يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تشوندروسيتيس التفريق من الخلايا الجذعية المحفزة المستحثة البشرية المستحثة من الدم

8.5K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/55722

⸱

يوليو 18, 2017

 ,  ,  , 
1Department of Orthopedics, Beijing Chao-Yang Hospital, Capital Medical University, 2Key Laboratory of Genomic and Precision Medicine, Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences, 3Clinical and Translational Research Center of Shanghai First Maternity & Infant Hospital, School of Life Sciences and Technology, Tongji University

في هذه المقالة

إشعار تصحيح

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

ملخص

نحن نقدم بروتوكول لتوليد النسب غضروفية من الدم المحيطي البشري (ي) عن طريق الخلايا الجذعية المحفزة المستحثة (إيبسس) باستخدام طريقة خالية من التكامل، والتي تشمل تشكيل الجنين (إب)، توسيع الخلايا الليفية، وتحريض غضروفية.

الملخص

في هذه الدراسة، استخدمنا خلايا الدم المحيطي (بك) كخلايا أولية لإنتاج غضروفية عن طريق الخلايا الجذعية المحفزة (إيبسس) المستحثة بطريقة خالية من التكامل. بعد تشكيل الجنين (إب) وتشكيل الخلايا الليفية الخلية، هي التي يسببها إيبسس لتمايز غضروفي لمدة 21 يوما تحت ظروف خالية من المصل وخالية من شينو. بعد تحريض غضروفية، يتم تقييم المظاهر من الخلايا من خلال التحولات المورفولوجية، المناعية، والكيمياء الحيوية، وكذلك من خلال الوقت الكمي في الوقت الحقيقي فحص ير من علامات التمايز غضروفي. الكريات تشوندروجيك تظهر الأزرق أسيان إيجابي والتلوين الأزرق تلطيخ. المناعية من الكولاجين الثاني و X تلطيخ هو أيضا إيجابية. محتوى غليكوسامينوغليكان كبريتات (سغاغ) و علامات التمايز غضروفي كولاجن 2 ( COL2 )، كولاجين 10 ( COL10 )، SOX9 ، أغريغكان هي أوبريغولاتد بشكل كبير في تشوندالكريات روجينيك مقارنة هبسس والخلايا الليفية. وتشير هذه النتائج إلى أن بك يمكن استخدامها كخلايا البذور لتوليد إيبسس لإصلاح الغضاريف، وهو المريض محددة وفعالة من حيث التكلفة.

المقدمة

الأنسجة الغضروف لديه قدرة ضعيفة جدا لإصلاح الذاتي وتجديد. وتستخدم التدخلات الجراحية المختلفة والعلاجات البيولوجية لاستعادة الغضروف والوظيفة المشتركة، مع نتائج غير مرضية. التطور الأخير لتكنولوجيا الخلايا الجذعية قد تغير كامل مجال إصلاح الغضروف 1 . وقد تم دراسة الخلايا الجذعية المختلفة كخلايا البذور، ولكن الخلايا الجذعية المحفزة البشرية (هيبسس) يبدو أن الخيار الواعد، لأنها يمكن أن توفر أنواع كثيرة من خلايا المريض محددة دون التسبب في ردود الفعل الرفض 2 . وعلاوة على ذلك، فإنها يمكن التغلب على الطبيعة التكاثري محدود من خلايا الكبار والحفاظ على قدراتهم الذاتية التجديد والقدرات متعددة القدرات. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام استهداف الجينات لتغيير النمط الوراثي للحصول على أنواع محددة من غضروفية.

وقد استخدمت الخلايا الليفية على نطاق واسع لتوليد إيبسس لأن إمكانات إعادة البرمجة الخاصة بهم كما تم دراستها جيدا.ومع ذلك، لا تزال هناك بعض القيود التي يجب التغلب عليها، مثل خزعة مؤلمة من المرضى والحاجة إلى التوسع في المختبر من الخلايا الليفية، والتي قد تؤدي إلى طفرات الجينات 3 . وفي الآونة الأخيرة، تبين أن لجان البرنامج والميزانية مفيدة لإعادة البرمجة 4 ؛ وعلاوة على ذلك، كانت تستخدم عادة وتخزينها بشكل واف. فمن الممكن أنها قد إعادة توجيه التركيز الدراسة من الجلد. ومع ذلك، على حد علمنا، وهناك عدد قليل من التقارير عن إعادة برمجة بك تليها التمايز إلى غضروفية.

في الدراسة الحالية، ونحن نستخدم بك كمصدر بديل عن طريق إعادة برمجة لهم في إيبسس ومن ثم التفريق إيبسس في النسب غضروفية من خلال نظام الاستزراع بيليه من أجل محاكاة تشكيل غضروفية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

بروتوكول لتوليد هيبسس من لجان مكافحة الإرهاب يمكن العثور عليها في دراستنا السابقة 5 . تمت الموافقة على الدراسة من قبل مجلس المراجعة المؤسسية لمؤسستنا.

1. تشكيل الجنين (إب) تشكيل

  1. جعل 50 مل من هيبسك المتوسطة: خروج المغلوب دولبيكو تعديل النسر المتوسطة (دمم) تستكمل مع 15٪ استبدال المصل المغلوب (كسر)، 5٪ مصل بقري الجنين (فبس)، 1 × الأحماض الأمينية غير الضرورية، 55 ميكرومتر 2 ميركابتويثانول، 2 ملي لتر -جلوتامين، و 8 نانوغرام / مل عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية (بفغف).
  2. جعل 50 ملوف إب تشكيل المتوسطة: دمم تستكمل مع 15٪ كسر، 5٪ فبس، 1X الأحماض الأمينية غير الضرورية، 55 ميكرومتر 2-ميركابتويثانول، و 2 ملي الجلوتامين.
  3. جعل 50 مل من مستنبت القاعدية المتوسطة: دمم تستكمل مع 20٪ فبس، 1 × الأحماض الأمينية غير الضرورية، 55 ميكرومتر 2-ميركابتويثانول، و 2 ملي L- الجلوتامين.
  4. إعداد 10 مل من محلول ديسباس، 1 ملغ / مل في خروج دموك خروج المغلوب.
  5. Cultuإعادة هيبسس على 60 ملم الأنسجة ثقافة الأنسجة مع الخلايا المغذية ( أي أحادي الطبقة من الخلايا المشعة الماوس الخلايا الجنينية الجنينية). عندما تكون الخلايا 80-90٪ متموجة، تنأى الخلايا مع ديسباس والمرور هيبسس 1: 3 كل 4-5 أيام. وضع الخلايا في 37 درجة مئوية و 5٪ كو 2 حاضنة.
  6. تشريح المستعمرات هيبسك غير متمايزة إلى قطع أصغر (حوالي 50-100 ميكرون في القطر) باستخدام إبرة الزجاج التي تجرها النار عندما إيبسس 80-90٪ متموجة. عموما، استخدام مستعمرات هيبسك في طبق 60 ملم لتوليد إبس في طبق بتري 100 ملم.
    1. ثقافة أقل من 100 قطعة صغيرة من المستعمرات في 100 ملم، غير ملتصق طبق بتري تحتوي على 10 مل من إب تشكيل المتوسطة. وضع الأطباق في 37 درجة مئوية و 5٪ كو 2 حاضنة.
  7. استبدال حوالي 25٪ من الوسط الأولي مع كمية متساوية من وسط الثقافة القاعدية كل يومين. إمالة الطبق للسماح إبس تسوية. إزالة بعناية 3 ملمن الوسط العلوي وإضافة 4 مل من وسط الاستزراع القاعدية الطازجة. لا تزعج إبس.
    ملاحظة: وتتميز إبس شكليا من قبل القطع من المستعمرات، مع الأخذ على ظهور جولة مع حدود ناعمة تحت المجهر.
  8. بعد 10 يوما من الثقافة في طبق بيتري غير ملتصقة، معطف 100 ملم جديدة طبق الثقافة الأنسجة مع 4 مل من 0.1٪ الجيلاتين لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.
  9. نقل المتوسطة زائد إبس من 100 ملم، طبق غير ملتصق بتري إلى أنبوب مخروطي 15 مل. السماح للرواسب إبس لمدة 4-5 دقائق. نضح طاف بعناية وترك أقل من 0.5 مل من المتوسطة زائد إبس
  10. البذور أقل من 100 إبس على 100 ملم، طبق الثقافة الأنسجة المغلفة الجيلاتين مع 10 مل من وسط الثقافة القاعدية. وضع الأطباق في 37 درجة مئوية و 5٪ كو 2 حاضنة.

2. تشكيل خلية بيليه و تشوندروسيت التمايز

  1. جعل 10 مل من 0.25٪ التربسين / إثيلينديامينيتتراسيتيك حمض (إدتا). جعل 80 مل من بسوسط الثقافة: دمم تستكمل مع 20٪ فبس، 1X الأحماض الأمينية غير الضرورية، 55 ميكرومتر 2-ميركابتويثانول، و 2 ملي L- الجلوتامين.
  2. جعل 10 مل من وسط التمايز غضروفي: دمم (الجلوكوز عالية) تستكمل مع 10٪ الانسولين-ترانسفرين-السيلينيوم حل (إيتس)، 0.1 ميكرومتر ديكساميثازون، 1 ملي حمض الاسكوربيك، 1٪ البيروفات الصوديوم، و 10 نانوغرام / مل تحويل عامل النمو- بيتا 1 (تغف-β1).
  3. تحديث المتوسطة مع 10 مل من مستنبت القاعدية المتوسطة بعد 48 ساعة. بعد ذلك، تحديث وسط كل ثلاثة أيام مع 10 مل من وسط الثقافة القاعدية.
    ملاحظة: بعد 10 يوما في الثقافة، وينبغي أن توسع الخلايا الليفية الليفية من إبس.
    1. معطف أطباق 100 ملم مع 4 مل من 0.1٪ الجيلاتين لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية قبل الاستخدام. تجاهل طاف الخلية وغسل الخلايا مع دولبيكو الفوسفات مخزنة المالحة (دبس) مرة واحدة.
    2. هضم الخلايا مع 3 مل من التربسين 0.25٪ / إدتا عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وتحييد مع 4 ملتر من وسط الثقافة القاعدية.
  4. فصل الخلايا في خلايا واحدة عن طريق بيبتينغ صعودا وهبوطا 5-10 مرات وتمريرها من خلال شبكة النايلون 70 ميكرون. أجهزة الطرد المركزي تعليق خلية في 200 x ج لمدة 5 دقائق. إعادة البذور الخلايا على 100 ملم جديدة، طبق الثقافة الأنسجة المغلفة الجيلاتين مع 10 مل من وسط الثقافة القاعدية.
  5. تحديث المتوسطة مع 10 مل من مستنبت القاعدية المتوسطة بعد 48 ساعة. بعد ذلك، تحديث وسط كل ثلاثة أيام مع 10 مل من وسط الثقافة القاعدية.
    ملاحظة: الخلايا الحصول على متجانسة، الليفية تشبه التشكل.
  6. عندما يتم التوصل ~ 90-100٪ التقاء ( أي حوالي 5-7 أيام)، وحصاد الخلايا مع 3 مل من التربسين 0.25٪ / إدتا عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. تحييد مع 4 مل من وسط الثقافة القاعدية. فصل الخلايا في خلايا واحدة عن طريق بيبتينغ صعودا وهبوطا 5 مرات. استخدام عدادة الكريات لحساب عدد الخلايا.
    1. ضع 3 × 10 5 خلايا في أنبوب البولي بروبلين 15 مل. أجهزة الطرد المركزي في 200 x جلمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (رت). إعادة تعليق الخلايا في 1 مل من التمايز غضروفية المتوسطة.
  7. إعادة الطرد المركزي الخلايا في 300 x ج لمدة 3 دقائق والحفاظ على الخلايا في شكل بيليه صغيرة. وضع أنبوب في 37 درجة مئوية و 5٪ كو 2 حاضنة لمدة 21 يوما. ال تقم برغي الغطاء بإحكام، والسماح بتبادل الغاز.
  8. استبدال 3/4 من الوسط الثقافي كل ثلاثة أيام مع المتوسطة التمايز غضروفية جديدة.
    ملاحظة: بعد 21 يوما في الثقافة، هيبسك الكريات تشوندروجينيك (هيبسك-تشون) يجب أن تكون قد شكلت. يتم جمع الخلايا الجذعية الوسيطة الإنسان (مسس)، كما السيطرة الإيجابية، وتربيتها في وسط التمايز غضروفية لمدة 21 يوما لتشكيل الكريات تشوندروجيك (همسك-تشون).

3. تحليل التمايز تشوندروجينيك

  1. إعداد 10 مل من 10٪ محايد الفورمالين مخزنة.
  2. إعداد 50 مل من 0.1٪ الكسيان الأزرق الكاشف و 50 مل من 1٪ الكاشف الأزرق تولويدين.
  3. العلاقات العامةإبار 1 مل من الأجسام المضادة الأولية: الأجسام المضادة الأرنب بولكلونل ضد الكولاجين الثاني (1:50) أو الأجسام المضادة وحيدة النسيلة الماوس ضد الكولاجين X (1:50). أيضا، وإعداد المضادة للأرنب أو الماوس الأجسام المضادة الثانوية.
  4. جعل 1 مل من محلول غراء: 10 U / مل في برنامج تلفزيوني مع 0.1 M خلات الصوديوم، 2.4 ملي إدتا، و 5 ملي L- السيستين.
  5. جعل 100 مل ثنائي ميثيل ميثيلين الأزرق (دمب) حل صبغ: 100 ميكرولتر من 16 ملغ / لتر 1،9-ثنائي ميثيل ميثيلين الأزرق، 40 ملي جليكاين، 40 ملي كلوريد الصوديوم، و 9.5 ملي حمض الهيدروكلوريك. الرقم الهيدروجيني 3.0.
  6. تقييم التمايز غضروفية من قبل ألسيان الأزرق والبقع الزرقاء التولويدين من أقسام بيليه.
    1. إصلاح واحد هيبك-تشون بيليه أو همسك-تشون بيليه في 1 مل من 10٪ محايد الفورمالين مخزنة لمدة 24 ساعة.
    2. نقل بيليه إلى 1 مل من الإيثانول 70٪ في H 2 O. يذوى بيليه مع 1 مل من سلسلة الايثانول متدرج ( أي 25، 50، 75، 90، 95، 100، و 100٪، 3 دقائق لكل منهما).
    3. توضيح بيليه في 1 مل من 100٪ زيلين ثلاث مرات. Infiltratه بيليه مع البارافين لمدة 1 ساعة في فرن 65 درجة مئوية. تضمين بيليه في كتل البارافين مع 7 × 7 × 5 مم 3 العفن الأساسي، بعد الإجراءات النسيجية الروتينية 6 .
    4. جعل الأقسام المجاورة بواسطة مشراح مع سمك ما يقرب من 4 ميكرون 7 . التمسك المقاطع على الشرائح الزجاجية.
    5. تجفيف الشرائح لمدة 2 ساعة عند 60 درجة مئوية في الفرن. ديبارافينيز المقاطع في ثلاث دورات (3 دقائق لكل منهما) باستخدام 100٪ زيلين.
    6. استخدام سلسلة الكحول المتناقص للإماهة ( أي 100، 100، 95، 95، 70، 50، و 25٪ في H 2 O، 3 دقيقة لكل منهما) ومن ثم إجراء شطف النهائي مع الماء منزوع الأيونات لمدة 5 دقائق.
    7. وصمة عار المقاطع مع الكاشف الأزرق أسيان 0.1٪ أو 1٪ تلوين الأزرق تلطيخ لمدة 4-5 ح ثم شطف لهم بالماء المقطر.
    8. يذوى مع سلسلة الايثانول متدرج ( أي 25، 50، 75، 90، 95، 100، و 100٪، 3 دقائق لكل منهما) تليها ثلاثة متتالية ستإبس من التوضيح في 100٪ زيلين. جبل الشرائح وتصور لهم تحت المجهر.
  7. أداء المناعية.
    ملاحظة: يتم تقييم مزيد من أقسام بيليه إضافية من قبل المناعية.
    1. بعد ديبارافينيزاتيون والإماهة، وجلب الشرائح ليغلي في 1 ملي إدتا، ودرجة الحموضة 8.0 (ماء في الماء المغلي من قبل الأوتوكلاف). السماح لهم الجلوس لمدة 8 دقائق في درجة حرارة الغليان ثم السماح للشرائح لتبرد في رت.
    2. شطف الشرائح مع الماء منزوع الأيونات 3 مرات. احتضان الأقسام في 3٪ H 2 O 2 الحل في الميثانول في رت لمدة 15 دقيقة لمنع النشاط البيروكسيداز الذاتية.
    3. شطف الشرائح مع الماء منزوع الأيونات وتزجها في دبس لمدة 5 دقائق. تطبيق 50-100 ميكرولتر من المخفف بشكل مناسب (1:50) الأجسام المضادة الأولية للأقسام على الشرائح ومن ثم احتضان لهم في غرفة ترطيب في رت لمدة 1 ساعة.
    4. غسل الشرائح 3 مرات (5 دقائق لكل منهما) مع دبس. احتضان ساينضج مع الأجسام المضادة الثانوية المقابلة ( أي مكافحة الأرنب أو الماوس) لمدة 15 دقيقة في رت.
    5. غسل الشرائح 3 مرات (لمدة 5 دقائق لكل منهما) مع دبس. أداء الكشف داب تحت المجهر.
    6. غسل الشرائح مع دبس 3 مرات (2 دقيقة لكل منهما). كونتيرستين النوى الخلية عن طريق غمر الشرائح في الهيماتوكسيلين لمدة 1-2 دقيقة. يذوى مع سلسلة الايثانول متدرج (25، 50، 75، 90، 95، 100، و 100٪، 3 دقائق لكل منهما) تليها ثلاث خطوات متتالية من التوضيح مع الزيلين. أخيرا، جبل الشرائح وتصور لهم تحت المجهر.
  8. اكتشاف محتوى سغاغ.
    1. هضم كريات تشوندروجينيك في حل غراء في 60 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
    2. تحديد محتوى الحمض النووي باستخدام عدة فحص دسدنا ونظام الفلورومتر. قياس محتوى سغاغ عن طريق مزجها مع دمب حل صبغ تحت قياس الامتصاصية في 525 نانومتر 8 .
    3. حساب تركيز سغاغ ضد منحنى القياسيةسمك القرش شوندروتن كبريتات.
  9. إجراء تحليل ير في الوقت الحقيقي من علامات التمايز غضروفية في الكريات هيبسك-تشون.
    1. حصاد 3-4 من الكريات تشوندروجينيك بإضافة 500 ميكرولتر من كاشف استخراج الجليد الباردة إلى أنبوب واحد. دوامة تماما. احتضان عينة لمدة 5 دقائق في رت.
    2. إضافة 0.1 مل من الكلوروفورم. دوامة العينة لمدة 15 ثانية واحتضان ذلك في رت لمدة 3 دقائق. الطرد المركزي العينة لمدة 15 دقيقة في 12000 x ج و 4 درجة مئوية. نقل المرحلة المائية العليا (حوالي 250 ميكرولتر) إلى أنبوب ميكروسنتريفوج 1.5 مل جديد.
    3. إضافة 25 ميكرولتر من خلات الصوديوم و 1 ميكرولتر من الجليكوجين إلى العينة. يعجل الحمض النووي الريبي عن طريق مزجها مع 250 ميكرولتر من الكحول الآيزوبروبيل. تخلط جيدا. احتضان العينة في رت لمدة 10 دقيقة.
    4. أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 12000 x ج و 4 درجة مئوية. إزالة طاف تماما. غسل بيليه رنا مرتين مع 500 ميكرولتر من الايثانول 75٪.
    5. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائقفي 7500 x ج و 4 درجة مئوية. إزالة كل الإيثانول بقايا والهواء الجاف بيليه رنا لمدة 5-10 دقيقة. حل الحمض النووي الريبي في 10 ميكرولتر من نوكليس خالية من المياه.
    6. تحويل الحمض النووي الريبي إلى [كدنا] باستخدام نظام النسخ العكسي. موضوع عينات [كدنا] في الوقت الحقيقي ير باستخدام قر عدة مزيج الرئيسي (2X) ونظام الوقت الحقيقي ير 9 .
      ملاحظة: تسلسل التمهيدي هي:
      (ح) أغريكان -F: تغاغاغغغك؛
      h أغريكان -R: تغاغتاغتغتاغاغا؛
      h β-أكتين -F: تغاتغاتغاكتكتكسك؛
      h β-أكتين -R: غتكتكاغتاغتاغتاغك؛
      h COL2 -F: تغغاتكاغغاسك؛
      h COL2 -R: غتكغاتغتكتكاتكت؛
      h SOX9 -F: أغغاسكاكاتكاغاك؛
      h SOX9 -R: كتغاتغكتغتغ؛
      h COL10 -F: أتغككاكاتاككت؛
      h COL10 -R: غتاغتغكتتكتكت.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تشوندروجينيك التمايز من هيبسس:

تم استخدام وسط تشكيل إب ووسط الثقافة القاعدية للتمييز بين هيبس في النسب الوسيطة. تم استخدام طريقة ثقافة متعددة الخطوات ( الشكل 1 ). أولا، كانت متباينة هبسك عفوية عن طريق تشكيل إب لمدة 10 يوما (D10؛ الشكل 2A ). ثانيا، انسحبت الخلايا من إبس لمدة 10 أيام أخرى (D10 ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

هنا، ونحن نقدم بروتوكول لتوليد غضروفية من بك عبر إيبسس. لأن بك هي أكثر شيوعا وتستخدم على نطاق واسع في المجال السريري، فهي تعرض كبديل محتمل لإعادة البرمجة. في هذه الدراسة، تم استخدام ناقلات عرضية (إيف) لإعادة برمجة بك في إيبسس، وفقا للطريقة التي وضعتها تشانغ وآخرون. 11 - هذا النهج الخالي من التكامل لا ينطوي على دمج الجينات المرتبطة بالفيروس، والذي يعتقد أن يكون لها تأثير واسع في المجال السريري 12 ،

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

ويود المؤلفون أن يشكروا زياوبين تشانغ على البلازميد. كما نشكر شاورونغ قاو وكيانفي وانغ على مساعدتهم الكريمة خلال التجربة. ويدعم هذه الدراسة من قبل مؤسسة العلوم الطبيعية الوطنية في الصين (No.81101346، 81271963، 81100331)، ومشروع بكين 215 المواهب رفيعة المستوى (No.2014-3-025)، وصندوق بكين تشاو يانغ مستشفى (لا (سيكس-2017-01)، وجمعية تشجيع الابتكار الشبابية للأكاديمية الصينية للعلوم (يل).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Knockout DMEMInvitrogen10829018الوسط القاعدي المستخدم في ثقافة hiPSC ووسط تكوين EB
استبدال مصل الضربة القاضية (KSR)Invitrogen10828028مكمل متوسط أكثر تحديدا وخالي من FBS يستخدم لثقافة hiPSC ووسط تكوين EB
مصل بقري الجنين (FBS)Hyclonesh30070.03يستخدم لثقافة hiPSC ووسط تكوين EB ، ويوفر قيمة ممتازة للخلية ثقافة
الأحماض الأمينية غير الأساسيةChemiconTMS-001-Cيستخدم كمكمل للنمو في جميع وسائط زراعة الخلايا ، لزيادة نمو الخلايا وقابليتها للبقاء
L-glutamineInvitrogenTMS-002-Cحمض أميني مطلوب لزراعة الخلايا
نمو الخلايا الليفي الأساسي (bFGF)Peprotech100-18BA cytokin المستخدم للحفاظ على تعدد القدرات والتجديد الذاتي ل hiPSCs
DispaseInvitrogen 17105041يستخدم لتفكك hiPSC للزراعة الفرعية
DMEMGibcoC11960الوسط القاعدي المستخدم لوسط ثقافة MSC
0.1٪ جيلاتينMilliporeES-006-Bيستخدم لربط الخلايا بالأطباق
0.25٪ تريبسين / EDTAGibco25200072يستخدم لتفكك الخلايا
DPBSGibco 14190250محلول ملح متوازن يستخدم لغسل الخلايا أو كاشف تحضير
2-mercaptoethanolinvitrogen21985023يستخدم كمكمل للنمو في جميع وسائط زراعة الخلايا.
ITSinvitrogen41400045الأنسولين ، ترانسفيرين ، محلول السيلينيوم ، يستخدم للتمايز الغضروف.
حمض الأسكوربيكسيجما4403المعروف باسم فيتامين سي. يساعد في النمو النشط وله خاصية مضادة للأكسدة.
بيروفات الصوديومجيبكو11360070يضاف إلى وسط زراعة الخلايا كمصدر للطاقة بالإضافة إلى الجلوكوز.
تحويل عامل النمو بيتا 1بيبروتكAF-100-21Cالسيتوكين الذي ينظم تكاثر الخلايا ونموها وتمايزها الغضروفية.
الأجسام المضادة متعددة النسيلة للأرانب ضد الكولاجين IIAbcamab34712يتفاعل هذا الجسم المضاد مع الكولاجين من النوع الثاني ، وهو خاص بالأنسجة الغضروفية.
الأجسام المضادة أحادية النسيلة للفأر للكولاجين XAbcamab49945يتفاعل هذا الجسم المضاد مع الكولاجين من النوع X ، وهو نتاج الخلايا الغضروفية المفرطة.
PermountFisher ScientificSP15-100للتركيب والتخزين طويل الأجل للشرائح
Toluidine blueSigma89640تستخدم للكشف عن البروتيوغليكانات.
ألسيان الأزرقAmresco# 0298يستخدم للكشف عن الجلوكوزامينوجليكان.
غراءسيجماP4762-25MGتستخدم لهضم الكريات الغضروفية.
ثنائي ميثيل ميثيلين الأزرقسيجما341088-1Gيستخدم لقياس الجليكوزامينوجليانس
الصوديوم كبريتات شوندروتن من غضروف سمك القرشSigmaC4384-250MGيستخدم لرسم المنحنى القياسي لقياس محتوى sGAG.
كيوبيت dsDNA HS مجموعة الفحصInvitrogenQ32851 (100)تستخدم لتحديد محتوى الحمض
النووي TRIzolInvitrogen15596018تستخدم لعزل الحمض النووي الريبي من الخلايا
نظام النسخ العكسيPromegaA3500يستخدم لتحويل الحمض النووي الريبي إلى cDNA
SYBR FAST qPCR kit Master MixKapaKK4601يستخدم في تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي
عامل ملح

المراجع

  1. Diekman, B. O., et al. Cartilage tissue engineering using differentiated and purified induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (47), 19172-19177 (2012).
  2. Park, I. H., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134 (5), 877-886 (2008).
  3. Loh, Y. H., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human blood. Blood. 113 (22), 5476-5479 (2009).
  4. Zhang, X. B. Cellular reprogramming of human peripheral blood cells. Genomics Proteomics Bioinformatics. 11 (5), 264-274 (2013).
  5. Li, Y., et al. Reprogramming of blood cells into induced pluripotent stem cells as a new cell source for cartilage repair. Stem Cell Res Ther. 7 (31), (2016).
  6. Canene-Adams, K. Preparation of formalin-fixed paraffin-embedded tissue for immunohistochemistry. Methods Enzymol. 533, 225-233 (2013).
  7. Solchaga, L. A., Penick, K. J., Welter, J. F. Chondrogenic differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells: tips and tricks. Methods Mol Biol. 698, 253-278 (2011).
  8. Oldershaw, R. A., et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells toward chondrocytes. Nat Biotechnol. 28 (11), 1187-1194 (2010).
  9. Monje, L., Varayoud, J., Luque, E. H., Ramos, J. G. Neonatal exposure to bisphenol A modifies the abundance of estrogen receptor alpha transcripts with alternative 5'-untranslated regions in the female rat preoptic area. J Endocrinol. 194 (1), 201-212 (2007).
  10. Teramura, T., et al. Induction of mesenchymal progenitor cells with chondrogenic property from mouse-induced pluripotent stem cells. Cell Reprogram. 12 (3), 249-261 (2010).
  11. Su, R. J., et al. Efficient generation of integration-free ips cells from human adult peripheral blood using BCL-XL together with Yamanaka factors. PLoS One. 8 (5), e64496(2013).
  12. Carey, B. W., et al. Reprogramming factor stoichiometry influences the epigenetic state and biological properties of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 9 (6), 588-598 (2011).
  13. Okita, K., et al. An efficient nonviral method to generate integration-free human-induced pluripotent stem cells from cord blood and peripheral blood cells. Stem Cells. 31 (3), 458-466 (2013).
  14. Staerk, J., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7 (1), 20-24 (2010).
  15. Qu, C., et al. Chondrogenic differentiation of human pluripotent stem cells in chondrocyte co-culture. Int J Biochem Cell Biol. 45 (8), 1802-1812 (2013).
  16. Guzzo, R. M., Gibson, J., Xu, R. H., Lee, F. Y., Drissi, H. Efficient differentiation of human iPSC-derived mesenchymal stem cells to chondroprogenitor cells. J Cell Biochem. 114 (2), 480-490 (2013).
  17. Koyama, N., et al. Human induced pluripotent stem cells differentiated into chondrogenic lineage via generation of mesenchymal progenitor cells. Stem Cells Dev. 22 (1), 102-113 (2013).
  18. Liu, X., et al. Role of insulin-transferrin-selenium in auricular chondrocyte proliferation and engineered cartilage formation in vitro. Int J Mol Sci. 15 (1), 1525-1537 (2014).
  19. Guzzo, R. M., Scanlon, V., Sanjay, A., Xu, R. H., Drissi, H. Establishment of human cell type-specific iPS cells with enhanced chondrogenic potential. Stem Cell Rev. 10 (6), 820-829 (2014).
  20. Goepfert, C., Slobodianski, A., Schilling, A. F., Adamietz, P., Portner, R. Cartilage engineering from mesenchymal stem cells. Adv Biochem Eng Biotechnol. 123, 163-200 (2010).
  21. Ingber, D. E., et al. Tissue engineering and developmental biology: going biomimetic. Tissue Eng. 12 (12), 3265-3283 (2006).
  22. Yoshida, Y., Yamanaka, S. Recent stem cell advances: induced pluripotent stem cells for disease modeling and stem cell-based regeneration. Circulation. 122 (1), 80-87 (2010).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

تصحيح


Formal Correction: Erratum: Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.

An erratum was issued for: Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells.

The corresponding author was updated from:

Yueying Li
yueyinglee2010@hotmail.com
Key Laboratory of Genomic and Precision Medicine, Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences

The corresponding author is now listed as:

Tie Liu
waterkins@163.com
Department of Orthopedics, Beijing Chao-Yang Hospital, Capital Medical University

الوسوم

تشوندروسيتيس التفريق من الخلايا الجذعية المحفزة المستحثة البشرية المستحثة من الدم
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.