مقالة منهجية

ريويرينغ الخلايا العصبية: طريقة جديدة للتوسع نيوريت سريع والوظيفي اتصال الخلايا العصبية

DOI:

10.3791/55697

⸱

يونيو 13, 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physics, McGill University, 2Department of Neurology and Neurosurgery, Montreal Neurological Institute, 3Ananda Devices

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا الإجراء كيفية البدء بسرعة، وتوسيع وربط نيوريتس نظمت في غرف ميكروفلويديك باستخدام حبات بولي-D- يسين المغلفة ثابتة إلى ميكروبيبيتس أن دليل استطالة النوريت.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

إصابات الدماغ والحبل الشوكي قد تؤدي إلى العجز الدائم والموت لأنه لا يزال غير ممكن لتجديد الخلايا العصبية على مسافات طويلة وإعادة توصيلها بدقة مع الهدف المناسب. هنا يتم وصف الإجراء لبدء بسرعة، استطالة، وعلى وجه التحديد ربط الدوائر العصبية وظيفية جديدة على مسافات طويلة. معدلات التمدد التي تحققت تصل إلى أكثر من 1.2 ملم / ساعة، 30-60 مرات أسرع من معدلات الجسم الحي من الأسرع محاور الأسرع نموا من الجهاز العصبي المحيطي (0.02 إلى 0.04 ملم / ساعة) 28 و 10 مرات أسرع مما سبق ذكره لنفس نوع الخلايا العصبية في مرحلة مبكرة من التنمية 4 . أولا، تزرع مجموعات معزولة من الخلايا العصبية الحصين الفئران لمدة 2-3 أسابيع في الأجهزة ميكروفلويديك لوضع بدقة الخلايا، مما يتيح سهولة ميكرومانيبولاتيون والتكاثر التجريبية. المقبل، يتم وضع الخرز المغلفة مع بولي- D- يسين (بدل) على نيوريتس لتشكيل لاصق كونتوتستخدم ميكروومانيبولاتيون ماصة لنقل الناتج حبة نيوريت معقدة. كما يتم نقل حبة، فإنه يسحب نيوريت جديدة التي يمكن أن تمتد على مئات من ميكرومتر ومتصل وظيفيا إلى خلية الهدف في أقل من 1 ساعة. هذه العملية تمكن استنساخ التجريبية وسهولة التلاعب في حين تجاوز الاستراتيجيات الكيميائية أبطأ للحث على نمو العصبية. تظهر القياسات الأولية المعروضة هنا معدل نمو الخلايا العصبية تتجاوز بكثير تلك الفسيولوجية. الجمع بين هذه الابتكارات يسمح للإنشاء الدقيق للشبكات العصبية في الثقافة مع درجة غير مسبوقة من السيطرة. بل هو طريقة جديدة تفتح الباب أمام مجموعة كبيرة من المعلومات والأفكار في نقل الإشارات والاتصالات داخل الشبكة العصبية وكذلك كونها ملعبا فيها لاستكشاف حدود نمو الخلايا العصبية. التطبيقات والتجارب المحتملة على نطاق واسع مع آثار مباشرة على العلاجات التي تهدف إلى إعادة ربط نيورونال الدوائر بعد الصدمة أو في الأمراض العصبية التنكسية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الإصابات في الجهاز العصبي المركزي الكبار (نس) قد يؤدي إلى إعاقة دائمة بسبب آليات متعددة تحد من نمو محور عصبي 1 . بعد الإصابة، العديد من المحاور العصبية الجهاز العصبي المركزي لا تشكل مخروط نمو جديد وتفشل في جبل استجابة التجدد فعالة 2 . وعلاوة على ذلك، والضرر والأنسجة ندبة المحيطة الآفات الجهاز العصبي المركزي تمنع بشكل كبير نمو محور عصبي 1 ، 2 ، 3 . وقد ركزت العلاجات الحالية لتعزيز الجهاز العصبي المركزي تجديد بعد الإصابة على تعزيز إمكانات النمو الجوهري للخلايا العصبية المصابة وإخفاء مثبطات تمديد محور عصبي المرتبطة الحطام المايلين والندبة الدبقية 1 ، 3 . على الرغم من هذا، والقدرة على تجديد محاور عصبية طويلة إلى أهداف بعيدة وتشكيل نقاط الاشتباك العصبي الوظيفية المناسبة لا تزال محدودة للغاية 4 ، 5 ، 6 ، 7 .

في العمل الحالي، وتستخدم ميكروبادس، ميكرومانيبولاتيون ماصة، وأجهزة ميكروفلويديك لبدء بسرعة، واستطالة، وعلى وجه التحديد ربط الدوائر العصبية وظيفية جديدة على مسافات طويلة. وقد أظهرت الأعمال السابقة أن الخرز بولي-D- يسين المغلفة (بدل الخرز) للحث على التصاق الغشاء تليها تجميع المجمعات الحويصلة متشابك وتشكيل بوتونسابتيك بوريسينابتيك وظيفية 8 . وقد تبين أيضا أنه عندما يتم سحب PDL- حبة ميكانيكيا بعيدا بعد التمايز بريسينابتيك، وتتبع كتلة البروتين متشابك حبة، الشروع في نيوريت جديد 9 . الإجراء التالي يستغل هذه الحقيقة جنبا إلى جنب مع القدرة على ثقافة الخلايا العصبية قرن آمون الجنينية من الفئران في المناطق المنظمة على ساترة باستخدام بوليديميثيلزيلوكسان (بدمس) الأجهزة ميكروفلويديك على وجه التحديد جدد أسلاك العصبيةدائرة كهربائية.

هذه الأجهزة ميكروفلويديك بدمس غير سامة، شفافة بصريا وتتكون من غرفتين متصلة بواسطة نظام ميكروشانلز. مرة واحدة تجميعها على ساترة، كل جهاز بمثابة قالب لتوجيه نمو الخلايا العصبية والحفاظ على الثقافات العصبية صحية على أنماط دقيقة لمدة أطول من 4 أسابيع في المختبر .

هنا، يتم عرض الإطار الذي للتحقيق في حدود التمديد والوظائف من نيوريت جديدة. يتم إنشاء نيوريتس جديدة وظيفية ووضعها على كونترولابيلي (إعادة) شبكات الأسلاك العصبية. معدلات التمديد التي تحققت هي أسرع من 20 ميكرون / دقيقة على مسافات ملليمتر ملليمتر والتوصيلات الوظيفية. هذه النتائج تظهر، بشكل غير متوقع، أن القدرة الذاتية لهذه نيوريتس لاستطالة هو أسرع بكثير مما كان يعتقد سابقا. ويتجاوز هذا النهج الميكانيكي المقترح استراتيجيات كيميائية بطيئة ويتيح الاتصال المراقب لهدف محدد. ثهو تقنية يفتح آفاقا جديدة للدراسة في المختبر من العلاجات الجديدة لاستعادة اتصال الخلايا العصبية بعد الإصابة. كما أنه يتيح التلاعب وإعادة ربط شبكات الخلايا العصبية للتحقيق في الجوانب الأساسية لمعالجة الإشارات العصبية وظيفة الخلايا العصبية في المختبر .

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تمت الموافقة على جميع الإجراءات المفصلة أدناه من قبل لجنة رعاية الحيوان التابعة لجامعة ماكجيل وتتوافق مع المبادئ التوجيهية للمجلس الكندي لرعاية الحيوان.

1. توحيد الثقافات العصبية باستخدام أجهزة ميكروفلويديك: الجمعية الجهاز

  1. حدد جهاز ميكروفلويديك مناسبة لتجربة المطلوبة. لربط الخلايا العصبية داخل نفس السكان، واستخدام الأجهزة العصبية ( الشكل 1 ) ولربط الخلايا العصبية في مختلف السكان استخدام الأجهزة الثقافة المشتركة ( الشكل 6 ).
  2. تنظيف وإعداد العدد المطلوب من كوفرسليبس العقيمة أو أطباق أسفل الزجاج. للحصول على أفضل النتائج على الأسطح البلاستيكية استخدام أطباق 35 ملم، على استخدام الزجاج 25 مم كوفرسليبس، أو 35 ملم أطباق القاع الزجاج. حدد سمك الزجاج على أساس نظام التصوير، على سبيل المثال 0.15 ملم.
  3. معطف الأطباق أو كوفرسليبس مع 0.5-1 مل من 100 ميكروغرام / مل بدل لمدة 2 ساعة أو بين عشية وضحاها في غرفة المزاجature.
    ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا واستئنافه في اليوم التالي إذا رغبت في ذلك. فورثيمور، يمكن أن تكون مغلفة الأطباق مع بورات العازلة المخفف بدل، بولي L- يسين (بل)، لامينين أو أي خلية أخرى التصاق الخلية.
  4. غسل الأطباق مرتين بالماء (لا تستخدم الفوسفات مخزنة المالحة (بس) كما بلورات الملح قد تمنع القنوات)، وإزالة كل السائل والسماح لها تجف في بيئة معقمة مثل مجلس الوزراء السلامة البيولوجية لمدة 5-10 دقيقة أو حتى والسطح هو جاف تماما.
    ملاحظة: كن حذرا للتأكد من أن كوفرسليبس جافة تماما، حيث أن أي السائل المتبقية سوف تتداخل مع الالتزام من أنظمة ميكروفلويديك.
  5. وضع الأجهزة ميكروفلويديك مع أنماط مواجهة تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية في بيئة معقمة (مجلس الوزراء السلامة الأحيائية) لمدة 10 دقيقة. تأكد من اتباع إجراءات معقمة عند العمل في مجلس الوزراء السلامة الأحيائية 10 .
  6. باستخدام ملاقط وضع جهاز ميكروفلويديك مع نمط تواجه أسفل في اتصال مع كوفرسل نظيفةالملكية الفكرية / الطبق. استخدام ملاقط للضغط بهدوء الجهاز بحيث تلتزم الزجاج.
    ملاحظة: شفافية المنطقة الملتصقة سوف تكون مرئية عند النظر ضد الضوء. تأكد من أن جميع الزوايا تتصل بالزجاج. القيام بذلك لجميع الأجهزة ميكروفلويديك. انظر الشكل 1 أ .
  7. لملء الجهاز السكاني واحد مع المتوسطة، وأشر ماصة نحو القنوات وإضافة 50 ميكرولتر من وسط خلية كاملة تستكمل مع خالية من المصل B-27 (حجم نسبة 1:50) و 500 ميكروغرام / مل البنسلين / الستربتومايسين / الجلوتامين (مجتمعة ودعا نبم) إلى بئر العلوي الأيمن، ومن ثم إضافة 50 ميكرولتر آخر إلى الكذب جيدا قطريا لذلك. القيام بذلك لجميع الأجهزة، والتأكد من أن التدفقات المتوسطة بين الآبار. بعد ذلك، إضافة 50 ميكرولتر من المتوسطة إلى الآبار 2 المتبقية. انظر الشكل 2 أ .
    1. لملء الجهاز السكاني متعددة مع المتوسطة، نقطة ماصة نحو القنوات وإضافة 30 ميكرولترمن نبم كاملة إلى الآبار الصحيحة، راجع الشكل 6A . القيام بذلك لجميع الأجهزة، والتأكد من أن التدفقات المتوسطة بين الآبار. بعد ذلك، إضافة 50 ميكرولتر من المتوسطة إلى الآبار 4 المتبقية.
  8. وضع الأجهزة في لوحة أكبر مع طبق مفتوح مع الماء المعقم (غرفة الرطب) ووضعها في الحاضنة (37 درجة مئوية، 5٪ كو 2 و 95٪ الرطوبة) لمدة 1-2 ساعة أثناء إعداد ثقافة الخلية. انظر الشكل 2 ب .

2. الطلاء الخلايا العصبية في أنظمة ميكروفلويديك

  1. بعد البروتوكول المبين في المرجع. 8 ، والحصول على فصل الحصين أو الخلايا العصبية القشرية من سبراغ داولي الأجنة الجرذان (إما الجنس).
  2. ريسوسبيند الخلايا العصبية الجنينية في نبم في تركيز 1-2 مليون الخلايا العصبية / مل. التحقق من تركيزات الخلية في المجهر باستخدام عدادة الكريات وبعد الإشارة 8 . ضبط تركيز الخلية أكوردينg إلى كثافة الخلية المطلوبة. لزيادة فرص الحصول على محاور عصبية الحصين واحدة لكل قناة، لوحة 10،000 الخلايا العصبية لكل جهاز. لديك محاور متعددة في نفس القناة، لوحة 60،000 الخلايا العصبية لكل جهاز.
    ملاحظة: هذه الأرقام تختلف وفقا لنوع الخلايا العصبية المستخدمة.
  3. إزالة المتوسطة من الأجهزة ميكروفلويديك دون تفريغ الآبار. ترك ما يقرب من 5 ميكرولتر في كل منهما.
  4. لخلايا لوحة في الجهاز السكان واحد، إضافة 50 ميكرولتر من نبم إلى أسفل الصحيح بشكل صحيح. عند هذه النقطة التدفقات المتوسطة في حد ذاته لملء بقية أقل. إضافة 20 ميكرولتر من محلول الخلية التركيز في أعلى يمين الجهاز ميكروفلويديك، كما هو مبين في الشكل 1B .
    1. لخلايا لوحة في جهاز السكان متعددة إضافة 20 ميكرولتر من محلول الخلية التركيز في كل من الآبار الصحيحة في الشكل 6A .
  5. تحقق في المجهر إذا الخلاياهي داخل الغرف ووضع الأجهزة في الحاضنة لمدة 15-30 دقيقة لتعزيز مرفق الخلية إلى الركيزة.
  6. تحقق في المجهر إذا كان هناك ما يكفي من الخلايا في الغرف. إذا كان هناك حاجة إلى المزيد، كرر الخطوتين 2.4 و 2.5.
  7. إضافة 50 ميكرولتر من نبم إلى آبار 2 العلوي من الجهاز السكاني واحد و 20 ميكرولتر من نبم في نفس جيدا كما تم حقن الخلايا في الجهاز السكاني متعددة. وسائل الإعلام يبرز قليلا لتشكيل الهلالة إيجابية إعطاء الآبار على الجانب الكعك العلوي. ومرة أخرى، انظر الشكل 2 أ .
  8. الحفاظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية، 5٪ كو 2 و 95٪ الرطوبة.

3. الحفاظ على الثقافات العصبية

  1. إزالة نبم (ما يقرب من 30 ميكرولتر مع ماصة) من الخلايا وتطبيق جديد نبم قبل تحسنت في اليوم التالي إدخالها إلى الأجهزة (وهذا هو 1 د بعد الخطوة 2).
  2. تحقق كل يومين إذا كان هناك ما يكفي من المتوسطة في كل قناة. إذا كان الكعك رالمرجع منخفض فقط إضافة المزيد من المتوسطة إلى الآبار العليا.
  3. خلايا الثقافة لا يقل عن 7 د قبل إزالة الأجهزة ميكروفلويديك. يمكن للخلايا البقاء على قيد الحياة في هذه الأجهزة لعدة أسابيع. إزالة الأجهزة 1-2 أيام قبل إجراء التجارب على العينات.

4. إزالة الأجهزة ميكروفلويديك

  1. 1 - 2 د قبل إزالة الأجهزة ميكروفلويديك، إضافة 2 مل من نبم بريوارمد إلى 37 درجة مئوية إلى كل طبق عينة، غمر الغرف، والحفاظ على الأجهزة في الحاضنة.
  2. استخدام ملاقط معقمة و طرف واحد لإزالة الأجهزة ميكروفلويديك من كوفرسليبس ترك تكوين نمط من الخلايا العصبية. استخدام غيض لعقد ساترة في مكان وملاقط لمشبك حافة الجهاز في الزاوية اليسرى السفلى من البئر. تطبيق دقيق التواء، ورفع الجهاز مع ملاقط بحيث تقشر قبالة ساترة. انظر الشكل 2c - 2d .
  3. كل 2-3 أيام، واستبدال هالف نبم حتى يتم استخدام العينة للتجارب.
  4. قبل إجراء تجارب تجديد الأسلاك على العينة، تحقق من أن نيوريتس في قنوات الجهاز السكان واحد والسكان السكان العصبية في الجهاز السكاني متعددة يتم عزلها من خلال فحص الفجوات بينهما في المجهر لضمان عدم وجود خيوط تربط السكان العصبية.

5. إعداد بدل المغلفة الخرز

  1. إضافة 2 × 50 قطرات ميكرولتر إما 4 أو 10 أو 20 ميكرون الخرز البوليسترين المخفف في الماء (1: 500) إلى 1 مل من بدل (100 ميكروغرام / مل). ترك لمدة 2 ساعة على الأقل في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا واستئنافه في اليوم التالي.
  2. أجهزة الطرد المركزي الحل في 8،820 x ج لمدة 1 دقيقة. إزالة بعناية طاف دون إزعاج الخرز المتراكمة في الجزء السفلي من الحاوية.
  3. غسل الخرز مرتين مع 1 مل من العقيمة 10 ملي هيبيس الرقم الهيدروجيني 8.4 الحل.
  4. ريسوسبيند الخرز بدل المغلفة في 200 مل من 10 ملي هيبيس درجة الحموضة 8.4حل.

6. إعداد ميكروبيبيتس

  1. إعداد ماصات من أنابيب زجاجية الشعرية (1 مم القطر الداخلي، 1.5 مم القطر الخارجي) باستخدام مجتذب القطب الأفقي. ضبط الإعدادات حتى الطرف الخارجي من ميكروبيبيت سحبت هو ~ 2-5 ميكرون. قبل سحب، ضمان أنابيب الزجاج نظيفة.
  2. إصلاح الماصات إلى الشرائح الزجاجية للتخزين، وضمان أن طرف لا الاتصال سطح الشريحة كما غيض هش. تخزينها في درجة حرارة الغرفة في حاوية مغطاة للحماية من الغبار. استخدام الماصات في نفس اليوم يتم سحبها.

7. بدل-حبة التصاق الخلايا العصبية

  1. إضافة 40-60 ميكرولتر من الخرز المغلفة بدل أعدت في الخطوة 5 إلى ثقافة الخلية أعدت في الخطوة 4. مركز طرف ماصة على الخلايا العصبية، والتي هي مرئية بضعف على ساترة، وإضافة الخرز (انظر الشكل 3 ).
  2. عودة العينة إلى حاضنة لمدة 1 ساعة لتعزيز تشكيل سياتصالات نابتيك 8 ، 9 .
  3. بعد الحضانة، وإزالة أي الخرز غير الملتصقة عن طريق غسل بلطف الثقافة مع نبم قبل تحسنت.

8. إعداد حل محلول الفسيولوجية (للتجارب درجة حرارة الغرفة)

  1. إعداد محلول ملحي الفسيولوجية من خلال الجمع بين المكونات المدرجة في المراجع 7 ، 8 . هذا هو لتنظيم بيئة الخلية خارج الحاضنة.
  2. تحقق من الأسمولية ودرجة الحموضة كما هو مبين في المراجع 7 ، 8 .
  3. يبث محلول باستمرار مع O 2 لتقليل تقلبات الرقم الهيدروجيني أثناء إجراء التجارب.
  4. الحرارة إلى درجة حرارة الغرفة.
  5. إعداد نظام نضح عن طريق إدراج نهاية واحدة من أنبوب بلاستيكي (أبعاد اختياري) في O 2 -Invisused حل الفسيولوجية وتحديد ه آخرند إلى إبرة إدراجها في صاحب العينة. وضع الأنابيب والحل أعلى من العينة (انظر الشكل 4 ).
    1. قطع الأنبوب من الإبرة وتوصيله إلى حقنة. استخدام حقنة لممارسة الضغط ورسم السائل، وملء الأنبوب. ختم مع المشبك الأسطوانة وإعادة توصيل الإبرة.

9. حبة ميكرومانيبولاتيون

  1. تثبيت عينة في التجريبي انشاء بحيث الخلايا يمكن الوصول إليها من قبل اثنين من ميكروبيبيتس شنت في ميكرومانيبولاتورس والوصول إليها بصريا أدناه، على سبيل المثال مع الهدف 40X مرحلة (فتحة عددية من 0.6) من المجهر الضوئي مقلوب. في هذا التكوين، جبل كاميرا كسد لالتقاط الصور على المنفذ الجانبي للمجهر. ربط كل ماصة إلى 1 مل المحاقن عبر أنابيب بلاستيكية. في هذه الخطوة، استبدال نبم مع محلول ملحي الفسيولوجية (1-2 مل) (انظر الشكل 4 ).
  2. أثناء التجربة، يروي باستمرار الخلايا مع محلول ملحي الفسيولوجية أعدت في الخطوة 8 بمعدل 0.5-1 مل / دقيقة.
  3. حدد PDL- حبة لا تعلق على الخلايا العصبية في مجال الرؤية. محاذاة حبة مع طرف ميكروبيبيت من خلال التركيز على حبة ثم تصل إلى ميكروبيبيت. جلب طرف أسفل أقرب ما يمكن إلى حبة من خلال رصد ذلك من خلال المجهر.
  4. تطبيق الضغط السلبي مع حقنة 1 مل متصلة ماصة لالتقاط حبة. الحفاظ على الضغط السلبي طوال التجربة.

10. سحب نيوريتس

  1. حدد PDL- حبة تعلق على الخلايا العصبية في مجال الرؤية وإرفاقه إلى ميكروبيبيت الثاني باستخدام الشفط كما هو موضح في الخطوات 9.3-9.4.
  2. سحب بدل-حبة-الخلايا العصبية المعقدة عن طريق ببطء (~ 0.5 ميكرون / دقيقة) تتحرك إما ميكرومانيبولاتور أو مرحلة العينة التي كتبها 1 ميكرون وقفة لمدة 5 دقائق للسماح بدء نيوريت.
  3. كرر الخطوة 10.2 مرتين.
    ملاحظة: أول 3 &# 181؛ م يجب أن يتم سحبها ببطء شديد لضمان النجاح التجريبي، والذي يحدث أكثر من 95٪ من الوقت.
  4. سحب بدل-حبة-الخلايا العصبية المعقدة ببطء (~ 0.5 ميكرون / دقيقة) تتحرك إما ميكرومانيبولاتور أو مرحلة العينة من قبل 2 ميكرون وقفة لمدة 5 دقائق للسماح استطالة نيوريت.
  5. بعد بدء ناجحة وتمديد نيوريت لأول 5 ميكرون، وسحب النوريت في 20 ميكرون / دقيقة على مسافات على نطاق ملليمتر.
    ملاحظة: سحب يمكن أن يؤديها بشكل مستمر أو في خطوات وبأسعار متفاوتة. انظر الشكل 5 ب -5 ج .

11. ربط الخلايا العصبية

  1. حدد منطقة غنية في نيوريتس وانخفاض مجمع بدل-بيد-نيوريت بحيث يتصل به جسديا. استخدام الخرز الأخرى لقياس ارتفاع طرف فوق سطح ساترة. انظر الشكل 5 د .
  2. ترك بدل-حبة-نيوريت مجمع في اتصال مع نيوريت الهدف في حين التلاعب ميكروب الثانيpette. خفض ماصة الثانية مع بدل الثاني حبة على رأس نيوريت شكلت حديثا حوالي 20 ميكرون تشكل حبة الأولى. استخدام بدل-حبة الثاني لدفع خيوط نيوريت جديدة نحو الخلية المستهدفة.
  3. عقد كل من الخرز في مكان لمدة 1 ساعة على الأقل. التحقق من عدم وجود تورم التنسيق، سماكة من نيوريتس الاتصال حبة، مع المجهر 16 .
  4. خلال هذا الوقت، استخدم نضح لتغيير ببطء وسط العينة من المالحة الفسيولوجية إلى ما قبل تحسنت، كو 2 -Eilibibrated نبم.
  5. الافراج عن حبة من ماصة الثانية عن طريق الإفراج عن شفط. إذا تبقى العصبية الجديدة المرفقة، الافراج عن حبة الأولى كذلك. انظر الشكل 5 ه .
  6. إزالة بلطف محلول ملحي واستبدالها مع نبم (~ 2 مل).
  7. وضع بعناية العينة مرة أخرى في الحاضنة لتعزيز اتصال الخلايا العصبية للتجارب المستقبلية. هذا الاتصال مستقرة لمدة> 24 ساعة 7 .

12. التحقق من وظيفة الاتصال الجديد عن طريق تسجيلات المشبك التصحيح المشترك خلية كاملة

  1. اتبع المراجع 7 ، 18 ، 19 . لتجميع الفيزيولوجيا الكهربية.
  2. اتبع المراجع 7 . لإعداد الأقطاب الكهربائية قبل والمشبكي.
  3. جمع البيانات المشبك التصحيح، مرة أخرى بعد مراجع 18 ، 19 .
  4. قارن النتائج بإشارات طبيعية 7 لتحديد نوع الاتصال.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم استزراع الخلايا العصبية الحصين الجرثومة الجنينية في الأجهزة ميكروفلويديك لتمكين تحديد المواقع بدقة من الخلايا، بدل-الخرز و ميكرومانيبولاتورس. الخطوة الأولى هي لتجميع صحيح الجهاز ميكروفلويديك على ساترة الزجاج أو الطبق. فمن الضروري أن يكون الجهاز ميكروفلويديك تعلق جيدا إلى الركيزة لتجنب الخلايا الخروج من الغرف والتحرك تحت أجزاء من الجهاز الذي ينبغي أن تكون مختومة ( الشكل 1A ). للحفاظ على ثقافات صحية لعدة أسابيع، فمن ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

باستخدام ميكرومانيبولاتيون القياسية والأجهزة ميكروفلويديك مبتكرة، تم تطوير تقنية جديدة للبدء بسرعة، استطالة ودقة ربط جديد الدوائر العصبية وظيفية جديدة على مسافات كبيرة. ميكرومانيبولاتيون ماصة هو أداة مشتركة في معظم مختبرات علم الأعصاب 4 ، 13 . وكان التحدي الحقيقي لتحقيق نتائج استنساخه وموثوق بها وتوحيد الثقافات العصبية صحية، وتحديدا على وجه التحديد لمدة التجربة (والتي يمكن أن تكون على مر الزمن من أسابيع) من خلال تطوير أجهز...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلف مارغريت H ماغديسيان هو الرئيس التنفيذي لشركة أناندا الأجهزة التي تنتج الأدوات المستخدمة في هذه المادة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نود أن نشكر يواشي مياهارا للعديد من المناقشات المفيدة والرؤى. ما و بغ تعترف بتمويل من نسيرك.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أجهزة الاستزراع المشتركAnanda Devicesمتوفرة تجاريا في http://www.anandadevices.com
أجهزة NeuroAnanda Devicesمتوفرة تجاريا في http://www.anandadevices.com
1 غطاء زجاجي 25 مم RoundWarner Instruments64-0705
35 مم أطباق قاع زجاجي # 0 ، غير مطلية ، مشعة جاماMatTex IncorporationP35G-0-20-C
35 مم ، غير بيروجينيك ، معقمCorning Inc430165
95 مم × 15 مم طبق بتري ، غطاء قابل للانزلاق ، بوليسترينفيشربراندمعقم FB0875714G
50 مل أنابيب طرد مركزي مع تخرج مطبوع وأغطية مسطحةVWR89039-656
15 مل أنبوب مخروطي من مادة البولي بروبيلين ، نمط 17 × 120 مم ، غير بيروجيني ،صقر معقم352097
تقنيات العمر المتوسط العصبي21103-049خارج الخلية
B-27 مكمل غذائي (50X) ،مكمل B-27 الخالي من المصل (50X) ، محلول 17504044خارج الخلية
الخالي من المصل Pennicilin ، Streptomyocin، GlutamineThermo Fisher Scientific   ؛11995-065محلول خارج الخلية
200 مو ؛ L PipettorsVWR89079-458
2 - 20 & L Pipettorsأطراف مقاومة للهباءالجوي 2149P
BD Falcon 3 مل ماصات نقل [غير معقمة]BD Falcon357524
جلوكوزجيبكو15023-021محلول خارج الخلية
HEPESSigma7365-45-9محلول خارج الخلية / حبات
NaClSigma-Aldrich7647-14-5محلول
خارج الخليةKClSigma-Aldrich7447-40-7محلول خارج الخلية
CaCl2< / sub>Sigma-Aldrich10043-52-4محلول خارج الخلية
MgCl2< / sub>Sigma-Aldrich7786-30-3محلول خارج الخلية
# 5 ملاقط Dumont Dumostar 11 سمأدوات الدقةالعالمية 500233
أدوات التشريحبراون ، Aesculap
Poly-D-lysine HydrobromideSigma-AldrichP6407
جزيئات دقيقة تعتمد على البوليسترين ، 10 & mu ؛ مسيجما ألدريتش72986
أنابيب البورسليكات KingPrecision Glass، Inc.14696-2
أدوات مجتذب الماصة الأفقيةBrown-Flaming P-97
Micromanipulators ، PCS-5000Series SD InstrumentsMC7600R
1 مل حقنةBD Luer-Lok309628
مجهر مقلوبأوليمبوس & nbsp ؛IX71
ObjectiveOlympusUIS2 ، LUCPLFLN 40X
CCD CameraPhotometricsCascade II: 512
Leibovitz's (1x) L-15Medium LifeTechnologies 11415-064Rat Dissect
Typsin-EDTA (0.05٪) ، Phenol redLife Technologies25300054تشريح
الفئرانDMEM (1x) وسط النسر المعدل من Dulbecco [+ 4.5 جم / لتر D-Glucose ، + L-Glutamine ، + 110 مجم / لتر بيروفات الصوديوم]Life Technologies11995-065الفئران
HBSS (1x) محلول الملح المتوازن من هانك [- كلوريد الكالسيوم ، - كلوريد المغنيسيوم ، - كبريتات المغنيسيوم]Technologies14170-112الفئران
رقم طبق ثقافة الخلايا محلول تشريح Life تشريح

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chew, D. J., Fawcett, J. W., Andrews, M. R. The challenges of long-distance axon regeneration in the injured CNS. Prog. Brain. Res. 201, 253-294 (2012).
  2. Bradke, F., Fawcett, J. W., Spira, M. E. Assembly of a new growth cone after axotomy: the precursor to axon regeneration. Nat. Rev. Neurosci. 13 (4), 189-193 (2012).
  3. Aguayo, A. J., et al. Synaptic connections made by axons regenerating in the central nervous system of adult mammals. J. Exp. Biol. 153, 199-224 (1990).
  4. Lamoureux, P., Ruthel, G., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. Mechanical tension can specify axonal fate in hippocampal neurons. J Cell Biol. 159 (3), 499-508 (2002).
  5. Goslin, K., Banker, G. Experimental observations on the development of polarity by hippocampal neurons in culture. J Cell Biol. 108 (4), 1507-1516 (1989).
  6. Dotti, C. G., Sullivan, C. A., Banker, G. A. The Establishment of polarity by hippocampal neurons in culture. J. Neurosci. 8 (4), 1454-1468 (1988).
  7. Magdesian, M. H., et al. Rapid mechanically controlled rewiring of neuronal circuits. J. Neurosci. 36 (3), 979-987 (2016).
  8. Lucido, A. L., et al. Rapid assembly of functional presynaptic boutons triggered by adhesive contacts. J. Neurosci. 29 (40), 12449-12466 (2009).
  9. Suarez, F., Thostrup, P., Colman, D., Grutter, P. Dynamics of presynaptic protein recruitment induced by local presentation of artificial adhesive contacts. Dev. Neurobiol. 73, 1123-1133 (2013).
  10. General Laboratory Techniques. An Introduction to Working in the Hood. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. https://www.jove.com/science-education/5036/an-introduction-to-working-in-the-hood (2016).
  11. Strober, W. Monitoring cell growth. Curr Protoc Immunol. A-3A, (2001).
  12. Beaudoin, G. M. 3rd, et al. Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex. Nat. Protoc. 7 (9), 1741-1754 (2012).
  13. Bray, D. Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension. Dev. Biol. 102, 379-389 (1984).
  14. Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. Axonal outgrowth of cultured neurons is not limited by growth cone competition. J. Cell Sci. 111, 3245-3252 (1998).
  15. Pfister, B. J., Bonislawski, D. P., Smith, D. H., Cohen, A. S. Sketch-grown axons retain the ability to transmit active electrical signals. FEBS Lett. 580, 3525-3531 (2006).
  16. Magdesian, M. H., et al. Atomic force microscopy reveals important differences in axonal resistance to injury. Biophys. J. 103 (3), 405-414 (2012).
  17. Polleux, F., Snider, W. Initiating and growing an axon. CSH Persp. Biol. 2 (4), 001925(2010).
  18. Debanne, D., et al. Paired-recordings from synaptically coupled corticol and hippocampal neurons in acute and cultured brain slices. Nat. Protoc. 3, 1559-1568 (2008).
  19. Qi, G., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings. J. Vis. Exp. (95), e52358(2015).
  20. Harrison, R. G. On the origin and development of the nervous system studied by the methods of experimental embryology. Proc. R. Soc. Lond. B. , 155-196 (1935).
  21. Weiss, P. Nerve patterns: the mechanics of nerve growth. Growth 5 (Suppl. Third Growth Symposium). , 153-203 (1941).
  22. Gray, C., et al. Rapid neural growth: calcitonin gene-related peptide and substance P-containing nerves attain exceptional growth rates in regenerating deer antler. Neurosci. 50 (4), 953-963 (1992).
  23. Heidemann, S. R., Bray, D. Tension-driven axon assembly: a possible mechanism. Front. Cell Neurosci. 9, (2015).
  24. Bray, D. Axonal growth in response to experimentally applied tension. Dev. Biol. 102, 379-389 (1984).
  25. Heidemann, S. R., Buxbaum, R. E. Mechanical tension as a regulator of axonal development. Neurotoxicology. 15, 95-107 (1994).
  26. Heidemann, S. R., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E. Cytomechanics of axonal development. Cell Biochem. Biophys. 27 (3), 135-155 (1995).
  27. Pfister, B. J., Iwata, A., Meaney, D. F., Smith, D. H. Extreme stretch growth of integrated axons. J. Neurosci. 24 (36), 7978-7983 (2004).
  28. Waxman, S. G., Kocsis, J. D. The axon: structure, function and pathophysiology. , Oxford University Press, USA. (1995).
  29. Cho, E. Y., So, K. F. Rate of regrowth of damaged retinal ganglion cell axons regenerating in a peripheral nerve graft in adult hamsters. Brain Res. 419, 369-374 (1987).
  30. Davies, A. M. Intrinsic differences in the growth rate of early nerve fibres related to target distance. Nature. 337, 553-555 (1989).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

PDL

مقالات ذات صلة