مقالة منهجية

تحليل سوبيركومبلكسس من سلسلة النقل الإلكترون الميتوكوندريا مع الكهربائي الأصلي، في هلام فحوصات، والكهرباء

DOI:

10.3791/55738

⸱

يونيو 1, 2017

 , 
1Department of Pediatrics-Division Cardiology, University of Rochester

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول فصل المجمعات الوظيفية سلسلة النقل الإلكترون الميتوكوندريا (سك) الرابع و سوبيركومبليكسس منها باستخدام الكهربائي الأصلي للكشف عن معلومات حول تجميعها وهيكلها. يمكن أن يتعرض هلام الأم إلى إمونوبلوتينغ، في هلام المقايسات، وتنقية عن طريق إليكترولوتيون لمزيد من وصف المجمعات الفردية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

سلسلة نقل الإلكترون الميتوكوندريا (إتك) يحول الطاقة المستمدة من انهيار أنواع الوقود المختلفة في العملة الحيوية الحيوية للخلية، أتب. ويتكون إتك من 5 مجمعات بروتينية ضخمة، والتي تتجمع أيضا في سوبيركومبلكسيس تسمى ريسبراسوميس (سي، C-إي، و C-إيف) والسينثاسومات (كف) التي تزيد من كفاءة نقل الإلكترون وإنتاج أتب. وقد استخدمت أساليب مختلفة لأكثر من 50 عاما لقياس وظيفة إتك، ولكن هذه البروتوكولات لا توفر معلومات عن تجميع المجمعات الفردية و سوبيركومبلكسس. يصف هذا البروتوكول تقنية هلام الأصلي بولي أكريلاميد هلام الكهربائي (بادج)، وهي الطريقة التي تم تعديلها منذ أكثر من 20 عاما لدراسة إتك بنية معقدة. يسمح الكهربائي الكهربائي فصل المجمعات إتك في أشكالها النشطة، ويمكن بعد ذلك دراسة هذه المجمعات باستخدام إمونوبلوتينغ، في هلام المقايسات (إيغا)، وتنقية عن طريق إليكترلوتيون. من خلال الجمع بين إعادةوالطبقات من هلام الأم الصفحة مع تلك المقايسات الميتوكوندريا الأخرى، فمن الممكن الحصول على صورة كومبلتر من نشاط إتك، والتجمع الديناميكي والتفكيك، وكيف ينظم هذا الهيكل الميتوكوندريا وظيفة. وسيناقش هذا العمل أيضا القيود المفروضة على هذه التقنيات. وباختصار، فإن تقنية الأصلي بادج، تليها إمونوبلوتينغ، إيغا، والكهربائية، المعروضة أدناه، هو وسيلة قوية للتحقيق في وظائف وتكوين الميتوكوندريا الخ سوبيركومبلكسس.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الطاقة الميتوكوندريا في شكل أتب ليست ضرورية فقط لبقاء الخلية، ولكن أيضا لتنظيم موت الخلايا. ويتطلب توليد أتب بواسطة الفسفرة المؤكسدة سلسلة نقل إلكترون وظيفية (إتك؛ سك-I إلى إيف) وميتوكوندريا أتب سينثاس (سك-V). وقد أظهرت الدراسات الحديثة أن يتم تنظيم هذه المجمعات البروتين الكبيرة في سوبيركومبلكسس، ودعا ريسبراسوميس و سينثاسوميس 1 ، 2 . ومن الصعب تحليل التجمع، والديناميات، وتنظيم الأنشطة من هذه المجمعات الضخمة والسوبركومبلكس. في حين قياسات استهلاك الأوكسجين التي اتخذت مع قطب الأكسجين وانزيم المقايسات التي أجريت باستخدام مقياس الطيف يمكن أن تعطي معلومات قيمة عن النشاط معقدة إتك، هذه المقايسات لا يمكن أن توفر معلومات بشأن وجود وحجم وتكوين وحدات فرعية من البروتين معقدة أو سوبيركومبلكسس المعنية. ومع ذلك، فإن تطوير الأزرق وواضح الأصلي (BN و ن، على التوالي) وقد خلقت الصفحة 3 أداة قوية للكشف عن معلومات هامة حول تكوين معقدة والتجميع / التفكيك وعن التنظيم الديناميكي للمنظمة سوبرامولكولار من هذه المجمعات التنفسية الحيوية تحت الظروف الفسيولوجية والمرضية 4 .

ويبدو أن تجميع هذه المجمعات في سوبيركومبلكسس أعلى ترتيب لتنظيم هيكل الميتوكوندريا وظيفة 5 . على سبيل المثال، التجمع ريسبراسوم يزيد من كفاءة نقل الإلكترون وتوليد قوة الدافع البروتون عبر الغشاء الداخلي الميتوكوندريا 5 . وبالإضافة إلى ذلك، فإن تجميع سينثاسوميس ليس فقط يزيد من كفاءة إنتاج أتب ونقل معادلات الطاقة في السيتوبلازم 2 ، ولكنه أيضا قوالب الغشاء الداخلي الميتوكوندريا في كريستي أنبوبي 6 ، </ سوب> 7 . الدراسات من التجمع سوبيركومبلكس خلال التطور القلبي في الأجنة الماوس تظهر أن جيل من سوبيركومبلكسس التي تحتوي على سك-I في القلب يبدأ في حوالي يوم الجنينية 13.5 8 . وقد أظهرت أخرى أن كمية من سكس-I-سوبيركومبلكسس التي تحتوي على نقصان في القلب بسبب الشيخوخة أو نقص التروية / إصابات ضخه 9 ، 10 أو قد تلعب دورا في تطور الأمراض العصبية 11 .

يصف هذا البروتوكول طرق هلام الأم الصفحة التي يمكن استخدامها للتحقيق في التجمع والنشاط من المجمعات إتك و سوبيركومبلكسس. ويمكن تقييم الوزن الجزيئي التقريبي لل سوبيركومبلكسس الميتوكوندريا عن طريق فصل المجمعات البروتين في المواد الهلامية بولي أكريلاميد ن أو بن. ن صفحة كما يسمح لتصور النشاط الأنزيمي من جميع المجمعات الميتوكوندريا مباشرة في هلام (في هلام المقايسات.إيغا) 12 . هذا العمل يدل على نشاط ريسبراسوميس من خلال تسليط الضوء على قدرة سك-I لأكسدة ناد من خلال إيغا ووجود سينثاسوميس بسبب النشاط أتب-هدروليزينغ من سك-V من قبل إيغا. ويمكن أيضا أن تظهر المجمعات متعددة و سوبيركومبلكسس التي تحتوي على سك-I و سك-V عن طريق نقل البروتينات على الأغشية النتروسليلوز وأداء إمونوبلوتينغ. ميزة هذا النهج هو أن بن أو ن صفحة عموما يفصل المجمعات البروتين على أساس حجمها الفسيولوجية وتكوينها؛ نقل إلى غشاء يحافظ على هذا النمط من العصابات. تحليل المجمعات البروتين في بن أو ن صفحة يمكن أيضا أن يتم باستخدام 2D-بادج (انظر فيالا وآخرون 13 لمظاهرة) أو عن طريق السكروز كثافة الطرد المركزي 14 ، 15 . لمزيد من تحليل فرقة محددة، فإنه يمكن استئصاله من بن صفحة، والبروتينات من هذا البروتين يمكن أن يكون بوريفيد عن طريق إلكترويلوتينغ لهم في ظل الظروف المحلية. يمكن إجراء إلكترلوشن المحلية في غضون ساعات قليلة، والتي يمكن أن تحدث فرقا كبيرا في الانتشار السلبي (كما هو مستخدم في المرجع 16) من البروتينات من هلام في المخزن المؤقت المحيطة بها.

وباختصار، تصف هذه الأساليب العديد من النهج التي تسمح لتوصيف المزيد من سوبيركومبلكسس عالية الوزن الجزيئي من الأغشية الميتوكوندريا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أجريت جميع التجارب باستخدام قلوب من الفئران C57BL / 6N (نوع البرية). تم تخدير الفئران مع كو 2 قبل خلع عنق الرحم، وأجريت جميع الإجراءات بما يتفق بدقة مع شعبة الطب المخبري للحيوان في جامعة روتشستر وامتثالا لقانون الدولة، والنظام الاتحادي، وسياسة المعاهد الوطنية للصحة. تمت الموافقة على البروتوكول من قبل لجنة رعاية الحيوان واستخدام المؤسسي من جامعة روتشستر (لجنة الجامعة للموارد الحيوانية).

1. ن و بن الصفحة

ملاحظة: يجب أن تكون جميع المعدات المستخدمة ل بن و ن بادج خالية من المنظفات. لضمان هذا، وغسل جميع المعدات مع 0.1 M حمض الهيدروكلوريك، تليها الشطف على نطاق واسع مع منزوع الأيونات H 2 O.

  1. تجهيز
    1. إعداد العازلة الأنود تتألف من 25 ملي إيميدازول، ودرجة الحموضة 7.0، في 4 درجات مئوية. مخزن في 4 درجات مئوية.
    2. إعداد العازلة الكاثود ل ن أو بن الصفحة.
      1. ل ن بادج، استخدم 7.5 ملي إيميدازول و 50 ملي تريسين. إضافة 0.5 غرام من ديوكسيكولات الصوديوم و 0.2 غرام من مالتوسيد لوريل للتر الواحد من العازلة. ضبط درجة الحموضة إلى 7.0 في 4 درجات مئوية وتخزينها في 4 درجات مئوية.
      2. ل بن بادج، استخدم 7.5 ملي إيميدازول و 50 ملي تريسين وضبط درجة الحموضة إلى 7.0 في 4 درجات مئوية. تخزين في 4 درجات مئوية.
      3. للضوء الأزرق بن العازلة الكاثود، واستخدام 7.5 ملي إيميدازول و 50 ملي تريسين. ضبط درجة الحموضة إلى 7.0 في 4 درجات مئوية وإضافة 20 ملغ من كوماسي لكل لتر من العازلة. تخزين في 4 درجات مئوية.
    3. إعداد العازلة استخراج (إب) مع 50 ملي كلوريد الصوديوم، 50 ملي إيميدازول، 2 ملي حمض أمينوكابرويك، و 1 ملي إدتا. ضبط درجة الحموضة إلى 7.0 في 4 درجات مئوية وتخزينها في 4 درجات مئوية.
    4. إعداد 3X هلام العازلة (المستخدمة ل بن و ن المواد الهلامية) مع 75 ملي إيميدازول و 1.5 M حمض أمينوكابرويك. ضبط درجة الحموضة إلى 7.0 في 4 درجات مئوية وتخزينها في 4 درجات مئوية.
    5. إعداد عازلة تحميل (لب) من 0.01 غرام من بونسيو S، 5 غرام من الجلسرين، و 5 مل من H 2 O. تخزين في الغرفةدرجة الحرارة.
    6. إعداد كوماسي الأزرق بإضافة 50 ملغ من كوماسي إلى 1 مل من 500 ملي حمض 6-أمينوهيكسانويك. ضبط درجة الحموضة إلى 7.0 في 4 درجات مئوية وتخزينها في 4 درجات مئوية.
    7. إعداد 20 ملي و 200 ملي ملتوسيد لوريل في H 2 O. جعل أليكوتس من 200 ميكرولتر وتخزينها المجمدة. ذوبان الجليد المنظفات قبل الاستخدام.
3٪ إلى 8٪ (ميني) من 4٪ إلى 10٪ (ماكسي)
0.5 الهلام (الضوء) 0.5 هلام (ثقيل) 0.5 الهلام (الضوء) 0.5 هلام (ثقيل)
أب (مل) 0.42 1.3 2.5 7.7
ن / بن العازلة (مل) 1.6 1.6 8.5 8.5
H 2 O (مل) 2.7 1.4 14 6.3
الجلسرين (ز) 0 0.47 0 2.5
الحجم (مل) 4.72 4.77 25 25
أبس (ميكرولتر) 27 27 65 65
تيمد (ميكرولتر) 4 4 10 10

الجدول 1: كميات المكونات اللازمة لتصب 1 Mini- أو ماكسي-بادج. يتم حساب الأحجام المستخدمة في هذا الجدول ل 1 مصغرة أو 1 ماكسي جل، 1.5 مم. ويستند حجم أب على حل الأسهم 40٪. الضوء والثقيلة تشير إلى كونسنتراتأيون من آب. أبس و تيمد تضاف بعد كل عمود من خلاط التدرج مليئة الحل آب.

  1. صب وتشغيل المواد الهلامية
    ملاحظة: استخدام 3-8٪ أو 4-10٪ أكريلاميد / بيساكريلاميد (أب) التدرج ل ن أو بن المواد الهلامية، على التوالي. الجدول 1 يلخص كميات العازلة، أب، H 2 O، الجلسرين، أمونيومبرسلفات (أبس) و تيتراميثيلثيلينديامين (تيمد) المستخدمة في هلام مصغرة (85 مم × × 73 مم ارتفاع × 1.5 مم) أو ماكسي هلام (160 مم واسعة × 200 مم ارتفاع × 1.5 مم). جمعيات لوحات زجاجية مع المواد الهلامية ن أو بن يمكن المبردة في كيس مع بضعة مل من 1X العازلة هلام أو ملفوفة في منشفة ورقية مبللة مع 1X العازلة هلام للتخزين. المواد الهلامية مستقرة للاستخدام لمدة تصل إلى أسبوع.
    1. لصب الجل، وضع خلاط التدرج على لوحة التحريك مرتفعة لضمان أن هلام سوف تتدفق عن طريق الجاذبية في غرفة هلام أعدت.
    2. ملء غرفة تدفق للخلاط التدرج مع 4.77 / 25 مل (ميني / ماكسي) من الحل الثقيل (مع تركيز أعلى من أب).
    3. فتح بلطف اتصال وقف الديك بين الثقيلة والخفيفة غرفة والسماح قطرة من الحل للذهاب من خلال إلى الجانب الآخر.
      ملاحظة: هذا يدفع فقاعات الهواء من أنبوب ربط ووقف الديك، والتي من شأنها منع تدفق بين المجلسين. وهذا لا يمكن القيام به إذا كان قد تم شغل كلا الجانبين بالفعل، لأن الضغط المتساوي سيمنع الفقاعة من الانتقال.
    4. ملء غرفة أخرى من خلاط التدرج مع 4.72 / 25 مل (ميني / ماكسي) من حل الضوء.
    5. وضع شريط ضجة في غرفة تدفق مع الحل الثقيل وتبدأ التحريك. استخدام سرعة شريط التحريك الذي لا يسبب فقاعات.
    6. إضافة بسرعة أبس و تيمد إلى كل غرفة لبدء البلمرة.
    7. فتح الاتصال بين غرفتين من خلاط التدرج والسماح خلط لبضع ثوان قبل فتح غرفة تدفق لصب هلام.
      ملاحظة: الجاذبية وايليرة لبنانية استنزاف كل من الغرف على قدم المساواة، وسوف خلط الضوء في الحل الثقيل يقلل ببطء كثافة الأكريلاميد من أسفل إلى أعلى هلام. استخدام المحتوى بأكمله الذي هو في خلاط التدرج لصب هلام.
      1. في النهاية، بعناية جبل مشط، مع الآبار داخل هلام لتجنب فقاعات و خلط الطبقة.
    8. اغسل على الفور خلاط التدرج مع الإيثانول لشطف أي هلام. شطف بالماء وصب الجل الثاني. السماح المواد الهلامية تتبلمر (عادة ما تكون هناك حاجة أقل من 20 دقيقة للالهلام مصغرة).
    9. لتشغيل المواد الهلامية، جبل لهم في المشبك التجمع الكهربائي وملء مركز / الغرفة العليا مع ن أو الضوء الأزرق بن العازلة الكاثود. انتظر بضع دقائق للتحقق من وجود تسرب قبل إضافة المخزن المؤقت الأنود إلى الغرفة الخارجية / السفلى.
      1. سحب بلطف أمشاط جيدا وغسل الآبار مع العازلة الكاثود باستخدام حقنة أو ماصة.
      2. تشغيل المواد الهلامية في غرفة باردة (4 درجة مئوية) أو معبأة تماما في الجليد.
        1. ل ن مصغرة بادج، استخدم 100 V للساعة الأولى و 200 V حتى الانتهاء، وعادة ما يكون 1-1.5 ح إضافية. بدلا من ذلك، تشغيل ن مصغرة بادج في 30-40 V بين عشية وضحاها.
          ملاحظة: التركيز هنا على المجمعات البروتين عالية الوزن الجزيئي، لذلك المجمعات البروتين مع الوزن الجزيئي أقل من 140 كيلو دالتون سوف نفد من هلام. يمكن استخدام أوقات تشغيل أقصر للرحلان الكهربائي للحفاظ على المجمعات ذات الوزن الجزيئي المنخفض.
        2. ل بن ماكسي-بادج، استخدم 100 V وتشغيل المواد الهلامية بين عشية وضحاها (حوالي 18 ساعة).
          ملاحظة: سيكون التيار منخفض جدا (<15 مللي أمبير)، لذلك هناك حاجة إلى إمدادات الطاقة التي يمكن التعامل مع هذه الشروط. عند هذه النقطة، يمكن استخدام المواد الهلامية ل إيغا أو إمونوبلوتينغ. في بعض الحالات، يمكن قطع العصابات أو الممرات من المواد الهلامية باستخدام شفرة حلاقة على لوحة زجاجية للكهرباء.
  2. إعداد عينة
    ملاحظة: يجب أن تستخرج سوبيركومبلكسس الميتوكوندريا الغشاء ملزمة من ثه غشاء الميتوكوندريا الداخلي. للحفاظ على سوبيركومبلكسس الميتوكوندريا، استخدم إما الميتوكوندريا المعزولة حديثا أو العينات التي تم تجميدها وذوبان مرة واحدة فقط. وتعطى الحسابات / الأحجام أدناه للهلام مصغرة (بئر مشط 10 بئر في هلام 1.5 مم يحمل ما يصل إلى 35-40 ميكرولتر) و ماكسي هلام (بئر مشط 15-جيدا يحمل ما يصل الى 200 ميكرولتر). وبالإضافة إلى ذلك، حفظ قسامة من كل عينة (عادة 10 ميكرولتر)، ليتم تشغيلها على تغيير طبيعة سدز هلام للكشف عن قناة أنيون تعتمد على الجهد (فداك)، والتحكم في التحميل.
    1. وضع كمية مناسبة (على سبيل المثال، 10-50 ميكروغرام من البروتين لالهلام مصغرة و50 - 200 ميكروغرام ل ماكسي هلام) من الميتوكوندريا معزولة أو الأنسجة جناسة في ميكروتوبس وأجهزة الطرد المركزي في 17،000 x ج لمدة 10-15 دقيقة في 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: هذه الخطوة يزيل بعض من مصفوفة الميتوكوندريا القابلة للذوبان و / أو البروتينات عصاري خلوي.
    2. نضح وتجاهل طاف وإضافة العازلة استخراج إلى المبلغ المطلوبلتحميل على هلام. ريسوسبيند بلطف الرواسب على الجليد. إذا رغبت في ذلك، إضافة مزيج مثبط الأنزيم البروتيني العام في هذه المرحلة.
      ملاحظة: استنادا إلى المعدات المستخدمة هنا، تم استخدام 30 ميكرولتر ل هلام مصغرة و 100 ميكرولتر ل ماكسي هلام، مما يحد من نسبة البروتين / العازلة إلى أكثر من 2 ميكروغرام من البروتين إلى 1 ميكرولتر من العازلة.
    3. إضافة المنظفات (على سبيل المثال، 2 ميكروغرام من مالتوسيد لوريل / 1 ميكروغرام من البروتين؛ انظر نتائج ممثل ومناقشة لمزيد من المعلومات).
      ملاحظة: عموما، يستخدم مالتوزيد لوريل، ولكن يمكن أيضا استخدام ديجيتونين.
    4. احتضان على الجليد لمدة 20 دقيقة. مزيج بلطف في البداية وأحيانا أثناء الحضانة عن طريق تريتوراتينغ و / أو تحريك الأنبوب.
    5. أجهزة الطرد المركزي في 17،000 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية لإزالة أي شظايا الغشاء والأنسجة.
    6. نقل طاف إلى أنبوب جديد. لعينات ن، إضافة 1 ميكرولتر من لب لكل 10 ميكرولتر من حجم العينة. يجب أن يكون الحجم الكلي للعينة التطبيقما يقرب من 40 ميكرولتر ل هلام مصغرة و 130 ميكرولتر ل ماكسي هلام. لعينات بن، إضافة كوماسي للعينات بحيث تكون نسبة الصبغة إلى المنظفات 1: 4 (ث / ث).
    7. تحميل 30 و 120 ميكرولتر من العينات في آبار مصغرة أو ماكسي هلام، على التوالي. استخدام 10 ميكرولتر المتبقية من كل عينة ل تغيير طبيعة سدز هلام للكشف عن فداك كما تحكم التحميل.
    8. لإعداد علامات الوزن الجزيئي، حل 1 قارورة من مزيج الجزيئات عالية الوزن معايرة (انظر جدول المواد لمزيد من المعلومات) في 60 ميكرولتر من بن / ن عازلة عازلة هل وإضافة 120 ميكرولتر من H 2 0 و 20 ميكرولتر من رطل. تحميل 15 ميكرولتر لكل حارة.
    9. تشغيل المواد الهلامية على النحو المبين في الخطوة 1.2.9.2.

2. في جل فحوصات ل سك-I و سك-V

ملاحظة: يتم تنفيذ المقايسات في درجة حرارة الغرفة. التقاط الصور، والمسح الضوئي، أو الصور من العصابات النامية للتوثيق. (هام) لا يمكن نقل البروتيناتo أغشية النيتروسليلوز بعد الانتهاء من إيغا.

  1. سك-I الفحص
    1. تجهيز.
      1. إعداد عازلة العازلة من 5 ملي تريس في H 2 O، مع الرقم الهيدروجيني 7.4؛ احفظه في درجة حرارة الغرفة.
      2. حل 10 ملغ من ناد في 1 مل من العازلة الفحص. تخزين في أليكوتس من 100 ميكرولتر في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام. تجنب تجميد والذوبان.
      3. تزن 25 ملغ من تيترازوليوم نيتروبلو في أنبوب ميكروتوب.
      4. إعداد تثبيتي عن طريق تمييع 5 مل من حمض الخليك في 95 مل من H 2 O. احفظه في درجة حرارة الغرفة.
    2. إجراء الفحص.
      1. الجمع بين 10 مل من العازلة مقايسة مع 25 ملغ من نيتروبلو تيترازوليوم (التركيز النهائي: 2.5 ملغ / مل) و 100 ميكرولتر من 10 ملغ / مل ناد (0.1 ملغ / مل). إضافة هذا إلى كامل هلام، حارة، أو مجال الاهتمام استئصال من هلام ن.
        ملاحظة: يمكن القيام بذلك في وعاء بلاستيكي أو زجاجي واضح. يرجى ملاحظة أن هذا الاختبار لا يمكن أن يؤديها بعد بن الصفحة.
      2. اتبع تطور العصابات الزرقاء بعد التحريض لطيف (الروك) لمدة> 3 دقائق.
      3. إصلاح هلام في 10 - 20 مل من محلول حمض الخليك أو غسل في 5 ملي تريس، ودرجة الحموضة 7.4 لوقف رد فعل. التقاط صور فوتوغرافية للتوثيق (انظر جدول المواد).
  2. سك-V مقايسة
    ملاحظة: يجب أن يتم مقايسة سك-V باستخدام المواد الهلامية ن أو بن مكررة، حيث يتم حضانة واحدة مع 5 ميكروغرام / مل أوليغومايسين (مثبط سك-V) لإظهار النشاط سك-V- مستقلة.
    1. تجهيز.
      1. إعداد عازلة العازلة مع 35 ملي تريس و 270 ملي جليكاين. ضبط درجة الحموضة إلى 8.3 في درجة حرارة الغرفة. تخزين المخزن المؤقت المجمدة في قسامة 50 مل، ولكن تحقق من درجة الحموضة بعد التجميد والذوبان.
      2. إعداد 1 M مغسو 4 في H 2 O؛ مخزن في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
      3. تزن 27.28 ملغ من الرصاص (نو 3 ) 2 في ميكروتوب.
      4. تزن 60 ملغ من أتب في ميكروتوب.
      5. حل 1 ملغ من سليغوميسين في 1 مل من الإيثانول. تخزين في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
      6. إعداد مثبت عن طريق خلط 50 مل من الميثانول مع 50 مل من H 2 O. احفظه في درجة حرارة الغرفة.
    2. إجراء الفحص.
      1. احتضان هلام، حارة، أو مجال اهتمام من بن أو هلام ن لمدة 2 ساعة مع التحريض لطيف (الروك) في 10-20 مل من العازلة فحص ± 5 ميكروغرام / مل أوليغوميسين (50-100 ميكرولتر من 1 ملغ / مل في الإيثانول) في درجة حرارة الغرفة.
      2. بعد الحضانة، واستبدال المخزن المؤقت مع 14 مل من العازلة مقايسة جديدة وإضافة، في النظام، 190 ميكرولتر من 1 M مغسو 4 (14 ملم)، 27.28 ملغ من الرصاص (نو 3 ) 2 (5 ملم)، 60 ملغ من أتب ( 8 ملم)، و 75 ميكرولتر من أوليغومايسين (عند الضرورة).
      3. احتضان مع التحريض لطيف (الروك) ومشاهدة لراسب أبيض، كما العصابات على المواد الهلامية المعالجة أوليغوميسين سيعطي غير سكس-V تعتمد العصابات.
        ملاحظة: قد يستغرق ظهور راسب عدة ساعات.
      4. إصلاح هلام في الميثانول-(على سبيل المثال، 50٪ من الميثانول)، لأن الحلول الحمضية سوف تحل راسب الرصاص. تصوير النتائج.
        ملاحظة: راسب الرصاص لا تتداخل مع تلطيخ كوماسي من المواد الهلامية.

3. نقل البروتين إلى النيتروسليلوز أو البولي فينيلين ديفلوريد (بفدف) الأغشية

  1. إعداد عازلة نقل من 25 ملي تريس و 200 ملي جليكاين. ضبط درجة الحموضة إلى 8.3 وإضافة 0.0005 غ / L سدز و 200 مل / لتر الميثانول. احفظه في درجة حرارة الغرفة.
    1. قطع نيتروسليلوز أو بفدف غشاء (حجم المسام: 0.45 ميكرون) مع شفرة حلاقة أو مقص إلى حجم أكبر قليلا من ذلك من هلام.
      ملاحظة: الأغشية نيتروسليلوز تسمح ل بونسيو S تلطيخ لتقييم تحميل البروتين، في حين أن الأغشية بفدف تسفر عن فرق أكثر وضوحا بشكل حاد.
  2. بروتوكول.
    1. نقع غشاء النيتروسليلوز، ورقة الترشيح، والإسفنج ل10 دقيقة على الأقل في نقل العازلة. وضع غشاء بفدف في 100٪ الميثانول لمدة 15 ثانية أو وفقا لتوصية الشركة المصنعة قبل وضعها في المخزن المؤقت نقل. ضع الكاسيت المفتوح لمجموعة النقل في وعاء مسطح مع ناقل مؤقت.
    2. ضع الاسفنجة و 1-2 طبقات من ورق الترشيح على الجانب الخلفي من الكاسيت. إزالة الفقاعات.
    3. ضع الجل على ورق الترشيح. تشير إلى اتجاه الجل من خلال لقطة زاوية من الجل و / أو الغشاء.
    4. وضع الغشاء على رأس هلام. إزالة جميع الفقاعات.
    5. وضع ورقة مرشح واسفنجة على رأس الغشاء. إزالة جميع الفقاعات في هذه السندويش.
    6. أغلق الكاسيت ووضعه في حامل الكاسيت من مجموعة النقل.
    7. نقل البروتينات في 25 V لمدة 12-18 ح.

4. إمونوبلوتينغ

  1. تجهيز.
    1. إعداد وصمة عار بونسو (500 مل) عن طريق إضافة 25 ملمن حمض الخليك و 0.5 غرام من بونسيو S إلى 475 مل من H 2 O؛ مخزن في درجة حرارة الغرفة (يمكن إعادة استخدامها).
    2. إعداد تريس مخزنة المالحة (تبس) مع 200 ملي كلوريد الصوديوم، 25 ملي قاعدة تريس، و 2.7 ملي بوكل. ضبط درجة الحموضة إلى 8.0 وتخزينها في درجة حرارة الغرفة.
    3. إعداد تبس-توين (تبست) بإضافة 0.5 مل / لتر توين 20 إلى تبس. احفظه في درجة حرارة الغرفة.
    4. إعداد المواد الصلبة الحليب / تبست عن طريق إذابة 5 غرام من المواد الصلبة الحليب في 100 مل من تبست. تخزين في 4 درجات مئوية واستخدامها في غضون 3 أيام.
    5. إعداد بسا / تبست عن طريق إذابة 3 غرام من ألبومين المصل البقري (بسا، الجزء الخامس) في 100 مل من تبست. تخزين في 4 درجات مئوية واستخدامها في غضون 3 أيام.
  2. بروتوكول.
    1. عند الانتهاء من نقل، وضع الغشاء في حل بونسيو S لتصور جميع البروتينات نقلها. تسمية موقف علامات على الغشاء مع قلم رصاص وتوثيق الغشاء الملون بونسو-S بواسطة صورة أو المسح الضوئي.
    2. غسل الغشاء 3 مرات لمدة 10 دقيقة كل وايث تبس تحت التحريض لطيف.
    3. منع الغشاء مع المواد الصلبة الحليب / تبست لمدة 1-2 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في غرفة باردة مع التحريض لطيف.
    4. غسل الغشاء لمدة 10 دقيقة مع تبست تحت التحريض لطيف.
    5. احتضان مع الأجسام المضادة الأولية بين عشية وضحاها في الغرفة الباردة تحت الإثارة لطيف. تمييع الأجسام المضادة (على سبيل المثال، 1: 1000 لمكافحة ATP5A و -NDUFB6) في بسا / تبست.
      ملاحظة: معظم الأجسام المضادة تعطي إشارة أفضل على الأغشية من المواد الهلامية الأصلية عندما احتضنت بين عشية وضحاها.
    6. غسل الغشاء لمدة 10 دقيقة مع تبست تحت التحريض لطيف.
    7. احتضان مع الأجسام المضادة الثانوية لمدة لا تقل عن 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة الانفعالات لطيف لطيف. تمييع الأجسام المضادة (1: 5،000 إلى 1: 50،000) في المواد الصلبة الحليب / تبست.
    8. غسل الغشاء 3 مرات لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع تبست ونر التحريض لطيف.
    9. خلال غسل الماضي، وإعداد تعزيز تلألؤ كيميائي (إكل) الركيزة وفقا لتعليمات مانوفاcturer.
    10. احتضان الغشاء مع الركيزة إكل باستخدام التعليمات المقدمة من قبل الشركة المصنعة.
    11. كشف إشارة على الفيلم باستخدام التعليمات المقدمة من قبل الشركة المصنعة للركيزة إكل.

5. إليكترولوتيون

  1. تجهيز.
    1. إعداد عازلة شطف من 25 ملي تريسين، 3.75 إم إيميدازول (درجة الحموضة 7.0 في 4 درجات مئوية)، و 5 ملي حمض 6-أمينوهيكسانويك.
      ملاحظة: ارتداء قفازات في جميع الأوقات أثناء التعامل مع إليكترويلوتر و غشاء قبعات لمنع التلوث مع البروتينات الخارجية.
  2. في اليوم قبل استخدام الكهربائي إليكتروليوتيون الأصلي، تنفيذ ما يلي:
    1. نقع غشاء قبعات (قطع: 3.5 كيلو دالتون) في العازلة شطف لمدة 1 ساعة عند 60 درجة مئوية. نقل القبعات إلى العازلة شطف جديدة ونقع لهم لمدة 12 ساعة أو أكثر في الثلاجة.
      ملاحظة: الوزن الجزيئي قطع 3.5 كيلو دالتون يمنع فقدان ص صغيرالروتينات التي قد تنفصل بسهولة عن مجمع البروتين من الفائدة.
    2. غسل وحدة الكهربائي، أنابيب الزجاج، خزان، وغطاء جيدا مع الإيثانول. شطف بالماء والسماح للجافة المعدات.
  3. في يوم إليكترلوتيون الأصلي، القيام بما يلي.
    1. وضع فريت في الجزء السفلي (بلوري) من كل أنبوب زجاجي لاستخدامها. إذا لزم الأمر، ضع أنبوب الزجاج في العازلة شطف ودفع فريت من الداخل إلى أسفل الأنبوب.
    2. دفع أنبوب الزجاج مع فريت في وحدة من إليكترويلوتر. الرطب جروميت مع شطف العازلة والانزلاق في أنبوب زجاجي في المكان. تأكد من أن قمم أنابيب الزجاج حتى مع جروميت.
    3. إغلاق الحلقات فارغة مع سدادات.
    4. وضع غطاء غشاء رطب في الجزء السفلي من محول سيليكون وملء محول مع شطف العازلة. ببطء ماصة المخزن المؤقت في محول صعودا وهبوطا لإزالة أي فقاعات الهواء حول غشاء غسيل الكلى.
    5. حرك المحول مملوء بالعازل إلى الجزء السفلي من الأنبوب الزجاجي. إزالة جميع الفقاعات التي تظهر على فريت داخل أنبوب زجاجي.
    6. ملء كل أنبوب زجاجي مع شطف عازلة.
    7. وضع العصابات استئصال من بن صفحة في أنابيب الزجاج (انظر الخطوة 1.2.9.3). قطع قطع كبيرة إلى قطع أصغر. تأكد من أن ارتفاع التعبئة داخل أنبوب زجاجي حوالي 1 سم.
    8. وضع وحدة بأكملها في الخزان.
    9. إضافة حوالي 600 مل من العازلة شطف الباردة إلى الخزان. تأكد من أن قبعات محول السيليكون في المخزن المؤقت لمنع فقاعات في غشاء غسيل الكلى.
    10. وضع شريط ضجة في الجزء السفلي من الخزان.
      ملاحظة: سوف التحريك منع فقاعات من الالتصاق إلى الجزء السفلي من غشاء غسيل الكلى.
    11. أزل البروتينات لمدة 4 ساعات في 350 V في غرفة باردة.
    12. بعد الانتهاء من شطف، وإزالة وحدة الكهربي من خزان العازلة ووضعه في بالوعة أو وعاء.
    13. إذا تم استخدام سدادة، وإزالته إلى درافي غرفة عازلة العليا. خلاف ذلك، استخدام ماصة كبيرة لإزالة المخزن المؤقت.
    14. إزالة المخزن المؤقت من كل أنبوب زجاجي وتجاهل. تأكد من أن محول السيليكون يبقى في مكان وأن السائل تحت فريت ليست بالانزعاج أو اهتزت.
    15. إزالة بعناية محول سيليكون، جنبا إلى جنب مع غطاء غشاء من الجزء السفلي من أنبوب زجاجي. ماصة المحتوى (حوالي 400 ميكرولتر) من غطاء سيليكون في ميكروتوب. مع آخر 200 ميكرولتر من شطف العازلة، وشطف غطاء السيليكون وإضافة إلى ميكروتوب. كرر لجميع أنابيب الزجاج.
    16. كما يمكن إعادة استخدام قبعات الغشاء، والحفاظ على قبعات الغشاء عن طريق وضعها في العازلة شطف تحتوي على 0.5 ملغ / مل أزيد الصوديوم. تبريدها.
      ملاحظة: شطافة لديها تركيز البروتين منخفضة ويمكن أن تتركز باستخدام أجهزة تصفية الطرد المركزي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لتصور سوبيركومبلكسس الميتوكوندريا، تم استخدام الميتوكوندريا المعزولة حديثا من الفئران 17 ، 18 . الميتوكوندريا سوبيركومبلكسس حساسة لدورات متكررة من التجمد والذوبان، مما يؤدي إلى تفككهم، على الرغم من أن هذا قد يكون مقبولا بالنسبة لبعض الباحثين. إذا كان التجميد ضروري للتخزين، لضمان أفضل النتائج، وينبغي أن العينات لا تخضع لأكثر من دورة واحدة من التجمد والذوبان.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

و إتك وظيفية ضروري لتوليد أتب الميتوكوندريا. مجمعات إتك قادرة على تشكيل نوعين من سوبيركومبليكسس: ريسبراسوميس (سك-I، -III، و- إيف) 1 و سينثاسوميس (سك-V) 2 . التجمع من كل مجمع مطلوب ل إتك سليمة، في حين يعتقد أن تنظيم إتك في سوبيركومبلكسس لزيادة كفاءة إتك الشاملة 5 ، 22 . كيف أن هذه سوبيركومبلكسس تجميع وتفكيك ليست مفهومة جيدا، ولكن البروتوكولات المعروضة هنا قد تسمح لفهم أفضل لهذ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من مؤسسة مؤسس جمعية القلب الأمريكية [12GRNT12060233] ومركز أبحاث الأطفال القوي في جامعة روتشستر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
غرفة الجل الصغيرة Protean IIBiorad1658004مجموعة كاملة لصب وتشغيل الرحلان الكهربائي الهلام
الصغير Protean XL Maxi-gelBiorad1653189مجموعة كاملة لصب وتشغيل ماكسي هلام الرحلان الكهربائي
صانع التدرج ، Hoefer SG15VWR95044-704صب تدرجات هلام صغيرة
صانع التدرج ، ماكسي جلVWRGM-100صب ماكسي جل
طقم نقلBiorad1703930مجموعة كاملة للنقل الرطب للبروتينات على الأغشية
نموذج Electroeluter موديل 422Biorad1652976الشطف الكهربائي للبروتينات من الصفحات الأصلية أو SDS PAGES
الألواح الزجاجية Biorad1653308الألواح القصيرة
الألواح الزجاجيةBiorad1653312Spacer
الألواح الزجاجيةBiorad1651823الألواح الداخلية
الألواح الزجاجية Biorad1651824الألواح الخارجية
مزود الطاقةBiorad1645070مصدر الطاقة مناسب للرحلان الكهربائي الأصلي
ECL-Western & nbsp ؛Thermo Scientific32209الركيزة الكيميائية
SuperSignal-West DuraThermo Scientific34075ركيزة كيميائية محسنة
فيلم / تصوير شعاعيذاتي فيلم GE الرعاية الصحية28906845توثيق البقع الغربية
معالج فيلم CP1000AgfaNC0872640
Canon Power Shot 640 & nbsp ؛CanonNAالتقاط الصور لتوثيق المواد الهلامية والأغشية والبثور.
الكاميرا Canon Power Shot 640 من Canonللصور التي يتم التقاطها على طاولة ضوئية
أكريلاميد / بيساكريلاميدBiorad1610148محلول مخلوط مسبقا بنسبة 40٪
جلايسينسيجماG7403
SDS (كبريتات دوديسيل الصوديوم)Invitrogen15525-017
Tris-baseSigmaT1503Buffer
TricineSigmaT0377
منظف ديوكسي كلات الصوديومسيجماD66750منظف
EDTASigmaE5134
السكروزسيجماS9378
MOPSSigmaM1254Buffer
ImidazoleSigmaI15513Buffer
Lauryl maltosideSigmaD4641منظف
Coomassie G250Biorad161-0406
حمض أمينوهيكسانويكSigmaO7260
أصلي  طقم الوزن الجزيئيGE الرعاية الصحية 17-0445-01مجموعة كاليبريشن عالية الوزن الجزيئي للرحلان الكهربائي الأصلي.
nameCompany Catalog NumberComments
NADHSigmaN4505
Nitroblue tetrazoliumSigmaN6639
Tris HClSigmaT3253
ATP   سيجماA2383
<قوي>الاسمCompany Catalog NumberComments
Lead (II) نترات (Pb(NO3)2):Sigma228621
OligomycinSigmaO4876
الاسم< / strong>الشركة< / strong> رقم الكتالوج< / strong>تعليقات< / strong>
Ponceau SSigmaP3504
المضاد ل ATP5AAbcamab14748الوحدة الفرعية ATP synthase ATP5A
NDUFB6Abcamab110244الجسم المضاد للوحدة الفرعية Cx-1 NDUFB6
المضاد ل VDACكالبيوكيم529534الجسم المضاد ل VDAC
ECL HRP الجسم المضاد المرتبطGE Health CareNA931Vبالجسم المضاد الثانوي ل ATP5A و NDUFB6 و VDAC
كاشف حجبBiorad170-6404
BSA
كلوريد الصوديومSigmaS9888
كلوريد البوتاسيومSigmaP9541
EGTASigmaE3889
NameCompany Catalog NumberComments
Silver تلطيخ KitInvitrogenLC6070
التدرجات غطاء كاميرا حماية المضادة ل

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lenaz, G., Genova, M. L. Supramolecular organisation of the mitochondrial respiratory chain: a new challenge for the mechanism and control of oxidative phosphorylation. Adv Exp Med Biol. 748, 107-144 (2012).
  2. Saks, V., et al. Intracellular Energetic Units regulate metabolism in cardiac cells. J Mol Cell Cardiol. 52 (2), 419-436 (2012).
  3. Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis. Anal Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).
  4. Wittig, I., Schagger, H. Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions. Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).
  5. Genova, M. L., Lenaz, G. Functional role of mitochondrial respiratory supercomplexes. Biochim Biophys Acta. 1837 (4), 427-443 (2014).
  6. Hahn, A., et al. Structure of a Complete ATP Synthase Dimer Reveals the Molecular Basis of Inner Mitochondrial Membrane Morphology. Molecular cell. 63 (3), 445-456 (2016).
  7. Strauss, M., Hofhaus, G., Schroder, R. R., Kuhlbrandt, W. Dimer ribbons of ATP synthase shape the inner mitochondrial membrane. EMBO J. 27 (7), 1154-1160 (2008).
  8. Beutner, G., Eliseev, R. A., Porter, G. A. Initiation of electron transport chain activity in the embryonic heart coincides with the activation of mitochondrial complex 1 and the formation of supercomplexes. PloS one. 9 (11), e113330(2014).
  9. Genova, M. L., Lenaz, G. The Interplay Between Respiratory Supercomplexes and ROS in Aging. Antioxid Redox Signal. 23 (3), 208-238 (2015).
  10. Rosca, M. G., et al. Cardiac mitochondria in heart failure: decrease in respirasomes and oxidative phosphorylation. Cardiovasc Res. 80 (1), 30-39 (2008).
  11. Kuter, K., et al. Adaptation within mitochondrial oxidative phosphorylation supercomplexes and membrane viscosity during degeneration of dopaminergic neurons in an animal model of early Parkinson's disease. Biochim Biophys Acta. 1862 (4), 741-753 (2016).
  12. Wittig, I., Karas, M., Schagger, H. High resolution clear native electrophoresis for in-gel functional assays and fluorescence studies of membrane protein complexes. Mol Cell Proteomics. 6 (7), 1215-1225 (2007).
  13. Fiala, G. J., Schamel, W. W., Blumenthal, B. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates. J Vis Exp. (48), (2011).
  14. Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A., Enriquez, J. A. Respiratory active mitochondrial supercomplexes. Molecular cell. 32 (4), 529-539 (2008).
  15. Dudkina, N. V., Eubel, H., Keegstra, W., Boekema, E. J., Braun, H. P. Structure of a mitochondrial supercomplex formed by respiratory-chain complexes I and III. Proc Nat Acad Sci USA. 102 (9), 3225-3229 (2005).
  16. Giorgio, V., et al. Dimers of mitochondrial ATP synthase form the permeability transition pore. Proc Nat Acad Sci USA. 110 (15), 5887-5892 (2013).
  17. Beutner, G., Sharma, V. K., Giovannucci, D. R., Yule, D. I., Sheu, S. S. Identification of a ryanodine receptor in rat heart mitochondria. J Biol Chem. 276 (24), 21482-21488 (2001).
  18. Rehncrona, S., Mela, L., Siesjo, B. K. Recovery of brain mitochondrial function in the rat after complete and incomplete cerebral ischemia. Stroke. 10 (4), 437-446 (1979).
  19. Schagger, H. Blue-native gels to isolate protein complexes from mitochondria. Methods Cell Biol. 65, 231-244 (2001).
  20. Althoff, T., Mills, D. J., Popot, J. L., Kuhlbrandt, W. Arrangement of electron transport chain components in bovine mitochondrial supercomplex I1III2IV1. EMBO J. 30 (22), 4652-4664 (2011).
  21. Schafer, E., et al. Architecture of active mammalian respiratory chain supercomplexes. J Biol Chem. 281 (22), 15370-15375 (2006).
  22. Wittig, I., Schagger, H. Supramolecular organization of ATP synthase and respiratory chain in mitochondrial membranes. Biochim Biophys Acta. 1787 (6), 672-680 (2009).
  23. Davies, K. M., et al. Macromolecular organization of ATP synthase and complex I in whole mitochondria. Proc Nat Acad Sci USA. 108 (34), 14121-14126 (2011).
  24. Lapuente-Brun, E., et al. Supercomplex assembly determines electron flux in the mitochondrial electron transport chain. Science. 340 (6140), 1567-1570 (2013).
  25. Antonioli, P., Bachi, A., Fasoli, E., Righetti, P. G. Efficient removal of DNA from proteomic samples prior to two-dimensional map analysis. J Chromatogr A. 1216 (17), 3606-3612 (2009).
  26. Wittig, I., Carrozzo, R., Santorelli, F. M., Schagger, H. Functional assays in high-resolution clear native gels to quantify mitochondrial complexes in human biopsies and cell lines. Electrophoresis. 28 (21), 3811-3820 (2007).
  27. Glancy, B., Balaban, R. S. Protein composition and function of red and white skeletal muscle mitochondria. Am J Physiol Cell Physiol. 300 (6), C1280-C1290 (2011).
  28. Wittig, I., Beckhaus, T., Wumaier, Z., Karas, M., Schagger, H. Mass estimation of native proteins by blue native electrophoresis: principles and practical hints. Mol Cell Proteomics. 9 (10), 2149-2161 (2010).
  29. Alavian, K. N., et al. An uncoupling channel within the c-subunit ring of the F1FO ATP synthase is the mitochondrial permeability transition pore. Proc Nat Acad Sci USA. 111 (29), 10580-10585 (2014).
  30. Chance, B., Williams, G. R. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. IV. The respiratory chain. J Biol Chem. 217 (1), 429-438 (1955).
  31. Zickermann, V., et al. Structural biology. Mechanistic insight from the crystal structure of mitochondrial complex I. Science. 347 (6217), 44-49 (2015).
  32. Zhu, J., Vinothkumar, K. R., Hirst, J. Structure of mammalian respiratory complex I. Nature. 536 (7616), 354-358 (2016).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Mitochondrial SupercomplexesBlue Native PAGEImmunoblottingProtein Complex AssemblyMitochondrial BiologyMitochondrial Isolation

مقالات ذات صلة