني ، الإصدار 1.1.1
مؤقت الطاقةAlectoTS-121
أقواسزاوية حادة 5 × 5 مم ،  2 × 5450 و 1 × 1100 مم
لوح1190 × 545 × 5 مم
ورق ترشيح صفائحمرشحات LEE220White Frost
مروحة صغيرةNanoxia صمت عميق426028529282880 مم مروحة كمبيوتر فائقة الهدوء ، 1200 دورة في الدقيقة
مروحة كبيرةNanoxia صمت عميق4260285292910مروحة كمبيوتر فائقة الهدوء 120 مم ، كاميرا كاميرا ويب 650-1500 دورة في الدقيقة
Logitech950270B910 HD WEBCAM OEM ، الزاوية: 78 درجة ، الدقة: 5 ملايين بكسل & nbsp ؛  
برنامج الكاميراDeskShareSecurity monitor
proNameCompanyCatalog NumberComments
Fly reraising
Fly ReraisingBottles Flystuff32-1306oz ذبابة الفاكهة مخزون زجاجة
FlypadFlystuff59-114
ذبابCanton-S
قوارير تربيةالذباب دومينيك دوتشر789008ذبابة الفاكهة أنابيب ضيقة 25x95 مم
حاضنةسانيوMIR-154
لوحة تسخين مغناطيسيةهايدولف505-20000-00MR Hei-Standard
AgarCaldic المكونات BV010001.26.0
الجلوكوزGezond& wel1019155سكر العنب / Druivensuiker
السكروزفان جيلسسكر محبب
دقيق الذرةFlystuff62-100
جنين القمحGezond & 1017683
دقيق الصوياFlystuff62-115
دبسFlystuff62-117
الخميرة الجافة النشطةRed Star
TegoseptFlystuff20-258100٪
بيبتون (باكتو)BD211677
حمض الخليكMerck1000631000الجليدي ، 100٪
صغيرة petridishGreiner bio-one62710235 × 10 مم مع فتحات التهوية
فيلم البارافينBemis NAParafilm
NameCompanyCatalog NumberComments
Yeast وإعداد الهواء المضغوط
بيتريديش كبيرGosselinBP140-01140 × 20.6 مم
ماء عالي النقاءMillipore corporationMiliQ
مستخلص الخميرةBD212750
أجار (نقي)د.ب214530باكتو
جلوكوز (0 (+) - جلوكوز مونوهيدرات)   ؛Merck18270000004
قبعات مفتوحةSchott29 240 28 GL45
سيليكون الحاجزVWR548-0662
تركيبات الحاجز الشائكةNalgene6149-0002
الأنابيبالكبيرة: الخارجي 1.2 سم والداخلي 0.9 سم
الأنابيبالصغيرة: الخارجي 0.8 سم والداخلي 0.5 سم
15 مل أنبوبFalcon
Aquarium مضخةSera الدقةسيرا هواء 110 بلس ، تيار متردد 220-240 فولت ، 50/60 هرتز ، 3 واط وضغط >100 ملي بار
فحم نشطSuperfishA8040400نوريت الكربون المنشط
وحدة تصفية يمكن التخلصماصات Whatman10462100
المصليةVWR612-1600
حقنةBD Plastipak300013
غراء ساخنباتكس
مرشح حقنةWhatmanFP 30 / حجم المسام 0.45 مم CA-S
Name< / strong>Company Catalog NumberComments
Analysis
Statistics softwareRlme4 package
للصدأ معدنية زجاجي بلوري من النوع البري السكر قطر البلاستيكية أقطار البلاستيكية منها package

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hileman, S. M., Pierroz, D. D., Flier, J. S. Leptin nutrition, and reproduction: timing is everything. J. Clin. Endocrinol. Metab. 85 (2), 804-807 (2000).
  2. Grosjean, Y., et al. An olfactory receptor for food-derived odours promotes male courtship in Drosophila. Nature. 478 (7368), 236-240 (2011).
  3. Harshman, L. G., Hoffman, A. A., Prout, T. Environmental effects on remating in Drosophila melanogaster. Evolution. 42 (2), 312-321 (1988).
  4. Fricke, C., Bretman, A., Chapman, T. Female nutritional status determines the magnitude and sign of responses to a male ejaculate signal in Drosophila melanogaster. J. Evol. Biol. 23 (1), 157-165 (2010).
  5. Gorter, J. A., Jagadeesh, S., Gahr, C., Boonekamp, J. J., Levine, J. D., Billeter, J. -C. The nutritional and hedonic value of food modulate sexual receptivity in Drosophila melanogaster females. Sci. Rep. , 1-10 (2016).
  6. Wigby, S., et al. Insulin signalling regulates remating in female Drosophila. Proc. Biol. Sci. 278 (1704), 424-431 (2011).
  7. Ribeiro, C. The dilemmas of the gourmet fly: the molecular and neuronal mechanisms of feeding and nutrient decision making in Drosophila. Front. Neurosci. 7, 1-13 (2013).
  8. Walker, S. J., Corrales-Carvajal, V. M., Ribeiro, C. Postmating circuitry modulates salt taste processing to increase reproductive output in Drosophila. Curr. Biol. 25 (20), 2621-2630 (2015).
  9. Hussain, A., Üçpunar, H. K., Zhang, M., Loschek, L. F., Grunwald Kadow, I. C. Neuropeptides modulate female chemosensory processing upon mating in Drosophila. PLoS Biol. 14 (5), e1002455-e1002428 (2016).
  10. Avila, F. W., Sirot, L. K., LaFlamme, B. A., Rubinstein, C. D., Wolfner, M. F. Insect seminal fluid proteins: identification and function. Annu. Rev. Entomol. 56 (1), 21-40 (2011).
  11. Laturney, M., Billeter, J. C. Neurogenetics of female reproductive behaviors in Drosophila melanogaster. BS:ADGEN. 85, Elsevier. 1-108 (2014).
  12. Liu, H., Kubli, E. Sex-peptide is the molecular basis of the sperm effect in Drosophila melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 100 (17), 9929-9933 (2003).
  13. Ram, K. R., Wolfner, M. F. Sustained post-mating response in Drosophila melanogaster requires multiple seminal fluid Proteins. PLoS gen. 3 (12), 2428-2438 (2007).
  14. Yapici, N., Kim, Y. -J., Ribeiro, C., Dickson, B. J. A receptor that mediates the post-mating switch in Drosophila reproductive behaviour. Nature. 451 (7174), 33-37 (2008).
  15. Yang, C. -H., et al. Control of the postmating behavioral switch in Drosophila females by internal sensory neurons. Neuron. 61 (4), 519-526 (2009).
  16. Häsemeyer, M., Yapici, N., Heberlein, U., Dickson, B. J. Sensory neurons in the Drosophila genital tract regulate female reproductive behavior. Neuron. 61 (4), 511-518 (2009).
  17. Rezával, C., Pavlou, H. J., Dornan, A. J., Chan, Y. -B., Kravitz, E. A., Goodwin, S. F. Neural circuitry underlying Drosophila female postmating behavioral responses. Curr. Biol. , 1-11 (2012).
  18. Haussmann, I. U., Hemani, Y., Wijesekera, T., Dauwalder, B., Soller, M. Multiple pathways mediate the sex-peptide-regulated switch in female Drosophila reproductive behaviours. Proc. Biol. Sci. 280 (1771), 20131938-20131938 (2015).
  19. Krupp, J. J., et al. Social experience modifies pheromone expression and mating behavior in male Drosophila melanogaster. Curr. Biol. 18 (18), 1373-1383 (2008).
  20. Billeter, J. C., Jagadeesh, S., Stepek, N., Azanchi, R., Levine, J. D. Drosophila melanogaster females change mating behaviour and offspring production based on social context. Proc. Biol.l Sci. 279 (1737), 2417-2425 (2012).
  21. Krupp, J. J., Billeter, J. -C., Wong, A., Choi, C., Nitabach, M. N., Levine, J. D. Pigment-dispersing factor modulates pheromone production in clock cells that influence mating in Drosophila. Neuron. 79 (1), 54-68 (2013).
  22. Imhof, M., Harr, B., Brem, G., Schlötterer, C. Multiple mating in wild Drosophila melanogaster revisited by microsatellite analysis. Mol. Ecol. , 915-917 (1998).
  23. Ochando, M. D., Reyes, A., Ayala, F. J. Multiple paternity in two natural populations (orchard and vineyard) of Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 93 (21), 11769-11773 (1996).
  24. Becher, P. G., et al. Yeast, not fruit volatiles mediate Drosophila melanogaster attraction, oviposition and development. Func. Ecol. 26 (4), 822-828 (2012).
  25. Montell, C. Drosophila visual transduction. Trends Neurosci. 35 (6), 356-363 (2012).
  26. Ejima, A., Griffith, L. C. Assay for courtship suppression in Drosophila. Cold Spring Harbor Prot. 2011 (2), 5575(2011).
  27. Crickmore, M. A., Vosshall, L. B. Opposing Dopaminergic and GABAergic Neurons Control the Duration and Persistence of Copulation in Drosophila. Cell. 155 (4), 881-893 (2013).
  28. Bretman, A., Fricke, C., Chapman, T. Plastic responses of male Drosophila melanogaster to the level of sperm competition increase male reproductive fitness. Proc. Biol. Sci. 276 (1662), 1705-1711 (2009).
  29. Dukas, R., Jongsma, K. Costs to females and benefits to males from forced copulations in fruit flies. Anim. Behav. 84 (5), 1177-1182 (2012).
  30. Yorozu, S., et al. Distinct sensory representations of wind and near-field sound in the Drosophila brain. Nature. 457 (7235), 201-205 (2009).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Drosophila Mating BehaviorEnvironmental CuesReproductive BehaviorsBehavioral AssayFood Medium PreparationChemosensory SystemsMating FrequencyPressurized Air SystemVolatile CompoundsFemale Receptivity

Related Articles