Method Article

تنقية البروتينات السطحية للبروتينات الخلية من ريبيسفالوس ميكروبلوس الخلايا الظهارية الظهارية

DOI:

10.3791/55747

⸱

July 23rd, 2017

 ,  , 
1Queensland Alliance for Agriculture & Food Innovation, The University of Queensland, 2Centre for Comparative Genomics, Murdoch University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم استخدام منهجية تعديل التدرج الطرد المركزي الكثافة المعدلة لعزل الخلايا الظهارية من الأنسجة ريفيسفالوس ميكروبلوس الأمعاء. والبروتينات سطح ملزمة كانت البيروكسيديز وتنقيته من خلال الخرز المغناطيسي ستريبتافيدين لاستخدامها في التطبيقات المصب.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

رابيسيفالوس ميكروبلوس - علامة الماشية - هو الطفيليات الخارجية الأكثر أهمية من حيث الأثر الاقتصادي على الثروة الحيوانية كمتجه لعدة مسببات الأمراض. وقد تم تكريس الجهود لمراقبة الماشية من أجل الحد من آثاره الضارة، مع التركيز على اكتشاف المرشحين اللقاح، مثل BM86، وتقع على سطح الخلايا الظهارية الأمعاء القراد. وتركز البحوث الحالية على استخدام كدنا والمكتبات الجينومية، للكشف عن المرشحين اللقاح الآخرين. عزل خلايا القناة الهضمية القراد يشكل ميزة هامة في التحقيق في تكوين البروتينات السطحية على غشاء الخلايا الهضمية القراد. هذه الورقة تشكل طريقة جديدة وقابلة للتنفيذ لعزل الخلايا الظهارية، من محتويات القناة الهضمية القراد من شبه محفور R. ميكروبلوس. يستخدم هذا البروتوكول تسيب و إدتا للافراج عن الخلايا الظهارية من الأنسجة دعم تحت الظهارية وتقطيع الكثافة الطرد المركزي المتقطعنت لفصل الخلايا الظهارية من أنواع الخلايا الأخرى. وكانت البروتينات السطحية الخلية البيروكسيديز ومعزولة من الخلايا الظهارية الأمعاء القراد، وذلك باستخدام الخرز المغناطيسي مرتبطة ستريبتافيدين السماح للتطبيقات المصب في فاكس أو لك-مس / MS- التحليل.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

و رابيسيفالوس ميكروبلوس ، علامة الماشية، هو الطفيليات الخارجية الأكثر أهمية من حيث الأثر الاقتصادي على صناعة الماشية في المناطق الاستوائية وشبه الاستوائية كما أنها تتجه حمى القراد البقري (بابيسيوسيس)، أنابلاسموسيس و بيروبلاسموسيس الخيول 1 ، 2 ، 3 ، 4 . وقد تم تكريس الجهود لمراقبة رقعة الماشية، لتقليل التأثير الضار، إلا أن الطرق التقليدية مثل استخدام مبيدات الكيماويات الكيميائية لها عيوب ضمنية، مثل وجود مخلفات كيميائية في الحليب واللحوم، والزيادة في انتشار القراد المقاوم كيميائيا

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تشريح ظهارة الأمعاء من R. ميكروبلوس

  1. جمع القراد شبه انغورجد من الماشية في يوم التجربة. تشريح القراد في غضون 24 ساعة بعد إزالة من المضيف.
  2. التمسك شريط من شريط لاصق إلى الجزء السفلي من 92 ملم × 16 مم طبق بتري. إضافة قطرة من الغراء عظمى على الشريط. وضع القراد، الجانب البطني إلى أسفل على الغراء عظمى، والسماح لتجف لمدة 2 دقيقة.
  3. صب 100 مل من ال....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم عزل الخلايا الظهارية من أنسجة الأمعاء من R. ميكروبلوس وفقا للتخطيطي المقدمة في الشكل 1 . وترد مضان صور مضان المجهري من القراد الأمعاء الخلايا الظهارية أعدت باستخدام هذا البروتوكول في الشكل 2A و 2 باء. كما يتم إجراء العزلة الخلية على شبه محفور R. ميكروبلوس، تظهر الخلايا كما المفرد، كروية،.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتشكل إصابات القراد الماشية مشكلة رئيسية في صناعة الماشية في المناطق المدارية وشبه الاستوائية في العالم، حيث تعتمد الطريقة الأكثر شيوعا للسيطرة على استخدام مبيدات أكاريدس 1 ، 4 . تم تحديد Bm86 سابقا ضمن سطح الظهارة الأمعاء الظهارية كمستضد واقية ضد R. ميكروبلوس الإصابة 10 ، مع نجاح محدود كاستراتيجية لقاح بسبب Bm86 الاختلاف تسلسل الجغرافية ومتطلبات تعزيز العادية 4 .

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويود المؤلفون أن يشكروا مستعمرة بيوسكوريتي تيك كولوني (إدارة ولاية كوينزلاند للزراعة ومصائد الأسماك في أستراليا) على توفير علامات ميكروبلوس ريبيسفالوس المستخدمة لهذه الدراسة، ولوكاس كاربانويتز للمساعدة في تصوير الفيديو.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.4٪ تريبان بلوثيرموفيشر 15250061
1.5 مل أنبوب الطرد المركزي الدقيقEppendorf3322
100 ملي مولار كربونات عازلة3.03 جم Na2CO3 ، 6.0 جم NaHCO3 1000 مل الماء المقطر درجة الحموضة 9.6
16 مل أنابيب الطرد المركزي مع غطاء مانع للتسربThermo Scientific3138-0016بارد في الجليد قبل التدرج
250 & micro ؛ مصفاة الخلية MThermo Fisher87791
3،3 & prime ؛ 5،5 & -tetramethylbenzidine (TMB) نظام الركيزة السائلة ل ELISASigmaT0440المخزنة في 4C
30٪ بيروكسيد الهيدروجينLabsceneBSPA5.500
4-20٪ Tris-MOPS GelGen ScriptM42015
4-Chloro-1-Nepalthol TabletSigma-AldrichC6788
50 مل أنبوب فالكونكورنينج بلو30 × 115 مم. أنبوب مخروطي البولي بروبلين.
70 وميكرو ؛ مصفاة خلية MBD Falcon352350
AP15 ورق ترشيحMilliporeAO1504200
Biotin (النوع A) طقم الاقترانAbcamAb102865
مجهر تشريحأوليمبوسSZX7
DP Manager   ؛أوليمبوس2.2.1.195برنامج صور الخلية
شريط لاصقهوم بارع48 مم × 25 مم شريط لاصق
Dulbecco s معدل النسر المتوسطGibco11995-065DMEM - الجليد البارد للبروتوكول
EDTAAmresco0105-500G
F96 Maxisorp Immuno PlateNunc439454
مصل الأبقار الجنينيSigma-Aldrich12003CFCS
مجهر مضان    أوليمبوس BX51
Fluoroshield مع DAPISigma-AldrichF6057-20MLDAPI
ComppsDumont# 9 Dumont - Switerzland
GlycerolSigma-AldrichG5516Glycerol للبيولوجيا الجزيئية >99٪
GlycineSigma-Aldrich410225
مكاتبعداد محمول باليديعمل JA0376230
هانك s محلول الملح المتوازنSigma Life SciencesH9394HBSS & ndash ؛ الجليد البارد للبروتوكول
الدمOptik Lakor-
L-Glutathione المؤكسدSigma-AldrichG4376
حامل الفصلالمغناطيسي Novagen-4-Tubeالفصل المغناطيسي
الميثانولسيجما-ألدريتش179337
Milli-Q WaterMilliporeZRXQ003WW نظام تنقية المياه المتكامل لغشاء
النيتروسليلوزللمياه علوم الحياة6648530 سم × 3 م غشاء النيتروسليلوز النقي
PageRuler سلم البروتين الملونThermo-FisherSM0671
PBS1.16 جم Na2HPO4 ، 0.1 جم KCl ، 0.1 جم K3PO4 ، 4.0 جم كلوريد الصوديوم (500 مل ماء مقطر) درجة الحموضة 7.4
PercollSigma-AldrichP1644-500ML
مضخة التمعجMasterflex7518-10
حمض الفوسفوريكSigma-AldrichP6560
بيرس خال من البروتين T20 PBS حجب العازلةالحراريةالعلمية 37573مخزنة عند 4 درجة مئوية.
مانع مانع البروتيازالعازلة Sigma-AldrichP8215-5MLالموافقة المسبقة عن علم – مخزنة في -20 &DG; < / b>C
بداية سريعة كاشف صبغ برادفورد 1xBiorad500-0205لفحص برادفورد
بدء سريع معايير BSAمعايير Biorad500-0207BSA لمختبر مشرط برادفورد
.11 مشرط
SilverQuest TM طقم تلطيخInvitrogenLC6070
Simply Blue TM Safe Stain   ؛InvitrogenLC6060
Sorvall C6 + أجهزة الطرد المركزيالفائقة الحرارة العلمية46910
ستربتافيدين (HRP) AbcamAB7403
Streptavidin الخرز المغناطيسينيو إنجلاند BiolabsS1420S
Super Glue - فائق السرعة MiniUHUUHU Super Glue 1 mg. جهاز طرد مركزي صغير سريع
Eppendorf22331
TCEPثيرمو فيشر20490
تريتون X-100بيوراد161-0407
توين -20سيجماP2287-500 مل
دوامة خلاطRatekVM1
منحة حمام مائيGD100
مقياس رف عالي النقاء كوكتيل للمعاشر مقاس مشترك للغاية

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rodriguez-Valle, M., et al. Efficacy of Rhipicephalus (Boophilus) microplus Bm86 against Hyalomma dromedarii and Amblyomma cajennense tick infestations in camels and cattle. Vaccine. 30, 3453-3458 (2012).
  2. De Rose, R., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Rhipicephalus microplusEpithelial Gut CellsBiotinylated Cell Surface ProteinsPercoll GradientStreptavidin Magnetic BeadsCell Surface Protein IsolationTick Gut Epithelial CellsFluorescence MicroscopySDS PAGE AnalysisELISA Detection

Related Articles