مقالة منهجية

في المختبر تمايز الخلايا الجذعية البشرية الوسيطة إلى الفنية كارديوميوسيتي مثل الخلايا

DOI:

10.3791/55757

⸱

أغسطس 9, 2017

 ,  ,  , 
1Create Fertility Centre, 2Department of Physiology, University of Toronto, 3Department of Obstetrics and Gynecology, University of Toronto, 4Department of Physiology, University of Toronto, 5Department of Obstetrics and Gynecology, Women's College Hospital

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا، فإننا نقدم أسلوباً لكفاءة الاستفادة من إمكانات التمايز القلب الشباب مصادر الخلايا الجذعية الوسيطة البشرية بغية توليد خلايا وظيفية، المتعاقدة، مثل كارديوميوسيتي في المختبر.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

احتشاء عضلة القلب وتتالي الدماغية اللاحقة يؤدي إلى خسائر كبيرة في cardiomyocytes، مما يؤدي إلى فشل القلب الاحتقاني، السبب الرئيسي للوفيات في جميع أنحاء العالم. الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) خيار واعدة للعلاجات المستندة إلى خلية ليحل محل التقنيات الحالية، والغازية. MSCs يمكن أن تفرق في الأنساب الوسيطة، بما في ذلك أنواع خلايا القلب، ولكن كاملة التمايز إلى خلايا وظيفية لم يتحقق حتى الآن. تستند الأساليب السابقة للتمييز بين وكلاء الدوائية أو عوامل النمو. ومع ذلك، أيضا تمكين الاستراتيجيات ذات الصلة أكثر فسيولوجيا MSCs على الخضوع للتحول كارديوميوجينيك. نقدم هنا، أسلوب تمايز استخدام المجاميع ماجستير في كارديوميوسيتي تغذية الطبقات لإنتاج خلايا المتعاقدة مثل كارديوميوسيتي.

الحبل السري البشري ارتشاح الخلايا (هوكبفكس) تبين أن يكون تفريق أكبر محتملة من التحقيق عادة أنواع لجنة السلامة البحرية، مثل نخاع العظم MSCs (بمسكس). كمصدر أونتوجينيتيكالي أصغر، نحن التحقيق في إمكانية كارديوميوجينيك من هوكبفكس (FTM) الاثلوث الأول مقارنة بالمصادر القديمة. هوكبفكس FTM هي مصدر الرواية، غنية من MSCs التي تحتفظ في الرحم إيمونوبريفيليجيد خصائصها عند مثقف في المختبر. استخدام هذا البروتوكول التمايز و FTM ومصطلح هوكبفكس تحقيق التمايز كارديوميوجينيك زيادة كبيرة بالمقارنة مع بمسكس، كما يتضح من زيادة التعبير عن علامات كارديوميوسيتي (عامل محسن ميوسيتيأي، ج 2، القلب تروبونين تي وسلسلة ثقيلة القلب الميوسين، إشارة α البروتين التنظيمي وكونيكسين 43). وأكدوا أيضا الاستمناع أقل بكثير، كما ثبت بانخفاض هلا-بالتعبير والتعبير هلا-ز أعلى. تطبيق التمايز القائم على التجميع، أظهر هوكبفكس FTM تشكيل إجمالي الزيادة المحتملة وولدت المتعاقدة كتل الخلايا ضمن أسبوع الثقافة المشارك في طبقات تغذية القلب، ليصبح أول نوع لجنة السلامة البحرية للقيام بذلك.

نتائجنا تثبت أن هذا التمايز استراتيجية يمكن فعالية تسخير إمكانات كارديوميوجينيك MSCs الشباب، مثل هوكبفكس FTM، ويوحي بأن في المختبر قبل المفاضلة يمكن أن تكون استراتيجية محتملة لزيادة على فعالية التجدد في فيفو.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فشل القلب الاحتقاني (CHF) ما زال قائما كسبب رئيسي للإصابة بالأمراض والوفيات في جميع أنحاء العالم. وكثيراً ما يحدث فرنك سويسري عقب الخسارة الهائلة في cardiomyocytes وتطوير ندبا خالية من الخلية نتيجة مرضية ل احتشاء عضلة القلب (ميتشيغن)1. بينما القلب جهاز جزئيا تجديد ذاتي، يقلل المقيم الجذعية والسلف خلية المسبح المسؤولة عن تنفيذ تجديد الأنسجة إلى حد كبير في وفرة ووظيفتها في المرضى الذين تتراوح أعمارهم بين، غالباً ما تصبح غير كافية للاسترداد الأمثل بعد الإصابة. وهكذا، هناك اهتمام كبير في تطوير العلاجات التجريبية التي تنطوي على زرع خلايا صحية من الجهات المانحة في عضلة القلب التالفة. من المحتم أن الخلايا المانحة ليس فقط استعادة هيكل الأنسجة، ولكن أيضا تحقيق الانتعاش الوظيفية لعضلة القلب المتضررة.

قلب الأم توظف المقيمين أنسجة القلب والخلايا الجذعية نخاع العظام نشأت الذاتية للإصابة بعد إصلاح2،،من34. التجدد تستمد الخلايا المضيفة والجهات المانحة على حد سواء يجب أن تملك القدرة على الحصول على النمط الظاهري المناسب والدالة في المكروية لعضلة القلب يعيد البناء، جنبا إلى جنب مع القدرة على كفاءة وأمان تحل محل الخلايا المفقودة. وقد استخدمت أساليب المفاضلة في المختبر على نطاق واسع لتحقيق كارديوميوسيتي ذات الكفاءة العالية، ويستند إلى الخلية الجذعية إنتاج5،6. التشكيل الجانبي للتعبير من علامات النسب القلب يستخدم لتعريف عملية تمايز الخلايا الجذعية نحو النسب القلب7. أوائل التمايز علامات، مثل NKX2.5، ميوسيتي محسن عامل ج 2 (Mef2c)، و8،GATA49، يمكن أن يكون مؤشرا على بدء عملية كارديوميوجينيك. علامات كارديوميوسيتي الناضجة تستخدم عادة لتقييم فعالية التمايز هي إشارة البروتين التنظيمي α (سيربا)10القلب تروبونين تي (كتنت)11، وسلسلة ثقيلة القلب الميوسين (MYH6)8،،من1213وكونيكسين 43 (Cx43)14،،من1516. تم أساليب استخدام الخلايا الجذعية الجنينية (بتوليدا) والخلايا الجذعية pluripotent (PSCs) دقة الأمثل ومناقشتها بشأن تفاصيل العوامل الاستقرائية والأكسجين والمغذيات التدرجات، والتوقيت الدقيق للعمل5،،من67،،من1718. ومع ذلك، تقديم التكنولوجيات القائمة على ESC ومجلس السلام والأمن لا تزال الشواغل الأخلاقية وسلامة متعددة، جنبا إلى جنب مع ميزات الكهربية والمناعية الأمثل19،20. يستضيف زرع هذه الخلايا غالباً ما تجربة إيمونوريجيكتيون وتتطلب الكبت المناعي الدائمة. وهذا يرجع أساسا إلى غير متطابقة histocompatibility الرئيسية المعقدة جزيئات (MHC) في البلدان المضيفة والمانحة، وإلى استجابة تي خلية الناتج21. بينما MHC الفردية الفئة الأولى مطابقة حل ممكن، تتطلب ممارسة سريرية أكثر يسرا مصدر خلية عالمياً إيمونوبريفيليجيد للتغلب على قلق الرفض.

كمصدر لخلايا بديلة للاستخدام في التطبيقات السريرية، MSCs وخاصة، بمسكس، قد حقق لاستخدامها في تجديد الأنسجة منذ الوصف الأولى في عام 199522. ويعتقد أن الخلايا التجدد المقيمين التي يمكن العثور عليها في ما يقرب من أي أنسجة vascularized23MSCs. عند عزلة من المصدر المطلوب، MSCs يمكن توسيعها بسهولة في الثقافة، ولديها القدرة paracrine واسعة النطاق، وكثيراً ما تملك إيمونوبريفيليجيد أو إيمونومودولاتوري خصائص24،25. سلامتهم ونجاعة الفعل ثبت في العديد من الدراسات ما قبل السريرية، لا سيما لإنعاش القلب3،26.

استخدام العديد من استراتيجيات التمايز MSC وكلاء الدوائية، مثل 5-أزاسيتيديني22 و [دمس]27، والنمو أو morphogenic عوامل، مثل BMPs5،7،،من2829 أو انجيوتنسين الثاني30، مع كفاءة متغير. هذه الاستراتيجيات، ومع ذلك، لا تقوم على العقبات التي خلية التجدد ساذجة من المرجح أن تواجه بعد صاروخ موجه أو يجري تسليمها إلى موقع الإصابة المجراة في. الاستراتيجيات ذات الصلة أكثر من الناحية الفسيولوجية، بينما من الصعب تحديد والتلاعب، تستند إلى الافتراض بأن التمايز ماجستير يمكن أن يتسبب من خلال إشارات من المكروية الأنسجة نفسها. الدراسات السابقة قد أظهرت أن التعرض لخلايا القلب ليساتيس31 أو32،عضلة القلب البطين33، أو توجيه الاتصال مع كارديوميوسيتيس الأولية في المختبر15،34، يمكن زيادة التعبير عن علامات القلب في MSCs. الآخرين أثبتت كارديوميوجينيسيس عفوية بعد علاج إصابات القلب مع MSCs35،36،،من3738، على الرغم من أن في جزء منه، تولد الانصهار من بمسكس وكارديوميوسيتيس،من3940 عضلة القلب الوليدة. على حد علمنا، كارديوميوسيتيس الوظيفية، المتعاقدة عفويا من MSCs البشرية (همسكس) من أي مصدر الأنسجة لم تم تبلغ بعد.

توافق الآراء الحالي أن MSCs كافة تنشأ من ارتشاح الخلايا23. يمكن أن يكون الشباب MSCs مع خصائص بيريسيتي المعزولة من منطقة ارتشاح في الحبل السري البشري الأنسجة41،،من4243. بالمقارنة مع بمسكس، تمتلك هوكبفكس احتمال ازدياد التمايز والعديد من المزايا الأخرى التجدد، على حد سواء في المختبر41،44 و في فيفو45،،من4647. جدير بالذكر أن المصدر يجري على واجهة الأم الجنين، قد هوكبفكس الاستمناع أقل بكثير مقارنة بمصادر الكبار من MSCs. ابحاثنا ويركز على توصيف وتطبيقات ما قبل السريرية من FTM هوكبفكس، مصدر أصغر من التحقيق، MSCs التي أثبتنا سابقا بزيادة مولتيلينيجي التكاثري وأعلى تمايز القدرات، بما في ذلك في النسب كارديوميوجينيك41.

نقدم هنا، بروتوكول يجمع بين تشكيل التجميعية وخلية القلب الابتدائي تغذية الطبقات كما تقدم قوات الاستقرائي لتحقيق التمايز كارديوميوجينيك كاملة من MSCs. المجاميع بيئة ثلاثية الأبعاد، ونماذج أفضل الشروط في فيفو مقارنة بالثقافات ملتصقة 2D. استخدام طبقات تغذية القلب يوفر بيئة ممثل الموقع زرع الأعضاء في نهاية المطاف MSCs. نظهر أن مصادر الأصغر سنا من MSCs المعزولة من حبل السرة قبل أو بعد الولادة لها قدرة أعلى لمجاميع النموذج والوصول إلى النمط الظاهري القلب بالمقارنة مع بمسكس الكبار، مع الحفاظ على جهاز المناعة-الامتياز. إلى جانب ارتفاع حاد النسب القلب علامة الجينات والتعبير المتعمد من داخل الخلايا (أي، كتنت و MYH6) والبروتينات على سطح الخلية (أي، سيربا و Cx43) محددة ل cardiomyocytes، نحن تظهر أنه يمكن تسخير إمكانيات التمايز هوكبفكس FTM مع هذا الأسلوب، وأنها يمكن أن تؤدي إلى المقاولات كارديوميوسيتي-مثل الخلايا تلقائياً.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم إجراء جميع الدراسات التي شملت والإبلاغ عنها وفقا لإرشادات ARRIVE< sup class = "xref" >48. تم إجراء جميع الدراسات بموافقة مجلس أخلاقيات البحث المؤسسي (رقم REB 454-2011 ، معهد أبحاث Sunnybrook ؛ REB 29889 ، جامعة تورنتو ، تورنتو ، كندا). تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية من قبل لجنة رعاية التابعة لشبكة الصحة الجامعية (تورنتو ، كندا) ، وتلقت جميع رعاية إنسانية وفقا لدليل رعاية واستخدام المختبر ، الطبعة الثامنة (المعاهد الوطنية للصحة 2011).

< p class = "jove_title" >1. ثقافة الأنسجة

  1. مزرعة FTM HUCPVCs ، مصطلح HUCPVCs (تم إنشاؤه مسبقا ، ن ≥ 3 خطوط مستقلة لكل منها) < فئة sup = "xref" >42 وBMSCs المتاحة تجاريا في وسط ألفا الأساسي الأدنى (MEM) مكمل بنسبة 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) وكوكتيل بنسلين / ستربتومايسين (P / S). خلايا عضلة القلب الأولية لزراعة الفئران والثقافات المشتركة لخلايا عضلة القلب MSC في وسط النسر المعدل من Dulbecco: خليط المغذيات F-12 (DMEM-F12) يحتوي على 10٪ FBS و 1٪ P / S.
    ملاحظة: قم بتعقيم الوسط باستخدام مرشح 0.2 ميكرومتر. قم بتخزين المحاليل المتوسطة المحضرة عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 3 أسابيع.
  2. الحفاظ على مزارع الخلايا في حاضنات رطبة (95٪ رطوبة نسبية ، 37 درجة مئوية ، و 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2) والمرور عند التقاء 70-80٪ ، يتم تحديده بواسطة المجهر المتباين الطوري. استخدم كميات مناسبة من الوسط لحجم طبق زراعة الأنسجة المستخدم (على سبيل المثال ، 10 مل في طبق 10 سم و 2 مل لكل بئر في صفيحة زراعة الأنسجة المكونة من 6 آبار). استخدم شروط الثقافة هذه طوال مدة البروتوكول.
  3. قم بفصل الطبقات الأحادية MSC للمرور أو إنشاء الزراعة المشتركة لخلايا عضلة القلب MSC باستخدام محلول إنزيم التفكك (2 مل / بئر في صفيحة 6 آبار) واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 4 دقائق.
  4. انقل الخلايا المنفصلة إلى أنبوب سعة 15 مل وجهاز طرد مركزي بحجم 400 × جم لمدة 5 دقائق.
  5. استنشق المادة الطافية دون تعطيل حبيبات الخلية وأعد تعليق الخلايا في 1 مل من وسط مزرعة مناسب للعد باستخدام عداد خلية آلي. قم بزرع الخلايا كما هو موضح في أقسام البروتوكول التالية.
فئة

2. تحضير الثقافات المشتركة لخلايا عضلة القلب والخلايا الجذعية الجذعية الأولية للفئران

  1. الحصول على أنسجة القلب لعزل خلايا عضلة القلب الأولي.
    1. القتل الرحيم لصغار الفئران (5-6 أيام بعد الولادة) باستخدام اختناق ثاني أكسيد الكربون2. اضبط غرف ثاني أكسيد الكربون2 على استبدال الغاز بنسبة 20٪ (معدل التدفق = 0.2 × حجم الغرفة في الدقيقة). تأكيد الخروج من خلال عدم وجود منعكس القرصة.
    2. قم بإزالة الأذينين بالأوعية الدموية الرئيسية المتصلة باستخدام أدوات معقمة (مثل الملقط والمقص المنحني) < فئة الدعم = "xref" >41. نقل القلوب إلى أنابيب سعة 50 مل تحتوي على PBS معقم مع 1٪ P / S (PBS-P / S) على الجليد.
    3. اقطع البطينين إلى نصفين واترك الدم يغسل في طبق بحجم 10 سم مع 10 مل من PBS-P / S على الثلج. قطع جدران البطين إلى قطع صغيرة (القطر = 2-3 مم) باستخدام مقص منحني.
    4. انقل قطع القلب من 10-12 إلى أنبوب سعة 50 مل باستخدام ماصة مصلية واتركها تستقر.
    5. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من PBS-P / S دون إزالة أي قطع قلب. أضف 10 مل من PBS-P / S الجديد.
  2. هضم أنسجة القلب لعزل خلايا عضلة القلب.
    1. دع قطع القلب تستقر. استبدل PBS-P / S ب 10 مل من 0.15٪ تريبسين في PBS ورجه عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
    2. تخلص من المادة الطافية. كرر عملية الهضم الموصوفة في الخطوة 2.2.1 ثلاث مرات أخرى ، ولكن صب المواد الطافية في أنابيب تجميع سعة 50 مل تحتوي على 10 مل من FBS بنسبة 100٪.
  3. الطرد المركزي للخلايا (400 × جم ، 5 دقائق) واستنشاق المادة الطافية. أعد تعليق الخلايا في DMEM-F12 التي تحتوي على 10٪ FBS و 1٪ P / S والبذور على صفيحة من 6 آبار (1 × 105 خلايا / سم < فئة sup = "xref" >2 ، 2 مل من الوسط لكل بئر).
  4. بعد 1 ساعة ، انقل الوسط الذي يحتوي على خلايا غير متصلة إلى أنبوب سعة 50 مل وتخلص من الخلايا المرفقة. عد الخلايا المعلقة وأعد وضعها في ألواح جديدة مكونة من 6 آبار (1 × 105 خلايا / سم2 ، 2 مل من DMEM-F12 تحتوي على 10٪ FBS و 1٪ P / S لكل بئر).
  5. يمنع تكاثر الخلايا باستخدام برومودوكسيوريدين (BrdU).
    تحذير: BrdU هو مادة مسخية قوية ومشتبه في إلطفار. يرجى التأكد من توفير التدريب المناسب والرجوع إلى ورقة بيانات السلامة قبل الاستخدام.
    1. بمجرد توصيل الخلايا ، استبدل الوسط الموجود في اللوحة المكونة من 6 آبار ب DMEM-F12 الذي يحتوي على 10٪ FBS و 1٪ P / S (2 مل من الوسط لكل بئر) و 5 ميكرومتر BrdU. احتضان لمدة 16 ساعة (37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2).
    2. قم بإزالة الوسط المحتوي على BrdU واستبدله ب DMEM-F12 الذي يحتوي على 10٪ FBS و 1٪ P / S (2 مل من الوسط لكل بئر).
  6. تحضير الخلايا الجذعية الجذعية الملطخة مسبقا.
    1. بمجرد أن تصل مزارع MSC إلى 70-80٪ من التقاء في أطباق 10 سم ، قم بإزالة وسط المزرعة وأضف 3 مل من محلول تفكك الخلايا. احتضن الطبق عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 5 دقائق.
    2. انقل الخلايا المنفصلة إلى أنبوب سعة 15 مل وجهاز طرد مركزي بحجم 400 × جم لمدة 5 دقائق.
    3. استنشق المادة الطافية دون تعطيل حبيبات الخلية وأعد تعليق الخلايا في 1 مل من DMEM-F12 التي تحتوي على 10٪ FBS و 1٪ P / S للعد باستخدام عداد خلوي آلي.
    4. تمييع الخلايا إلى تركيز 1 × 106 MSC/مل من DMEM-F12 تحتوي على 10٪ FBS و 1٪ P / S.
    5. احتضان الخلايا الجذعية الجذعية بصبغة فلورية قابلة للحياة وغير قابلة للتحويل (5 ميكرومتر ، 30 دقيقة ، 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2) في أنابيب طرد مركزي سعة 1.5 مل لمدة 1 ساعة.
      6. قم
    6. بعمل الطرد المركزي للأنابيب عند 400 × جم لمدة 5 دقائق. كرر هذا ما مجموعه 3 مرات.
  7. انقل الخلايا الجذعية الجذعية إلى خلايا عضلة القلب (الخطوة 2.5.2) بتركيز 10 × 104 خلايا لكل بئر من الصفيحة المكونة من 6 آبار.
< p class = "jove_title" >3. إعداد الثقافات المشتركة المجمعة

  1. قم بإعداد معلق أحادي الخلية من الخلايا الجذعية الجذعية (2 × 104 خلايا / مل من الوسط ، ممر # ≤ 6) في alpha-MEM مكمل بنسبة 10٪ FBS و 1٪ P / S (انظر الخطوة 2.6).
    ملاحظة: راجع القسم 1 من البروتوكول لمرور الخلايا. بدلا من ذلك ، قم بتلطيخ الخلايا الجذعية الجذعية مسبقا وفقا للخطوة 2.6.
  2. ابدأ التكوين الكلي عن طريق وضع قطرات 25 ميكرولتر من معلق الخلية (500 خلية) على السطح الداخلي لأغطية أطباق زراعة الأنسجة مقاس 10 سم (حتى 50 قطرة لكل غطاء). ضع الأغطية على نظيراتها السفلية التي تحتوي على PBS-P / S. احتضن عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
    ملاحظة: ضع 5-7 مل من PBS-P / S في طبق الثقافة أسفل القطرات المعلقة لتجنب التبخر المتساقط.
  3. لاحظ التكوين الكلي في القطرات بعد 3 أيام باستخدام مجهر مجسم. إذا كانت أكثر من 40 من أصل 50 قطرة تحتوي على مجاميع متكونة، فقم بجمع القطرات من الأغطية باستخدام ماصة دقيقة سعة 1 مل وانقل الركام مباشرة إلى طبقات وحيدة عضلة القلب الأولية للفئران (محضرة في الخطوات 2.1-2.7؛ 10 قطرات/بئر). تجنب سحب العينات القوية للحفاظ على سلامة الركام
    4. .
  4. احتفظ بالمزارع المشتركة الإجمالية في الحاضنات لمدة تصل إلى أسبوعين ، مع تغيير الحجم الكامل للوسط (2 مل من DMEM-F12 يحتوي على 10٪ FBS و 1٪ P / S لكل بئر) كل 72 ساعة.
    1. مراقبة يومية الركام المرتبط بطبقات الخلايا المغذية باستخدام الفحص المجهري للمجال الساطع. سجل مجاميع التعاقد عند ملاحظتها.
  5. إعداد المجاميع للتحليل.
    1. قم بإزالة الوسط وأضف 2 مل من PBS لكل بئر من طبق زراعة الأنسجة المكون من 6 آبار. قم بإزالة PBS وأضف 2 مل من محلول التفكك لكل بئر. احتضن لمدة 3 دقائق عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2.
    2. جهاز طرد مركزي عند 400 × جم لمدة 5 دقائق للحصول على حبيبات الخلية. قم بالتعليق في الوسط ، كما هو محدد للتطبيقات الموضحة في الخطوات اللاحقة (انظر الخطوات 4.1 و 5.1 و 6.1) وقم بالمرور عبر مصفاة خلية 70 ميكرومتر.
< p class = "jove_title" >4. قياس التدفق الخلوي (FC) وفرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS)

  1. احتضان معلقات الخلايا (1 × 105 خلايا في 200 ميكرولتر من PBS تحتوي على 3٪ FBS) مع الأجسام المضادة الأولية المترافقة بالفلوروفور (FITC أو APC) (على سبيل المثال ، CD49f و Cx43 و TRA-1-85 و HLA-A ، HLA-G و SIRPA ل FC أو TRA-1-85 ل FACS ؛ 1:40) عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة ، محمية من الضوء.
  2. جهاز طرد مركزي (400 × جم ، 5 دقائق) وإعادة تعليق الخلايا في 1 مل من PBS مع 3٪ FBS ل FC أو PBS مع 0.5٪ FBS ل FACS.
    ملاحظة: تم تحسين FC of MSCs بواسطة Hong et al.< فئة الدعم = "xref">41.
  3. حافظ على الخلايا عند 4 درجات مئوية في الظلام حتى تصبح جاهزة للتحليل بواسطة FC (على الأقل 1 × 104 أحداث) أو FACS. قم بفرز الخلايا كما هو موضح41. أعد صفيحة TRA-1-85 خلايا فرزة عالية الإيجابية في ألواح ذات 6 آبار (1 × 104 خلايا / بئر ، 2 مل من DMEM-F12 تحتوي على 10٪ FBS و 1٪ P / S) في غضون 1 ساعة < br / > ملاحظة: للحصول على استراتيجية البوابات لمستضد سطح الخلية البشرية TRA-1-85 ، انظر الشكل التكميلي.
< p class = "jove_title" >5. كيمياء الخلايا المناعية (ICC) والفحص المجهري

  1. أعد وضع معلقات الخلية التي تم الحصول عليها من الثقافات المشتركة (الخطوة 3.5.2) أو FACS (القسم 4) على شرائح الغرفة (1 × 104 خلايا / بئر ، 2 مل من DMEM-F12 تحتوي على 10٪ FBS و 1٪ P / S لكل بئر). دع الخلايا تلتصق طوال الليل في حاضنة زراعة الأنسجة (انظر القسم 1 للشروط).
  2. قم بإصلاح الخلايا باستخدام 3 مل من 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) في PBS لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. يغسل 3 مرات ب 3 مل من PBS يحتوي على 1٪ من ألبومين مصل الأبقار (BSA; PBS-BSA) لمدة 5 دقائق لكل غسلة.
    تنبيه: ارتد معدات الحماية الشخصية المناسبة عند التعامل مع PFA.
  3. تخلل الخلايا في 3 مل من PBS-BSA مع 0.1٪ Triton X-100. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق للمستضدات داخل الخلايا (أي ألفا ساركوميريك أكتينين (aSarc) و Cx43) ، أو 25 دقيقة للمستضدات داخل النواة (أي Mef2c والمستضد النووي البشري (HuNu)). يغسل 3 مرات باستخدام 3 مل من PBS-BSA لمدة 5 دقائق لكل غسلة.
  4. منع العينات ضد تفاعلات الأجسام المضادة غير المحددة مع 3 مل من PBS يحتوي على 5٪ مصل الماعز العادي (NGS) و 1٪ BSA لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. يغسل 3 مرات باستخدام 3 مل من PBS-BSA لمدة 5 دقائق لكل غسلة.
  5. احتضان الخلايا في الأجسام المضادة الأولية (أي Mef2c و aSarc و Cx43 و HuNu) المخففة 1: 200 في 3 مل من PBS-BSA عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
  6. يغسل 3 مرات باستخدام 3 مل من PBS-BSA لمدة 5 دقائق لكل غسلة ويحتضن بالأجسام المضادة الثانوية لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. يغسل 3 مرات باستخدام 3 مل من PBS-BSA لمدة 5 دقائق لكل غسلة.
  7. قم بتخزين العينات الملطخة في 3 مل من وسط التركيب.
  8. الحصول على الصور باستخدام المجهر الفلوري. استخدم هدف 10X (NA = 0.3) ، وهدف 20X (NA = 0.45) للتصوير التكبير المنخفض. استخدم مكعبات مرشح التألق والأطوال الموجية ل GFP (على سبيل المثال = 470/22 نانومتر ، em = 525/50 نانومتر) و RFP (على سبيل المثال = 531/40 نانومتر ، em = 593/40 نانومتر) للأجسام المضادة الثانوية المستخدمة (انظر جدول المواد والمعدات).
  9. حدد الصور باستخدام برنامج التصوير (انظر جدول المواد والمعدات للاطلاع على البرنامج الموصى به). تطبيع قراءات شدة التألق إلى عمليات الاستحواذ على التحكم الثانوي.
فئة

6. عزل الحمض النووي الريبي والكمي RT-PCR

  1. قم بإعداد عينات الحمض النووي الريبي من مزارع MSC غير المتمايزة أو الخلايا الجذعية الجذعية التي تم فرزها من الثقافات المشتركة باستخدام عزل الحمض النووي الريبي القائم على العمود ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. قم بإعداد 1 × 104 إلى 1 × 106 خلايا في 0.7 مل من المخزن المؤقت لتحلل الخلية (مزود بمجموعة عزل الحمض النووي الريبي) لكل عينة.
  2. تحضير (كدنا) من ما يصل إلى 2 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي لكل تفاعل 100 ميكرولتر RT.
  3. قم بإجراء qPCR باستخدام 10 نانوغرام من (كدنا) لكل تفاعل (40 دورة ، 60 درجة مئوية من درجة حرارة التلدين / التمدد).
    1. استخدم الاشعال ل MY6H و cTnT البشري بتركيز 500 نانومتر و 1-100 نانوغرام من (كدنا) لكل تفاعل (انظر جدول المواد والمعدات). استخدم GAP DH و ACTB و HPRT كأدوات تطبيع داخلية للتدبير المنزلي. استخدم خلايا عضلة القلب المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات المتوفرة تجاريا كعنصر تحكم إيجابي.
      ملاحظة: عبر عن تغيير أضعاف التعبير مقارنة بعينات (كدنا) غير المتمايزة المشتقة من MSC.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HUCPVCs تعرض إمكانات تكوين تراكمية أعلى ومستويات تعبير CD49f مقارنة ب BMSCs:

< p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" > للحث على تمايز hMSCs (على سبيل المثال ، FTM HUCPVCs ، ومصطلح HUCPVCs ، و BMSCs) ، تم نقل المعلقات أحادية الخلية من الخلايا الجذعية الجذعية غير المتمايزة أو القطرات المعلقة المحتوية على MSC (الجدول 1) إلى طبقات وحيدة الخلايا العضلية القلبية الأولية للفئران لإنشاء ثقافات مشتركة مباشرة أو ثقافات مش...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم التفريق بين القلب من الخلايا الجذعية تحت التطوير لأكثر من 2 عقود، مع العديد من الاستراتيجيات المختلفة المستخدمة لتوليد الخلايا مثل كارديوميوسيتي من مصادر لجنة السلامة البحرية. العديد من هذه الاستراتيجيات، ومع ذلك، غير فعالة، وغالباً ما لا شروط استخدام ممثل بيئة زرع الخلايا اللقاء في فيفو.

وعلى النقيض من الأساليب القائمة، يستخدم البروتوكول المعروضة هنا مجموعة من الطبقات الرئيسية تغذية القلب والكلية تشكيل لجنة السلامة البحرية. الطبقات تغذية القلب الأساسي توفير بيئة تمايز مشابهة لتلك ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الدكتور كليفورد ليبراتش L. حامل مشترك للبراءة: أساليب العزل واستخدام الخلايا المستمدة من أنسجة الحبل السري الاثلوث الأول، منح في كندا وأستراليا.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب أشكر الموظفين التالية وبحوث الأفراد لمساهماتها: ماثيو ليبراتش، ماغين ليلى، تانيا ألف Baretto، وشلوميت كينيغزبيزغ، وأندريه غوتييه-فيشر. هذا العمل كان يدعمها "الصندوق البحوث أونتاريو"-التميز البحثي (ORF-RE، جولة #7) وإنشاء شركة البرنامج

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.25٪ تريبسين / EDTAGibco25200056لتفكك الخلايا
Alpha-MEMGibco12571071لوسائط ثقافة HUCPVC و BMSC.
الأجسام المضادة للإنسان / الفأر المترافق ب PE CD49fBiolegend313612علامة Integrin
للأجسام المضادة البشرية Cx43 / GJA1R & D SystemsFAB7737Aعلامة Connexin 43 للجسم
المضاد HLA-A2 المترافق FC FITCGenway Biotech Inc.GWB-66FBD2علامة المناعة ل FC
FITC المترافق المضاد ل HLA-G [MEM-G / 9] الجسم المضادAbcamab7904المناعة
للفأر المترافق FC FITC المضاد للإنسان SIRPA / CD172a علامةالقلب ABDSerotec / Bio-RadMCA2518F
للجسم المضاد البشري المترافق FC APC TRA-1-85 / CD147R & D SystemsFAB3195Aعلامة الخلية البشرية للجسم
المضاد البشري المترافقR & D SystemsFAB3195Fعلامة الخلية البشرية ل FC و FACS
Anti-connexin 43 / GJA1 الأجسام المضادةAbcamab11370Cx43. بالنسبة للجسم
المضاد الثانوي المتصاص IgG (H + L) المضاد للأرانب ICC ، Alexa Fluor 555Life TechnologiesA-21428للجسم
المضاد ل ICC المضاد للساركوميريك ألفا أكتينين [EA-53]Abcamab9465aSARC. بالنسبة للجسم
الماعز ICC ، Alexa Fluor 555Life TechnologiesA-21426ل ICC
Mef2C (D80C1) XP الجسم المضاد للأرانبنيو إنجلاند BioLabs Ltd.5030Sللجسم
المضاد الثانوي IgG (H + L) للحمار ICC ، Alexa Fluor 488Life TechnologiesA-21206للجسم
المضاد للنوى ICC (HuNu) (استنساخ 235-1) الجسم المضادEMD MilliporeMAB1281ل ICC
MZ9.5 المجهر المجسمLeicaلمجاميع التصوير.
1.5 مل أنابيب الطرد المركزيالدقيقة AxygenMCT-150-Cلتلوين الخلايا الجذعية الجذعية بصبغة الفلورسنت.
ImageJبرنامج معالجة الصور مفتوح المصدر.
Aria II BDUHN SickKids FC. لفرز الخلايا.
نخاع العظام الخلايا اللحمية المتوسطةLonzaPT-2501BMSCs
ألبومين مصل الأبقارSigma-AldrichA7030-100GBSA. لإعداد حلول ل ICC
BrdUEMD MilliporeMAB3424تحذير: BrdU هو مادة ماسخية قوية ومشتبه بها مطفرة. يرجى التأكد من التدريب المناسب والرجوع إلى SDS قبل الاستخدام.
كانتو الثانيدينار بحرينيUHN SickKids FC. لقياس التدفق الخلوي.
cDNA EcoDry PremixClontech / Takara639570لإعداد (كدنا) ل qPCR
CellTracker Green CMFDA DyeLife TechnologiesC7025التصوير الفلوري للسيتوبلازم
الخلوي عداد الخلايا الآليInvitrogen Inc.C10227لعد الخلايا
DMEM-F12Sigma-AldrichD6421لوسط ثقافة خلايا عضلة القلب الأولية للفئران.
Dulbecco's Phosphate Buffered SalineGibco10010023D-PBS ، بدون Ca2 + < / sup> ، Mg2 + < / sup>
EVOSLife Technologiesمجهر فلورسنت داخلي
FACSCaliburBDداخلي. لقياس التدفق الخلوي.
مصل الأبقار الجنينية (Hyclone)GE HealthcareSH3039603FBS. مكون وسط زراعة الخلايا.
IDT Prime Time qPCR المجساتتقنيات البيانات المتكاملةFAM الفلوروفورhttp://www.idtdna.com/pages/products/gene-expression/primetime-qpcr-assays-and-primers
Lab Vision PermaFluor تركيب مائي متوسطThermoScientificTA-030-FMلتخزين الخلايا للخضوع ل ICC
LSR II   ؛BDUHN SickKids FC. لقياس التدفق الخلوي.
منشأة MoFlo AstriosBeckman CoulterUHN SickKids FC. لفرز الخلايا.
إشارات خليةمصل الماعز العادي5425SNGS. تستخدم في حل الحجب ل
Nunc Lab-Tek II Chamber Coverglass ، 8 آبارThermo ScientificNunc 155409لتحضير عينات ل ICC
OmniPur Triton X-100 الخافض للتوتر السطحيEMD Millipore9410-OPكمكون من مكونات محلول النفاذية عند تحضير الخلايا ل ICC
Paraformaldehyde ، محلول 16٪ ،علوم المجهر الإلكترونيEM 15710لتثبيت الخلايا ل ICC.
البنسلين / الستربتومايسينجيبكو15140122مكون وسط زراعة الخلايا.
بادئاتسيجمامخصص قياسي الحمض النووي أوليغوس ، محلى ، 0.2 & مو ؛ مول<قوي>CTnT_F: GGC AGC GGA AGA GGA TGC TGA A; <قوي>CTnT_R: GAG GCA CCA AGT TGG GCA TGA ACG A; <قوي>MYH6 F: GCA AAG TAC TGG ATG ACA CGC T; <قوي>MYH6 R: GTC ATT GCT GAA ACC GAG AAT G
نصاب القرص الغزل متحد البؤرZeissSickKids مرفق التصوير
ReproCardio خلايا عضلة القلب المشتقة من خلايا hiPSReproCellRCD001Nتحكم إيجابي في qPCR
RNeasy kit صغيرQiagen74106لعزل الحمض النووي الريبي ل qPCR
Rotor-Gene SYBR Green PCR KitQiagen204074ل qPCR مع مزيج رئيسي
RPMI 1640GibcoA1049101ل MSC ، وسط الزراعة المشتركة أحادية الخلية.
TaqMan qPCR التمهيدي فحوصاتThermo Fisher Scientific4444556ل qPCR
Trypan BlueLife TechnologiesT10282تلطيخ الخلايا من أجل الجدوى والعد
TrypsinGibco272500108لتفكك الخلايا
VolocityPerkin-ElmerVolocity 6.3برنامج التصوير
0.2 & مرشح المسام mThermo Fisher Scientific566-0020لتعقيم وسائط زراعة الأنسجة
HERAcell 150i CO2< / sub> حاضنةThermo Fisher Scientific51026410لاحتضان الخلايا
Dulbecco محلول ملحيمخزن مخزن Sigma-AldrichD8537PBS. 1X ، بدون كلوريد الكالسيوم وكلوريد المغنيسيوم
ملقطAlmedic7727- A10-704لتسليم قلب الفئران. يمكن استخدام أي ملقط مماثل.
أدوات العلوم الدقيقة لمقص14059-11لفرم قلب الفئران. يوصى باستخدام مقص منحني.
أنبوب 50 ملBD Falcon352070للتجميع أثناء جمع خلايا عضلة القلب وإجراءات زراعة الأنسجة
العامة 15 مل أنبوبBD Falcon352096لإجراءات زراعة الأنسجة العامة
6 ألواحThermo Scientific NuncCA73520-906لزراعة الأنسجة
أطباق زراعة الأنسجة 10 سمCorning25382-428لتكوين الركام
مجهر Axiovert 40CZeissللتصوير الميداني الساطع من خلال زراعة الأنسجة وبقية البروتوكول
70 & mu ؛ مصفاة الخليةm Fisherbrand22363548لضمان تعليق خلية واحدة قبل قياس التدفق الخلوي أو الفرز
Triton X-100EMD Millipore9410-1Lتستخدم في محلول النفاذية ل ICC
Hoechst 33342Thermo Fisher ScientificH1399Stain المستخدمة أثناء تصور توطين Cx43
علامة FC و FACS FITC المضاد الثانوي المتصاص عبر السلسلة الثقيلة من مرفق منشأة مرفق تقنية ICC من الدرجة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Badano, L. P., et al. Prevalence, clinical characteristics, quality of life, and prognosis of patients with congestive heart failure and isolated left ventricular diastolic dysfunction. J Am Soc Echocardiogr. 17 (3), 253-261 (2004).
  2. Leri, A., Kajstura, J., Anversa, P. Cardiac stem cells and mechanisms of myocardial regeneration. Physiol Rev. 85 (4), 1373-1416 (2005).
  3. Orlic, D., et al. Mobilized bone marrow cells repair the infarcted heart, improving function and survival. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (18), 10344-10349 (2001).
  4. Schuster, M. D., et al. Myocardial neovascularization by bone marrow angioblasts results in cardiomyocyte regeneration. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 287 (2), 525-532 (2004).
  5. Zandstra, P. W., et al. Scalable production of embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Tissue Eng. 9 (4), 767-778 (2003).
  6. Boheler, K. R., et al. Differentiation of pluripotent embryonic stem cells into cardiomyocytes. Circ Res. 91 (3), 189-201 (2002).
  7. Kattman, S. J., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).
  8. Dixon, J. E., Dick, E., Rajamohan, D., Shakesheff, K. M., Denning, C. Directed differentiation of human embryonic stem cells to interrogate the cardiac gene regulatory network. Mol Ther. 19 (9), 1695-1703 (2011).
  9. Stennard, F. A., et al. Cardiac T-box factor Tbx20 directly interacts with Nkx2-5, GATA4, and GATA5 in regulation of gene expression in the developing heart. Dev Biol. 262 (2), 206-224 (2003).
  10. Dubois, N. C., et al. SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 29 (11), 1011-1018 (2011).
  11. Panteghini, M. Present issues in the determination of troponins and other markers of cardiac damage. Clin Biochem. 33 (3), 161-166 (2000).
  12. Burridge, P. W., et al. Improved human embryonic stem cell embryoid body homogeneity and cardiomyocyte differentiation from a novel V-96 plate aggregation system highlights interline variability. Stem Cells. 25 (4), 929-938 (2007).
  13. Ovchinnikov, D. A., et al. Isolation of contractile cardiomyocytes from human pluripotent stem-cell-derived cardiomyogenic cultures using a human NCX1-EGFP reporter. Stem Cells Dev. 24 (1), 11-20 (2015).
  14. Moscoso, I., et al. Differentiation "in vitro" of primary and immortalized porcine mesenchymal stem cells into cardiomyocytes for cell transplantation. Transplant Proc. 37 (1), 481-482 (2005).
  15. Ramkisoensing, A. A., et al. Gap junctional coupling with cardiomyocytes is necessary but not sufficient for cardiomyogenic differentiation of cocultured human mesenchymal stem cells. Stem Cells. 30 (6), 1236-1245 (2012).
  16. van Kempen, M., et al. Expression of the electrophysiological system during murine embryonic stem cell cardiac differentiation. Cell Physiol Biochem. 13 (5), 263-270 (2003).
  17. Mummery, C. L., et al. Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview. Circ Res. 111 (3), 344-358 (2012).
  18. Puceat, M. Protocols for cardiac differentiation of embryonic stem cells. Methods. 45 (2), 168-171 (2008).
  19. Naito, H., et al. Optimizing engineered heart tissue for therapeutic applications as surrogate heart muscle. Circulation. 114, 1 Suppl 72-78 (2006).
  20. Zimmermann, W. H., et al. Heart muscle engineering: an update on cardiac muscle replacement therapy. Cardiovasc Res. 71 (3), 419-429 (2006).
  21. Hulot, J. S., et al. Considerations for pre-clinical models and clinical trials of pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cell Res Ther. 5 (1), 1(2014).
  22. Wakitani, S., Saito, T., Caplan, A. I. Myogenic cells derived from rat bone marrow mesenchymal stem cells exposed to 5-azacytidine. Muscle Nerve. 18 (12), 1417-1426 (1995).
  23. Caplan, A. I. Adult Mesenchymal Stem Cells: When, Where, and How. Stem Cells Int. 2015, 628767(2015).
  24. Burchfield, J. S., Dimmeler, S. Role of paracrine factors in stem and progenitor cell mediated cardiac repair and tissue fibrosis. Fibrogenesis Tissue Repair. 1 (1), 4(2008).
  25. Hsiao, S. T., et al. Comparative analysis of paracrine factor expression in human adult mesenchymal stem cells derived from bone marrow, adipose, and dermal tissue. Stem Cells Dev. 21 (12), 2189-2203 (2012).
  26. Tomita, S., et al. Autologous transplantation of bone marrow cells improves damaged heart function. Circulation. 100, 19 Suppl 247-256 (1999).
  27. Skerjanc, I. S. Cardiac and skeletal muscle development in P19 embryonal carcinoma cells. Trends Cardiovasc Med. 9 (5), 139-143 (1999).
  28. Hou, J., et al. Combination of BMP-2 and 5-AZA is advantageous in rat bone marrow-derived mesenchymal stem cells differentiation into cardiomyocytes. Cell Biol Int. 37 (12), 1291-1299 (2013).
  29. Yoon, J., et al. Differentiation, engraftment and functional effects of pre-treated mesenchymal stem cells in a rat myocardial infarct model. Acta Cardiol. 60 (3), 277-284 (2005).
  30. Xing, Y., Lv, A., Wang, L., Yan, X. The combination of angiotensin II and 5-azacytidine promotes cardiomyocyte differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells. Mol Cell Biochem. 360 (1-2), 279-287 (2012).
  31. Yuan, Y., et al. Differentiation of mesenchymal stem cells into cardio myogenic cells under the induction of myocardial cell lysate. Zhonghua Xin Xue Guan Bing Za Zhi. 33 (2), 170-173 (2005).
  32. Toma, C., Pittenger, M. F., Cahill, K. S., Byrne, B. J., Kessler, P. D. Human mesenchymal stem cells differentiate to a cardiomyocyte phenotype in the adult murine heart. Circulation. 105 (1), 93-98 (2002).
  33. Yannarelli, G., et al. Donor mesenchymal stromal cells (MSCs) undergo variable cardiac reprogramming in vivo and predominantly co-express cardiac and stromal determinants after experimental acute myocardial infarction. Stem Cell Rev. 10 (2), 304-315 (2014).
  34. Rangappa, S., Entwistle, J. W., Wechsler, A. S., Kresh, J. Y. Cardiomyocyte-mediated contact programs human mesenchymal stem cells to express cardiogenic phenotype. J Thorac Cardiovasc Surg. 126 (1), 124-132 (2003).
  35. Bakogiannis, C., et al. Circulating endothelial progenitor cells as biomarkers for prediction of cardiovascular outcomes. Curr Med Chem. 19 (16), 2597-2604 (2012).
  36. Deb, A., et al. Bone marrow-derived cardiomyocytes are present in adult human heart: A study of gender-mismatched bone marrow transplantation patients. Circulation. 107 (9), 1247-1249 (2003).
  37. Laflamme, M. A., Myerson, D., Saffitz, J. E., Murry, C. E. Evidence for cardiomyocyte repopulation by extracardiac progenitors in transplanted human hearts. Circ Res. 90 (6), 634-640 (2002).
  38. Quaini, F., et al. Chimerism of the transplanted heart. N Engl J Med. 346 (1), 5-15 (2002).
  39. Alvarez-Dolado, M., et al. Fusion of bone-marrow-derived cells with Purkinje neurons, cardiomyocytes and hepatocytes. Nature. 425 (6961), 968-973 (2003).
  40. Nygren, J. M., et al. Bone marrow-derived hematopoietic cells generate cardiomyocytes at a low frequency through cell fusion, but not transdifferentiation. Nat Med. 10 (5), 494-501 (2004).
  41. Hong, S. H., et al. Ontogeny of human umbilical cord perivascular cells: molecular and fate potential changes during gestation. Stem Cells Dev. 22 (17), 2425-2439 (2013).
  42. Sarugaser, R., Ennis, J., Stanford, W. L., Davies, J. E. Isolation, propagation, and characterization of human umbilical cord perivascular cells (HUCPVCs). Methods Mol Biol. 482, 269-279 (2009).
  43. Sarugaser, R., Lickorish, D., Baksh, D., Hosseini, M. M., Davies, J. E. Human umbilical cord perivascular (HUCPV) cells: a source of mesenchymal progenitors. Stem Cells. 23 (2), 220-229 (2005).
  44. Kadivar, M., et al. In vitro cardiomyogenic potential of human umbilical vein-derived mesenchymal stem cells. Biochem Biophys Res Commun. 340 (2), 639-647 (2006).
  45. Baksh, D., Yao, R., Tuan, R. S. Comparison of proliferative and multilineage differentiation potential of human mesenchymal stem cells derived from umbilical cord and bone marrow. Stem Cells. 25 (6), 1384-1392 (2007).
  46. Wu, K. H., et al. Cardiac potential of stem cells from whole human umbilical cord tissue. J Cell Biochem. 107 (5), 926-932 (2009).
  47. Yannarelli, G., et al. Human umbilical cord perivascular cells exhibit enhanced cardiomyocyte reprogramming and cardiac function after experimental acute myocardial infarction. Cell Transplant. 22 (9), 1651-1666 (2013).
  48. Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: The ARRIVE guidelines for reporting animal research. J Pharmacol Pharmacother. 1 (2), 94-99 (2010).
  49. Yu, K. R., et al. CD49f enhances multipotency and maintains stemness through the direct regulation of OCT4 and SOX2. Stem Cells. 30 (5), 876-887 (2012).
  50. Lee, R. H., et al. The CD34-like protein PODXL and alpha6-integrin (CD49f) identify early progenitor MSCs with increased clonogenicity and migration to infarcted heart in mice. Blood. 113 (4), 816-826 (2009).
  51. Szaraz, P., et al. In Vitro Differentiation of First Trimester Human Umbilical Cord Perivascular Cells into Contracting Cardiomyocyte-Like Cells. Stem Cells Int. 2016, 7513252(2016).
  52. Bauwens, C., Yin, T., Dang, S., Peerani, R., Zandstra, P. W. Development of a perfusion fed bioreactor for embryonic stem cell-derived cardiomyocyte generation: oxygen-mediated enhancement of cardiomyocyte output. Biotechnol Bioeng. 90 (4), 452-461 (2005).
  53. Jing, D., Parikh, A., Tzanakakis, E. S. Cardiac cell generation from encapsulated embryonic stem cells in static and scalable culture systems. Cell Transplant. 19 (11), 1397-1412 (2010).
  54. Hare, J. M., et al. Comparison of allogeneic vs autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells delivered by transendocardial injection in patients with ischemic cardiomyopathy: the POSEIDON randomized trial. JAMA. 308 (22), 2369-2379 (2012).
  55. Huang, X. P., et al. Differentiation of allogeneic mesenchymal stem cells induces immunogenicity and limits their long-term benefits for myocardial repair. Circulation. 122 (23), 2419-2429 (2010).
  56. Hare, J. M., et al. A randomized, double-blind, placebo-controlled, dose-escalation study of intravenous adult human mesenchymal stem cells (prochymal) after acute myocardial infarction. J Am Coll Cardiol. 54 (24), 2277-2286 (2009).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

HUCPVC

مقالات ذات صلة