يصف هذا البروتوكول طرق لتنقية، كوانتيتاتينغ، وتوصيف الحويصلات خارج الخلية (إيفس) / إكسوسوميس من غير ملتصقة / الوسيطة الخلايا الظهارية الثديية واستخدامها لنقل الثديية تشكيل الغدة القدرة على الخلايا الطلائية الثديية اللمعية. إيف / إكسوسوميس المستمدة من الخلايا الظهارية الثديية الجذعية يمكن نقل هذه الخاصية الخلية إلى الخلايا التي تستوعب إيفس / إكسوسوميس.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
نقل الغدة الثديية تشكيل القدرة بين الخلايا الظهارية الثديية القاعدية والخلايا اللمعية الثديية عن طريق الحويصلات خارج الخلية / إكسوسوميس
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يمكن للخلايا التواصل عبر إكسوسوميس، ~ 100 نانومتر الحويصلات خارج الخلية (إيفس) التي تحتوي على البروتينات والدهون، والأحماض النووية. غير ملتصقة / ميسينشيمال الخلايا الظهارية الثديية (ناميك) الحويصلات خارج الخلية -edived يمكن عزلها من وسط ناميك عن طريق التفريغ التفاضلي التفاضلي. استنادا إلى كثافتها، يمكن تنقية المركبات الكهربائية عن طريق التنبيذ الفائق في 110،000 x ز. يمكن فصل إعداد إيف من التنبيذ الفائق باستخدام التدرج الكثافة المستمر لمنع التلوث مع البروتينات القابلة للذوبان. ويمكن بعد ذلك تقييمها مرة أخرى إيفس تنقية باستخدام تحليل الجسيمات متناهية الصغر تتبع، والذي يقيس حجم وعدد من الحويصلات في إعداد. الحويصلات خارج الخلية مع حجم يتراوح بين 50 إلى 150 نانومتر هي إكسوسوميس. يمكن تناولها إيفس المستمدة / إكسوسوميس الخلايا الظهارية الثديية، والتي يمكن قياسها عن طريق التدفق الخلوي والمجهر متحد البؤر. بعض خصائص الخلايا الجذعية الثديية (على سبيل المثال، القدرة على تشكيل الغدة الثديية) يمكنيتم نقلها من ناميس مثل الجذعية للخلايا الظهارية الثديية عن طريق إيفس المستمدة من إيفس / إكسوسوميس. عزل إبكام مرحبا / CD49f لو الخلايا الطلائية الثديية اللمعية لا يمكن أن تشكل الغدد الثديية بعد زرعها في منصات الدهون الماوس، في حين إبكام لو / CD49f مرحبا الخلايا القاعدية الثديية القاعدية تشكل الغدد الثديية بعد زرع. امتصاص نامس المستمدة من ناميك / إكسوسوميس من قبل إبكام مرحبا / CD49f لو الخلايا الظهارية الثديية اللمعية يسمح لهم لتوليد الغدد الثديية بعد زرعها في منصات الدهون. و إيفس / إكسوسوميس المستمدة من الجذعية مثل الخلايا الظهارية الثديية نقل الثديية تشكيل الغدة القدرة على إبكام مرحبا / CD49f لو الخلايا اللمعية الظهارية الثديية.
المقدمة
إكسوسوميس يمكن أن توسط الاتصالات الخلوية عن طريق نقل الغشاء والبروتينات عصاري خلوي، والدهون، و رناز بين الخلايا 1 . وقد أثبتت الاتصالات بوساطة إكسوسوم أن تشارك في العديد من العمليات الفسيولوجية والمرضية ( أي عرض المستضد، وتطوير التسامح 2 ، وتطور الورم 3 ). إكسوسوميس غالبا ما يكون محتويات مماثلة لتلك التي من الخلايا المصدر الإفراج عنهم. وهكذا، يمكن لل إكسوسوميس تحمل خصائص خلية محددة من الخلايا المصدر ونقل هذه الخصائص إلى الخلايا التي تطعمها 4 .
إكسوسوميس هي ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
جميع البحوث التي تنطوي على الحيوانات تمتثل للبروتوكولات التي وافقت عليها اللجنة المؤسسية للرعاية الحيوانية.
1. خارج الخلية حويصلة / إكسوسوم العزلة والتحقق من الصحة
- ثقافة الثديية الخلايا القاعدية الظهارية، نامكس 4 ، مع الطازجة، المتوسطة خالية من مصل مصنوعة من 500 مل من مدب 170، ودرجة الحموضة 7.4 + 500 مل من دمم / F12 مع بيكربونات الصوديوم (0.2438٪). إغف (5 نانوغرام / مل)؛ هدروكوريتيسون (0.5 ميكروغرام / مل)؛ الأنسولين (5 ميكروغرام / مل)؛ خلاصة النخا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
منذ أن تبين أن منع ي 2 / إب 4 تشوير يطلق إيف / إكسوسوم الافراج عن الثديية مثل الخلايا الجذعية القاعدية 4 ، وهذا العمل يقدم وسيلة لعزل إيفس / إكسوسوميس الناجم عن الثديية الظهارية الخلايا القاعدية (ناميك) الثقافة. منذ نامس مثقف في وسط خالية من المصل، لا يوجد أي إيفس / إكسوسومس موجودة مسبقا المستمدة من المصل 13 . بالنسبة للخلايا المستزرعة في الوسط المحتوي على المصل، يجب أن يتم تنظيف.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
إكسوسوميس غالبا ما تحمل خصائص الخلايا التي أفرجت عنها، وكمية من إكسوسوميس الافراج عنهم يمكن أن يسببها المحفزات 4 . يمكن جمع وسط الثقافة من الخلايا وتعرض لتنبيذ فائق التفاضلية لجمع إيف / إكسوسوم ( الشكل 1 ). لا يوجد حاليا اتفاق عام على طريقة مثالية لعزل المركبات الكهربائية / إكسوسوميس. وقد تم تحديد الطريقة المثلى المستخدمة هنا بواسطة تطبيق المصب 14 . الطرد المركزي هو طريقة سريعة نسبيا لعزل إيفس / إكسوسومي.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
شكر وتقدير
وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من معاهد البحوث الصحية الوطنية (05A1-CSPP16-014، هجل) ومن وزارة العلوم والتكنولوجيا (موست 103-2320-B-400-015-MY3، هجل).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| MCDB 170 | USBiological | M2162 | |
| DMEM / F12 | Thermo | 1250062 | |
| Optima L-100K أجهزة الطرد المركزي | الفائقة بيكمان | 393253 | |
| SW28 Ti الدوار | بيكمان | 342204 | |
| SW41 الدوار | بيكمان | 331306 | |
| NANOSIGHT LM10 | Malvern | NANOSIGHT LM10 | لتحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA) |
| Optiprep | سيجما ألدريتش | D1556 | 60٪ (وزن / حجم) محلول اليوديكسانول في الماء (معقم). |
| الأجسام المضادة CD81 | GeneTex | GTX101766 | 1: 1,000 في 5٪ وزن / حجم الحليب الجاف الخالي من الدسم ، 1x TBS ، 0.1٪ Tween 20 عند 4 درجات ؛ C ، بين عشية وضحاها |
| الأجسام المضادة CD9 | GeneTex | GTX100912 | 1: 1,000 في 5٪ وزن / حجم الحليب الجاف الخالي من الدسم ، 1x TBS ، 0.1٪ Tween 20 عند 4 درجات ؛ C ، بين عشية وضحاها |
| CD63 الأجسام المضادة | Abcam | Ab59479 | 1: 1,000 في 5٪ وزن / حجم الحليب الجاف الخالي من الدسم ، 1x TBS ، 0.1٪ Tween 20 عند 4 درجات ؛ C ، بين عشية وضحاها |
| TSG101 الجسم المضاد | GeneTex | GTX118736 | 1: 1,000 في 5٪ وزن / حجم الحليب الجاف الخالي من الدسم ، 1x TBS ، 0.1٪ Tween 20 عند 4 درجات ؛ C ، بين عشية وضحاها |
| GAPDH | GeneTex | GTX100118 | 1: 6,000 في 5٪ وزن / حجم حليب جاف خالي الدسم ، 1x TBS ، 0.1٪ Tween 20 عند 4 درجات ؛ C ، بين عشية وضحاها |
| CFSE (كربوكسي فلوريسين سكسينيميديل ثنائي الأسيتات إستر) | Thermo | V12883 | |
| FACSCalibur | BD Biosciences | الخلايا الفلورية | |
| كولاجيناز النوع الرابع & nbsp ؛ | Thermo | 17104019 | |
| التربسين | Thermo | 27250018 | |
| ITS | سيجما - ألدريتش | I3146 | مزيج من الأنسولين البشري المؤتلف ، والترانسفيرين البشري ، وسيلينيت الصوديوم |
| أكووتاز | ebioscience | 00-4555-56 | خليط إنزيم طبيعي مع نشاط إنزيم محلل للبروتين وتحلل الكولاجينات |
| تباين ؛ | STEMCELL | 7913 | 5 مجم / مل = 5 U / مل |
| من الجسم المضاد ل CD49f | Biolegend | 313611 | 1:50 |
| الأجسام المضادة المضادة ل EpCAM | Biolegend | 118213 | 1:200 |
| FACSAria | BD Biosciences | فارز الخلايا | |
| القرمزي الشب | Sigma-Aldrich | C1022 | |
| الخلايا الظهارية الثديية البشرية (خلايا HMLE ، NAMECs) | هدايا من الدكتور روبرت واينبرغ | ||
| permount | Thermo Fisher Scientific | SP15-500 | |
| بيكربونات الصوديوم | Zymeset | BSB101 | |
| EGF | Peprotech | AF-100-015 | |
| Hydrocoritisone | Sigma-Aldrich | SI-H0888 | |
| الأنسولين | Sigma-Aldrich | SI-I9278 | |
| BPE (مستخلص الغدة النخامية البقري) Hammod | Cell Tech | 1078-NZ | |
| GW627368X | كايمان | 10009162 | |
| طبق ثقافة 15 سم | Falcon ؛ | 353025 | |
| جهاز طرد مركزي على الطاولة | Eppendrof | جهاز طرد مركزي 3415R | |
| أنبوب الطرد المركزي الفائق | بيكمان | 344058 | |
| PBS (محلول ملحي مخزن بالفوسفات) | Corning | 46-013-CM | |
| البروتين BCA | Thermo Fisher Scientific | 23228 | |
| الفحص المجهري الإلكتروني لنقل | هيتاشي | HT7700 | |
| الجيلاتين | STEMCELL | 7903 | |
| طبق استزراع 10 سم | Falcon | 353003 | |
| طبق ثقافة 6 آبار | Corning | 3516 | |
| أنثى C57BL / 6 فئران | NLAC (مركز | ||
| للحيوانات FBS (مصل الأبقار الجنينية) BioWest | & nbsp ؛ | S01520 | |
| gentamycin | Thermo Fisher Scientific | 15710072 | |
| القلم / البكتيريا العقدية | Corning | 30-002-Cl | |
| DNase I | 5PRIMER | 2500120 | |
| الأيزوفلوران ؛ | الهالوكربون | NPC12164-002-25 | |
| الفورمالديهايد | ماكرون | H121-08 | |
| EtOH (الإيثانول) | جي تي بيكر | 800605 | |
| حمض الخليك الجليدي | Panreac | 131008.1611 | |
| كبريتات البوتاسيوم الألومنيوم | سيجما ألدريتش | 12625 | |
| زيلين ؛ | لايكا | 3803665 | |
| 0.22 & م أغشية | Merck Millipore | Millex-GP | |
| AUTOCLIP Wound Clips ، 9 مم | BD Biosciences | 427631 | |
| AUTOCLIP Wound Clip Applier | BD Biosciences | 427630 | |
| CellMask & trade ؛ ديب ريد | ثيرمو فيشر علمي | C10046 | صبغة غشاء البلازما |
المراجع
- Simons, M., Raposo, G. Exosomes--vesicular carriers for intercellular communication. Curr Opin Cell Biol. 21 (4), 575-581 (2009).
- Théry, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat Rev Immunol. 9 (8), 581-593 (2009).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
