يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

نقل الغدة الثديية تشكيل القدرة بين الخلايا الظهارية الثديية القاعدية والخلايا اللمعية الثديية عن طريق الحويصلات خارج الخلية / إكسوسوميس

11.1K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/55736

⸱

يونيو 3, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Cellular and System Medicine, National Health Research Institutes

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول طرق لتنقية، كوانتيتاتينغ، وتوصيف الحويصلات خارج الخلية (إيفس) / إكسوسوميس من غير ملتصقة / الوسيطة الخلايا الظهارية الثديية واستخدامها لنقل الثديية تشكيل الغدة القدرة على الخلايا الطلائية الثديية اللمعية. إيف / إكسوسوميس المستمدة من الخلايا الظهارية الثديية الجذعية يمكن نقل هذه الخاصية الخلية إلى الخلايا التي تستوعب إيفس / إكسوسوميس.

الملخص

يمكن للخلايا التواصل عبر إكسوسوميس، ~ 100 نانومتر الحويصلات خارج الخلية (إيفس) التي تحتوي على البروتينات والدهون، والأحماض النووية. غير ملتصقة / ميسينشيمال الخلايا الظهارية الثديية (ناميك) الحويصلات خارج الخلية -edived يمكن عزلها من وسط ناميك عن طريق التفريغ التفاضلي التفاضلي. استنادا إلى كثافتها، يمكن تنقية المركبات الكهربائية عن طريق التنبيذ الفائق في 110،000 x ز. يمكن فصل إعداد إيف من التنبيذ الفائق باستخدام التدرج الكثافة المستمر لمنع التلوث مع البروتينات القابلة للذوبان. ويمكن بعد ذلك تقييمها مرة أخرى إيفس تنقية باستخدام تحليل الجسيمات متناهية الصغر تتبع، والذي يقيس حجم وعدد من الحويصلات في إعداد. الحويصلات خارج الخلية مع حجم يتراوح بين 50 إلى 150 نانومتر هي إكسوسوميس. يمكن تناولها إيفس المستمدة / إكسوسوميس الخلايا الظهارية الثديية، والتي يمكن قياسها عن طريق التدفق الخلوي والمجهر متحد البؤر. بعض خصائص الخلايا الجذعية الثديية (على سبيل المثال، القدرة على تشكيل الغدة الثديية) يمكنيتم نقلها من ناميس مثل الجذعية للخلايا الظهارية الثديية عن طريق إيفس المستمدة من إيفس / إكسوسوميس. عزل إبكام مرحبا / CD49f لو الخلايا الطلائية الثديية اللمعية لا يمكن أن تشكل الغدد الثديية بعد زرعها في منصات الدهون الماوس، في حين إبكام لو / CD49f مرحبا الخلايا القاعدية الثديية القاعدية تشكل الغدد الثديية بعد زرع. امتصاص نامس المستمدة من ناميك / إكسوسوميس من قبل إبكام مرحبا / CD49f لو الخلايا الظهارية الثديية اللمعية يسمح لهم لتوليد الغدد الثديية بعد زرعها في منصات الدهون. و إيفس / إكسوسوميس المستمدة من الجذعية مثل الخلايا الظهارية الثديية نقل الثديية تشكيل الغدة القدرة على إبكام مرحبا / CD49f لو الخلايا اللمعية الظهارية الثديية.

المقدمة

إكسوسوميس يمكن أن توسط الاتصالات الخلوية عن طريق نقل الغشاء والبروتينات عصاري خلوي، والدهون، و رناز بين الخلايا 1 . وقد أثبتت الاتصالات بوساطة إكسوسوم أن تشارك في العديد من العمليات الفسيولوجية والمرضية ( أي عرض المستضد، وتطوير التسامح 2 ، وتطور الورم 3 ). إكسوسوميس غالبا ما يكون محتويات مماثلة لتلك التي من الخلايا المصدر الإفراج عنهم. وهكذا، يمكن لل إكسوسوميس تحمل خصائص خلية محددة من الخلايا المصدر ونقل هذه الخصائص إلى الخلايا التي تطعمها 4 .

إكسوسوميس هي حويصلات غشاء طبقة مزدوجة من 50 إلى 150 نانومتر وتقدم علامات محددة (على سبيل المثال، CD9، CD81، CD63، HSP70، أليكس، و TSG101). وبالتالي، يجب أن تتميز إكسوسوميس بطرق مختلفة لجوانب مختلفة. يمكن استخدام المجهر الإلكتروني للإرسال لتصور الحويصلات الغشاءمثل إكسوسوميس 4 ، 5 . ويستخدم تحليل تتبع الجسيمات النانوية (نتا) وتحليل ديناميكي نثر الضوء (دلس) لقياس حجم وعدد من إكسوسوميس المنقى 4 . ويمكن التحقق من محتوى غشاء الدهون من إكسوسوميس من قبل التدرج الكثافة. علامات إكسوسومال، مثل CD9، CD81، CD63، HSP70، أليكس، و TSG101 6 ، 7 ، يمكن قياسها بواسطة النشاف الغربية.

الخلايا القاعدية الثديية لديها القدرة على توليد الغدد الثديية عند زرعها في منصات الدهون، في حين أن الخلايا اللمعية لا يمكن 8 ، 9 ، 10 . وبالتالي، الخلايا القاعدية الثديية يشار إليها أيضا وحدات إعادة الثديية. باستخدام نموذج الخلايا القاعدية والخلايا اللمعية، يمكن فحص قدرة إيف / إكسوسوميس لنقل خصائص الخلية بين السكان خلية مختلفة. هذا العمليوضح طريقة نقل القدرة تشكيل الغدة من الخلايا الظهارية القاعدية الثديية إلى الخلايا الظهارية اللمعية الثديية باستخدام إيف / إكسوسوميس المستمدة من الخلايا الظهارية القاعدية الثديية. اكتسبت الخلايا الظهارية الثديية اللمعية خصائص الخلايا القاعدية بعد ابتلاع إيفس / إكسوسوميس يفرز من الخلايا القاعدية ويمكن بعد ذلك تشكيل الغدد الثديية 4 .

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

جميع البحوث التي تنطوي على الحيوانات تمتثل للبروتوكولات التي وافقت عليها اللجنة المؤسسية للرعاية الحيوانية.

1. خارج الخلية حويصلة / إكسوسوم العزلة والتحقق من الصحة

  1. ثقافة الثديية الخلايا القاعدية الظهارية، نامكس 4 ، مع الطازجة، المتوسطة خالية من مصل مصنوعة من 500 مل من مدب 170، ودرجة الحموضة 7.4 + 500 مل من دمم / F12 مع بيكربونات الصوديوم (0.2438٪). إغف (5 نانوغرام / مل)؛ هدروكوريتيسون (0.5 ميكروغرام / مل)؛ الأنسولين (5 ميكروغرام / مل)؛ خلاصة النخامية البقرية (بب؛ 35 ميكروغرام / مل)؛ و GW627368X (1 ميكروغرام / مل) في 15 سم الأطباق.
  2. بعد عد الخلايا مع عدادة الكريات، البذور 1.2 × 10 6 خلايا في 12 مل من المتوسطة لكل طبق 15 سم في اليوم 0 لمدة 4 أيام 4 .
  3. بعد 4 أيام في الثقافة، أجهزة الطرد المركزي في وسط الثقافة في 300 x ج لمدة 5 دقائق باستخدام الطرد المركزي الجدول الأعلى. نقل طاف إلى أنبوب مخروطي الشكل ( الشكل 1 ).
  4. الطرد المركزي طاففي 2000 x ج لمدة 20 دقيقة في الطرد المركزي الجدول الأعلى. نقل طاف إلى أنبوب نابذة فائقة السرعة وترك الخلايا الميتة والحطام الخلية ( الشكل 1 ).
  5. الطرد المركزي طاف في 10،000 x ج لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية. نقل طاف إلى أنبوب نابذة فائقة السرعة ( الشكل 1 ).
  6. الطرد المركزي طاف في 110،000 x ج لمدة 60 دقيقة في 4 درجات مئوية. إزالة طاف و ريسوسبيند بيليه إيف / إكسوسوم في برنامج تلفزيوني ( الشكل 1 ).
  7. الطرد المركزي طاف في 110،000 x ج لمدة 60 دقيقة في 4 درجات مئوية. إزالة طاف. ريسوسبيند إيف / إكسوسوم بيليه في برنامج تلفزيوني ( الشكل 1 ). ريسوسبيند بيليه معزولة من 240-480 مل من ناميك مكيفة مكيفة في 100 ميكرولتر.
  8. قياس تركيز البروتين من تعليق إيف مع فحص البروتين بكا. تأكد من أن تركيز حوالي 20-40 ميكروغرام / 100 ميكرولتر. مخزن في -20 درجة مئوية لمزيد من التحليل.
  9. قياس تركيز وحجم إيفس / إكسوسوميس عن طريق تحليل تتبع الجسيمات متناهية الصغر (نتا)، كما وصفها سابقا غاردينر وآخرون. 11 - تمييع إيفس / إكسوسوميس (20 ميكروغرام / 100 ميكرولتر) مع برنامج تلفزيوني إلى 10،000 أضعاف لتحليل نتا.
    ملاحظة: نتيجة تحليل نتا يعكس عدد وحجم الحويصلات تحليلها.
  10. صورة إيفس / إكسوسوميس مع المجهر ترانزميسيونلكترون (تيم)، كما هو موضح سابقا من قبل لين وآخرون 4 .

2. إكسوسوم تنقية باستخدام التدرج الكثافة

  1. ريسوسبيند ال 110،000 بيليه من الخطوة 1.7 في 40٪ (ث / ت) يوديكسانول في برنامج تلفزيوني (2 مل). تراكب الخليط في تسلسل مع أليكوتس من 30٪، 20٪، 10٪، و 5٪ (ث / ت) يوديكسانول في برنامج تلفزيوني (2 مل لكل منهما) لتشكيل التدرج الكثافة في أنبوب نابذة فائقة السرعة.
  2. الطرد المركزي الخليط في 200،000 x ج لمدة 8 ساعات في 4 درجات مئوية.
  3. جمع كل جزء التدرج (10 فراكتسيالإضافات. 1 مل / جزء) مع ماصة من الجزء العلوي من الأنبوب.
  4. تحليل وجود علامات إكسوسوم (على سبيل المثال، CD81، CD9، CD63، و Tsg101) في كل جزء من سدز-بادج 12 وصمة عار الغربية. تحميل 50 ميكرولتر تعليق من كل جزء على هلام 10٪ تحتوي على 0.1٪ (ث / ت) سدز وفصل البروتينات في الكسور مع الكهربائي هلام.
  5. نقل البروتينات من هلام إلى غشاء بفدف واحتضان الغشاء مع الأجسام المضادة ضد علامات إكسوسوم (على سبيل المثال، CD81، CD9، CD63، و Tsg101) والبروتين التدبير المنزلي غابد بين عشية وضحاها ( جدول المواد ) في 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: تحدد النتيجة الكسر الذي يحتوي على إكسوسوميس.

3. خارج الخلية حويصلة / إكسوسوم وسم

  1. تعليق إيفس / إكسوسوميس، التي تم الحصول عليها في الخطوة 1.7، في 10 ميكرومتر كاربوكسيفلورسين سوتسينيميديل استر دياسيتات (كفس) في 20 ميكروغرام من البروتين إكسوسومال / 100 ميكرولتر. إعداد عينة موازية المشتركفقط كفس و بس، معالجتها بنفس الطريقة، كما سيطرة سلبية ل إيف / إكسوسوم المقايسات امتصاص في وقت لاحق. ترك الخلائط عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  2. تعليق إيفس / إكسوسوميس في حجم 50X من برنامج تلفزيوني وأجهزة الطرد المركزي تعليق في 110،000 x ج لمدة 60 دقيقة في 4 درجات مئوية. إزالة طاف و ريسوسبيند بيليه إيف / إكسوسوم في برنامج تلفزيوني. كرر الخطوة 3.2 مرة واحدة.
  3. تعليق إيفس / إكسوسوميس في برنامج تلفزيوني بتركيز 20 ميكروغرام من البروتين إكسوسومال / 100 ميكرولتر ومن ثم تصفية إيفس / إكسوسوميس من خلال الأغشية 0.22 ميكرون قبل إضافة إيفس / إكسوسوميس إلى الخلايا.

4. خارج الخلية حويصلة / إكسوسوم امتصاص الفحص

  1. لجعل وسط الثقافة، مزيج 500 مل من مدب 170، ودرجة الحموضة 7.4 + 500 مل من دمم / F12 مع بيكربونات الصوديوم (0.2438٪)؛ إغف (5 نانوغرام / مل)؛ هدروكوريتيسون (0.5 ميكروغرام / مل)؛ الأنسولين (5 ميكروغرام / مل)؛ و بب (35 ميكروغرام / مل) 4 . لوحة الخلايا الثديية هملان الظهارية الإنسان في 6 أطباق جيدا (1 × 10 6 </ سوب> الخلايا / جيدا) قبل يوم واحد إيف / إكسوسوم العلاج. إضافة 2 ميكروغرام / مل كفس مضان المسمى إيفس / إكسوسوم، التي تم الحصول عليها في الخطوة 3.3، إلى الوسط الثقافي للخلايا همل لمدة 2-6 ح. علاج خلايا همل من مجموعة السيطرة السلبية مع إعداد مواز، وصفها في الخطوة 3.1.
  2. بعد الحضانة 2-6 ح، وغسل الخلايا مرتين مع 4 مل من برنامج تلفزيوني في درجة حرارة الغرفة.
  3. فصل الخلايا مع التربسين 0.25٪ لمدة 10 دقيقة وإعادة تعليق الخلايا في برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.2٪ فبس. قياس إيف / إكسوسوم امتصاص من كثافة مضان في الخلايا باستخدام محلل خلية مضان 4 . صورة الخلايا تعامل مع إيفس / إكسوسوميس أو السيطرة السلبية باستخدام المجهر متحد البؤر.
    ملاحظة: ويتسبب مضان الأخضر في الخلايا من قبل إيف / إكسوسوم امتصاص. انظر أسطورة الشكل 6 لإعدادات المجهر.

5. عزل ماوس الابتدائي خلايا الظهارية الثديية

    إعداد الأطباق المغلفة الجيلاتين بإضافة 12 مل من محلول الجيلاتين 0.1٪ إلى 10 سم الأطباق. وضع لوحات في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. إزالة الحل الجيلاتين وترك الأغطية قبالة الأطباق في غطاء تدفق الصفحي لمدة 4 ساعات حتى تجفيف طلاء الجيلاتين.
  1. تشريح عدد 2، 3، 4، و 5 الغدد الثديية ( الشكل 2 ) من 12 أسبوعا العذراء الإناث C57BL / 6 الفئران باستخدام مقص وقطع الغدد إلى قطع صغيرة (2 مم 2 ) باستخدام الحلاقة.
  2. وعلاوة على ذلك تنفصل الطين الغدد الثديية (من 10 الفئران) لمدة 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية، 120 دورة في الدقيقة التحريض مع 50 مل من دمم / F12 تحتوي على 0.2٪ كولاجيناز نوع الرابع، 0.2٪ التربسين، 5٪ فبس، 5 ميكروغرام / مل الجنتامايسين ، و 1x القلم-بكتيريا.
  3. بيليه أسفل أورغانويدس الظهارية من الخليط بواسطة الطرد المركزي في 350 x ج لمدة 10 دقيقة.
  4. تعليق أورغانويدس الظهارية في 4 مل من دمم / F12 مع 0.1 ملغ / مل دناز أنا لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. إضافة 6 مل من دمم / F12 إلى نهائيحجم 10 مل.
  5. الطرد المركزي تعليق في 400 x ج لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وتجاهل طاف.
  6. ريسوسبيند بيليه في 10 مل من دمم / F12. الطرد المركزي التعليق ولكن ضرب الفرامل عندما تصل السرعة 400 x ز. تجاهل طاف.
    ملاحظة: عن طريق ضرب الفرامل، أورغانويدس الظهارية يتم تكويرها بسرعة أسفل، في حين الخلايا الليفية، وخلايا واحدة، لا تزال البقاء في طاف.
  7. كرر الخطوة 5.6 و 5.7 5-7 مرات. إضافة قطرة من تعليق إلى عدادة الكريات ومن ثم التحقق من إزالة الخلايا الليفية من خليط عضوي تحت المجهري بعد كل جولة من الطرد المركزي ( الشكل 3 ).
  8. لوحة في أورغانويدس في طبق المغلفة الجيلاتين، التي تم الحصول عليها في الخطوة 5.1، لمدة 48 ساعة مع دمم / F12 تحتوي على 1X إيتس، 5٪ فبس، 50 ميكروغرام / مل الجنتاميسين، 10 نانوغرام / مل إغف، و 1X القلم بكتيريا.
  9. بعد 48 ساعة، وإزالة الخلايا العائمة في الثقافة عن طريق استبدال المتوسطة مع وسط الاستزراع الطازج دون فبس (دمم / F12 تحتوي على 1X إيتس، 50 ميكروغرام / مل الجنتاميسين، 10 نانوغرام / مل إغف، و 1 X القلم بكتيريا).
  10. تأكد من أن أحادي الطبقة من الخلايا الظهارية الثديية يهاجر وينمو من أورغانويدس الظهارية المرفقة في 3 أيام.

6. فصل الابتدائي الماوس القاعدية / الخلايا الظهارية الثديية اللمعية

  1. بعد الثقافة لمدة 3 أيام، وفصل الخلايا الثديية الأولية الماوس مع خليط انزيم طبيعي مع نشاط انزيم بروتين و كولاجينوليتيك لمدة 20 دقيقة. تحييد نشاط الانزيم مع فبس 5٪ في برنامج تلفزيوني.
  2. أجهزة الطرد المركزي تعليق في 450 x ج لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وتجاهل طاف. ريسوسبيند بيليه الخلية في 5 ملغ / مل ديسباس لمدة 20 دقيقة. تحييد نشاط الانزيم مع فبس 5٪ في برنامج تلفزيوني.
  3. أجهزة الطرد المركزي تعليق في 450 x ج لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وتجاهل طاف.
  4. إعادة تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر بس مع 0.2٪ فبس في تركيز 10 7 خلية / مل مع المخففومكافحة CD49f والأجسام المضادة لمكافحة إبكام على الجليد لمدة 1 ساعة في الظلام.
  5. غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني ومن ثم احتضان الخلايا مع الأجسام المضادة الثانوية فلورفور مترافق على الجليد لمدة 30 دقيقة في الظلام.
  6. غسل وإعادة تعليق الخلايا في برنامج تلفزيوني مع 0.2٪ فبس.
  7. فرز إبكام مرحبا / CD49f لو الخلايا الظهارية الثديية اللمعية على فارز الخلية 4 .

7. خارج الخلية حويصلة / إكسوسوم العلاج

  1. البذور فرزها إبكام مرحبا / CD49f لو الخلايا الظهارية الثديية اللمعية من الخطوة 6.7 على أطباق الجيلاتين المغلفة 6 جيدا (2 × 10 5 خلية / جيدا) ومن ثم علاجها مع برنامج تلفزيوني أو 2 ميكروغرام / مل ناميك المستمدة إيفس / إكسوسوميس التي تم الحصول عليها في الخطوة 1.7.
  2. لضمان فعالية بيولوجية من إيفس / إكسوسوميس في علاج الثقافة على المدى الطويل، واستبدال وسط زراعة الخلايا مع المتوسطة الطازجة التي تحتوي على برنامج تلفزيوني أو 2 ميكروغرام / مل ناميك المستمدة إيفس / إكسوسوميس كل يومين. لا تقسم الماوس الأوليري الخلايا اللمعية خلال العلاج لمدة 10 يوما.

8. الدهون وسادة حقن الخلايا الظهارية الثديية

  1. تخدير الإناث البالغ من العمر 3 أسابيع C57BL / 6 الفئران مع إيسوفلوران 2-3٪ استنشاق.
  2. ضع الماوس تخدير على ظهره. إزالة الفراء على منتصف البطن مع الحلاقة / كريم الشعر وتنظيف موقع الجراحة مع ثلاث دورات بالتناوب من الكحول 70٪ والبوفيدون اليود.
  3. جعل شق العمودية 1.5 سم من خلال الجلد على طول المنطقة البطنية الصدري-الإربية مع مقص ثم تعريض بالتناوب الحق واليسار 4 منصات الثدي الثديية.
  4. مسح كل لوحة الدهون عن طريق إزالة حمة الغدة مع مقص. تحديد العقدة الليمفاوية في لوحة الدهون ثم إزالة حمة الغدة كلها تحت العقدة الليمفاوية.
    ملاحظة: يجب أن تبقى ثلثي لوحة الدهون في مكانها.
  5. فصل الخلايا التي تم الحصول عليها من الخطوة 7.2 مع خليط انزيم طبيعي (انظر جدول المواد ) مع بروتيننشاط الكولاجينولتيك انزيم لمدة 10 دقيقة. تحييد نشاط الانزيم مع فبس 5٪ في برنامج تلفزيوني.
  6. أجهزة الطرد المركزي تعليق في 450 x ج لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وتجاهل طاف. عد الخلايا مع عدادة الكريات وتعليق الخلايا في برنامج تلفزيوني في تركيز مثل أن 15 ميكرولتر يحتوي على جرعة الخلية المطلوبة (10 4 -10 2 خلية / وسادة).
  7. حقن 15 ميكرولتر من تعليق الخلايا الظهارية الثديية في لوحة الدهون باستخدام 100 حقنة الزجاج ميكرولتر تعلق على إبرة 27G.
  8. كرر الخطوات 8،4-8،7 لوحة الدهون على الجانب الآخر.
  9. إغلاق الجلد مع مقاطع الجرح.

9. الثديية الغدة جبل كامل

  1. الموت ببطء الماوس مع كو 2 زائد خلع عنق الرحم في 8 أسابيع بعد حقن الخلية (الخطوة 8.7).
  2. إجراء شق عمودي من خلال طبقة الجلد من المنطقة الصدرية إلى المنطقة الأربية باستخدام مقص ثم كشف كل من اليمين واليسار 4 ممنصات الدهون الأمري. إزالة الغدد الثديية ال 4 ( الشكل 2 ).
  3. انتشار منصات الدهون على الشرائح المجهر الزجاجي وإصلاح منصات الدهون مع مثبت كاهل (4٪ الفورمالديهايد، 30٪ إتوه، و 2٪ حمض الخليك الجليدي) في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها.
    تنبيه: مثبت كاهل هو مهيج. تنفيذ هذه الخطوة في غطاء محرك السيارة الكيميائية.
  4. غسل منصات الدهون في 250 مل من 70٪ إتوه لمدة 15 دقيقة ثم في 250 مل من د 2 O لمدة 5 دقائق. وصمة عار منصات الدهون مع الشبك القرم (1 غرام من الكارمين و 2.5 غرام من كبريتات البوتاسيوم الألومنيوم في 500 مل من د 2 O) في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها.
  5. غسل منصات الدهون مع 250 مل من إتوه 70٪ لمدة 15 دقيقة، 250 مل من 95٪ إتوه لمدة 15 دقيقة، و 250 مل من إتوه 100٪ لمدة 15 دقيقة.
  6. تنظيف منصات الدهون في الزيلين لعدة أيام ووقف الحضانة زيلين عندما تصبح منصات الدهون شفافة.
    الحذر: الزيلين هو مهيج. تنفيذ هذه الخطوة في غطاء محرك السيارة الكيميائية.
  7. جبل الشرائح وايتصاعد وسط والتقاط الصور (2،400 نقطة في البوصة) من منصات الدهون باستخدام الماسح الضوئي الشريحة الرقمية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

منذ أن تبين أن منع ي 2 / إب 4 تشوير يطلق إيف / إكسوسوم الافراج عن الثديية مثل الخلايا الجذعية القاعدية 4 ، وهذا العمل يقدم وسيلة لعزل إيفس / إكسوسوميس الناجم عن الثديية الظهارية الخلايا القاعدية (ناميك) الثقافة. منذ نامس مثقف في وسط خالية من المصل، لا يوجد أي إيفس / إكسوسومس موجودة مسبقا المستمدة من المصل 13 . بالنسبة للخلايا المستزرعة في الوسط المحتوي على المصل، يجب أن يتم تنظيف...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

إكسوسوميس غالبا ما تحمل خصائص الخلايا التي أفرجت عنها، وكمية من إكسوسوميس الافراج عنهم يمكن أن يسببها المحفزات 4 . يمكن جمع وسط الثقافة من الخلايا وتعرض لتنبيذ فائق التفاضلية لجمع إيف / إكسوسوم ( الشكل 1 ). لا يوجد حاليا اتفاق عام على طريقة مثالية لعزل المركبات الكهربائية / إكسوسوميس. وقد تم تحديد الطريقة المثلى المستخدمة هنا بواسطة تطبيق المصب 14 . الطرد المركزي هو طريقة سريعة نسبيا لعزل إيفس / إكسوسومي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من معاهد البحوث الصحية الوطنية (05A1-CSPP16-014، هجل) ومن وزارة العلوم والتكنولوجيا (موست 103-2320-B-400-015-MY3، هجل).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
MCDB 170 USBiologicalM2162
DMEM / F12Thermo1250062
Optima L-100K أجهزة الطرد المركزيالفائقة بيكمان393253
SW28 Ti الدواربيكمان342204
SW41 الدواربيكمان331306
NANOSIGHT LM10MalvernNANOSIGHT LM10لتحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA)
Optiprep سيجما ألدريتشD155660٪ (وزن / حجم) محلول اليوديكسانول في الماء (معقم).
الأجسام المضادة CD81GeneTexGTX1017661: 1,000 في 5٪ وزن / حجم الحليب الجاف الخالي من الدسم ، 1x TBS ، 0.1٪ Tween 20 عند 4 درجات ؛ C ، بين عشية وضحاها 
الأجسام المضادة CD9GeneTexGTX1009121: 1,000 في 5٪ وزن / حجم الحليب الجاف الخالي من الدسم ، 1x TBS ، 0.1٪ Tween 20 عند 4 درجات ؛ C ، بين عشية وضحاها 
CD63 الأجسام المضادةAbcamAb594791: 1,000 في 5٪ وزن / حجم الحليب الجاف الخالي من الدسم ، 1x TBS ، 0.1٪ Tween 20 عند 4 درجات ؛ C ، بين عشية وضحاها 
TSG101 الجسم المضادGeneTexGTX1187361: 1,000 في 5٪ وزن / حجم الحليب الجاف الخالي من الدسم ، 1x TBS ، 0.1٪ Tween 20 عند 4 درجات ؛ C ، بين عشية وضحاها 
GAPDHGeneTexGTX1001181: 6,000 في 5٪ وزن / حجم حليب جاف خالي الدسم ، 1x TBS ، 0.1٪ Tween 20 عند 4 درجات ؛ C ، بين عشية وضحاها 
CFSE (كربوكسي فلوريسين سكسينيميديل ثنائي الأسيتات إستر)ThermoV12883
FACSCaliburBD Biosciencesالخلايا الفلورية
كولاجيناز النوع الرابع & nbsp ؛Thermo17104019
التربسينThermo27250018
  ITSسيجما - ألدريتشI3146مزيج من الأنسولين البشري المؤتلف ، والترانسفيرين البشري ، وسيلينيت الصوديوم
أكووتازebioscience00-4555-56خليط إنزيم طبيعي مع نشاط إنزيم محلل للبروتين وتحلل الكولاجينات
تباين   ؛STEMCELL79135 مجم / مل = 5 U / مل
من الجسم المضاد ل CD49fBiolegend3136111:50
الأجسام المضادة المضادة ل EpCAMBiolegend1182131:200
FACSAriaBD Biosciencesفارز الخلايا
القرمزي الشبSigma-AldrichC1022
الخلايا الظهارية الثديية البشرية (خلايا HMLE ، NAMECs)هدايا من الدكتور روبرت واينبرغ
permountThermo Fisher Scientific SP15-500
بيكربونات الصوديومZymeset BSB101
EGFPeprotechAF-100-015
HydrocoritisoneSigma-AldrichSI-H0888
الأنسولين  Sigma-AldrichSI-I9278
BPE (مستخلص الغدة النخامية البقري) HammodCell Tech  1078-NZ
GW627368X كايمان10009162
طبق ثقافة 15 سمFalcon   ؛353025
جهاز طرد مركزي على الطاولةEppendrof جهاز طرد مركزي 3415R
أنبوب الطرد المركزي الفائقبيكمان344058
PBS (محلول ملحي مخزن بالفوسفات)  Corning46-013-CM
البروتين BCAThermo Fisher Scientific 23228
الفحص المجهري الإلكتروني لنقلهيتاشيHT7700
الجيلاتين STEMCELL7903
طبق استزراع 10 سمFalcon 353003
طبق ثقافة 6 آبارCorning3516
أنثى C57BL / 6 فئرانNLAC (مركز
للحيوانات FBS (مصل الأبقار الجنينية) BioWest& nbsp ؛S01520
gentamycinThermo Fisher Scientific 15710072
القلم / البكتيريا العقديةCorning30-002-Cl
DNase I5PRIMER2500120
الأيزوفلوران   ؛الهالوكربونNPC12164-002-25
الفورمالديهايدماكرونH121-08
EtOH (الإيثانول)جي تي بيكر800605
حمض الخليك الجليديPanreac131008.1611
كبريتات البوتاسيوم الألومنيومسيجما ألدريتش12625
زيلين   ؛لايكا3803665
0.22 & م أغشيةMerck MilliporeMillex-GP
AUTOCLIP Wound Clips ، 9 ممBD Biosciences427631
AUTOCLIP Wound Clip ApplierBD Biosciences427630
CellMask & trade ؛ ديب ريدثيرمو فيشر علمي C10046صبغة غشاء البلازما
محلل فحص المختبر الوطني

المراجع

  1. Simons, M., Raposo, G. Exosomes--vesicular carriers for intercellular communication. Curr Opin Cell Biol. 21 (4), 575-581 (2009).
  2. Théry, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat Rev Immunol. 9 (8), 581-593 (2009).
  3. Boelens, M., et al. Exosome Transfer from Stromal to Breast Cancer Cells Regulates Therapy Resistance Pathways. Cell. 159 (3), 499-507 (2014).
  4. Lin, M. C., et al. PGE2 /EP4 Signaling Controls the Transfer of the Mammary Stem Cell State by Lipid Rafts in Extracellular Vesicles. Stem Cells. , (2016).
  5. Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. , (2006).
  6. György, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cell Mol Life Sci. 68 (16), 2667-2688 (2011).
  7. Olver, C., Vidal, M. Proteomic analysis of secreted exosomes. Subcell Biochem. 43, 99-131 (2007).
  8. Shackleton, M., et al. Generation of a functional mammary gland from a single stem cell. Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).
  9. Prater, M. D., et al. Mammary stem cells have myoepithelial cell properties. Nat Cell Biol. 16 (10), 942-950 (2014).
  10. Stingl, J., et al. Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells. Nature. 439 (7079), 993-997 (2006).
  11. Gardiner, C., Ferreira, Y. J., Dragovic, R. A., Redman, C. W., Sargent, I. L. Extracellular vesicle sizing and enumeration by nanoparticle tracking analysis. J Extracell Vesicles. 2, (2013).
  12. Shapiro, A. L., Viñuela, E., Maizel, J. V. Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels. Biochem Biophys Res Commun. 28 (5), 815-820 (1967).
  13. Riches, A., Campbell, E., Borger, E., Powis, S. Regulation of exosome release from mammary epithelial and breast cancer cells - a new regulatory pathway. Eur J Cancer. 50 (5), 1025-1034 (2014).
  14. Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. J Extracell Vesicles. 2, (2013).
  15. van der Vlist, E. J., Nolte-'t Hoen, E. N., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J., Wauben, M. H. Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry. Nat Protoc. 7 (7), 1311-1326 (2012).
  16. Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (8), E968-E977 (2016).
  17. Li, D., et al. ADVANCED IMAGING. Extended-resolution structured illumination imaging of endocytic and cytoskeletal dynamics. Science. 349 (6251), (2015).
  18. Outzen, H. C., Custer, R. P. Growth of human normal and neoplastic mammary tissues in the cleared mammary fat pad of the nude mouse. J Natl Cancer Inst. 55 (6), 1461-1466 (1975).
  19. Sheffield, L. G., Welsch, C. W. Transplantation of human breast epithelia to mammary-gland-free fat-pads of athymic nude mice: influence of mammotrophic hormones on growth of breast epithelia. Int J Cancer. 41 (5), 713-719 (1988).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

نقل الغدة الثديية تشكيل القدرة بين الخلايا الظهارية الثديية القاعدية والخلايا اللمعية الثديية عن طريق الحويصلات خارج الخلية / إكسوسوميس
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.