Method Article

بروتوكول محسن لاستخراج البروتينات من صمام ميترال الإنسان

DOI:

10.3791/55762

⸱

June 14th, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centro Cardiologico Monzino IRCCS, 2Cardiovascular Tissue Bank of Milan, Centro Cardiologico Monzino IRCCS, 3Department of Clinical Sciences and Community Health, Cardiovascular Section, University of Milan, 4Department of Cardiovascular Disease, Development and Innovation Cardiac Surgery Unit, Centro Cardiologico Monzino IRCCS

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تكوين البروتين من صمام الصمام التاجي البشري لا يزال غير معروف جزئيا، لأن تحليله معقد من قبل الخلوية منخفضة، وبالتالي من خلال انخفاض البروتين الحيوي. هذا العمل يوفر بروتوكول لاستخراج البروتين بكفاءة لتحليل بروتيوم صمام الصمام التاجي.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحليل بروتيوم الخلوية يمكن أن تساعد على توضيح الآليات الجزيئية الكامنة الأمراض بسبب تطوير التكنولوجيات التي تسمح على نطاق واسع تحديد وكمية من البروتينات الموجودة في النظم البيولوجية المعقدة.المعرفة المكتسبة من نهج البروتين يمكن أن تؤدي إلى فهم أفضل للآليات المسببة للأمراض الكامنة وراء الأمراض، والسماح لتحديد علامات التشخيص والتشخيص الرواية جديدة، ونأمل، من الأهداف العلاجية. ومع ذلك، فإن الصمام التاجي القلب يمثل عينة صعبة للغاية لتحليل البروتين بسبب انخفاض الخلوية في بروتيوغليكان والمصفوفة خارج الخلية المخصب الكولاجين. وهذا يجعل من الصعب استخراج البروتينات لتحليل البروتين العالمي. يصف هذا العمل بروتوكول متوافق مع تحليل البروتين لاحق، مثل البروتينات الكمية و إمونوبلوتينغ. وهذا يمكن أن يسمح للارتباط البيانات قلقز التعبير البروتين مع البيانات على التعبير الكمي مرنا وغير الكمي تحليل المناعية. في الواقع، هذه النهج، عندما يؤديها معا، سيؤدي إلى فهم أكثر شمولا للآليات الجزيئية الكامنة وراء الأمراض، من مرنا إلى ما بعد متعدية تعديل البروتين. وهكذا، يمكن لهذه الطريقة تكون ذات صلة للباحثين المهتمين في دراسة أمراض القلب صمام فيسيوباثولوغي.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد غيرت الأدلة الأخيرة فهم أدوار الآليات التنظيمية العديدة التي تحدث بعد التوليف مرنا. في الواقع، عمليات متعدية، ما بعد النسخي، وعمليات بروتين يمكن أن تنظم بروتين وفرة وظيفة. العقيدة - التي تقول أن تركيزات مرنا هي بروكسيات لتلك التي من البروتينات المقابلة، على افتراض أن مستويات النص هي المحدد الرئيسي للوفرة البروتين - وقد تم تنقيح جزئي. في المقام الأول، ومستويات النص تتنبأ جزئيا فقط وفرة البروتين، مما يشير إلى أن أحداث ما بعد النسخي تحدث لتنظيم البروتينات داخل الخلايا 1 ، 2 .

وعلاوة على ذلك، والبروتينات تملي في نهاية المطاف وظيفة الخلية، وبالتالي تملي النمط الظاهري، والتي يمكن أن تخضع لتغييرات ديناميكية في الاستجابة لعقاقير أوتوكرين، باراكرين، والغدد الصماء. الوسطاء المنقولين بالدم؛ درجة الحرارة؛ العلاج من الإدمان؛ وتطور المرضمنة. وهكذا، فإن تحليل التعبير تركز على مستوى البروتين مفيد لتوصيف بروتيوم وكشف التغيرات الحرجة التي تحدث لها كجزء من المرضية المرض 3 .

ولذلك، فإن الفرص التي توفرها البروتيوميات لتوضيح الظروف الصحية والمرضية هائلة، على الرغم من التحديات التكنولوجية القائمة. المجالات الواعدة بشكل خاص للبحوث التي يمكن أن تسهم بروتيوميكس: تحديد تغيير التعبير البروتين على أي مستوى ( أي خلايا كاملة أو الأنسجة، المقصورات تحت الخلوية، والسوائل البيولوجية). وتحديد والتحقق، والتحقق من المؤشرات الحيوية الرواية مفيدة لتشخيص وتشخيص المرض. ونأمل، وتحديد أهداف البروتين الجديدة التي يمكن استخدامها لأغراض علاجية، فضلا عن تقييم فعالية الدواء والسمية 4 .

التقاط تعقيديمثل البروتيوم تحديا تكنولوجيا. أدوات البروتين الحالية توفر الفرصة لأداء تحليل واسع النطاق، عالية الإنتاجية لتحديد، الكمي، والتحقق من صحة مستويات البروتين المتغيرة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن إدخال تقنيات تجزئة وإثراء، وتهدف إلى تجنب التدخل الناجم عن البروتينات الأكثر وفرة، كما تحسنت تحديد البروتين من خلال تضمين البروتينات الأقل وفرة. وأخيرا، تم تكملة البروتيوميات من خلال تحليل التعديلات بعد متعدية، والتي تظهر تدريجيا كمغيرات هامة من وظيفة البروتين.

ومع ذلك، فإن إعداد العينة واستعادة البروتين في العينات البيولوجية تحت التحليل لا تزال الخطوات المحددة في سير العمل البروتين وزيادة إمكانية وقوع المزالق المحتملة 5 . في الواقع، في معظم تقنيات البيولوجيا الجزيئية التي يجب أن تكون الأمثل، والخطوات الأولى هي الأنسجة هوموجينيزاتأيون وتحلل الخلية، وخصوصا خلال تحليل البروتينات وفرة منخفضة التي أساليب التضخيم لا وجود لها. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الطبيعة الكيميائية للبروتينات يمكن أن تؤثر على الانتعاش الخاصة بهم. على سبيل المثال، تحليل البروتينات مسعور للغاية صعبة للغاية، لأنها تتعجل بسهولة خلال التركيز إسويلكتريك، في حين البروتينات عبر غشاء تقريبا غير قابلة للذوبان (راجع في المرجع 5). وعلاوة على ذلك، فإن تقلب تكوين الأنسجة يخلق حاجزا كبيرا لتطوير طريقة استخراج عالمية. وأخيرا، لأن ما يقرب من جميع العينات السريرية هي من كمية محدودة، فمن الضروري لتمكين إعداد البروتين مع الانتعاش القصوى والتكاثر من الحد الأدنى من كميات عينة 6 .

يصف هذا العمل بروتوكول الأمثل لاستخراج البروتين من صمام القلب التاجي البشري العادي، الذي يمثل عينة صعبة للغاية لتحليل البروتين. صمام التاجي العادي هو كومبهيكل ليكس الكذب بين الأذين الأيسر والبطين الأيسر للقلب ( الشكل 1 ). فإنه يلعب دورا هاما في السيطرة على تدفق الدم من الأذين إلى البطين، ومنع ارتجاعي وضمان المستوى المناسب من إمدادات الأكسجين إلى الجسم كله، وبالتالي الحفاظ على الناتج القلبي الكافي. ومع ذلك، فإنه غالبا ما يعتبر أن يكون "غير نشط" الأنسجة، مع الخلوية منخفضة وعدد قليل من المكونات، وذلك أساسا في المصفوفة خارج الخلية. وذلك لأنه، في الظروف العادية، الخلايا الخلوية صمام المقيمين (فيكس) تقديم النمط الظاهري هادئ مع انخفاض معدل البروتين الحيوي 7 .

ومع ذلك، فقد ثبت أنه في حالة المرضية، وعدد من مراكز فيينا الدولية في زيادة الإسفنجية وتفعيل تخليق البروتين، جنبا إلى جنب مع غيرها من التغيرات الوظيفية والمظاهر الظاهرية 8 . ولذلك، فإنه ليس من المستغرب أن الحد الأدنى من البيانات المتاحة فيوتركز الأدب على تحليل الصمامات التاجية المرضية 9 ، 10 ، والتي قد زيادة عدد فيك المنشط قد يفسر العدد المرتفع نسبيا من البروتينات التي تم تحديدها.

في الختام، فإن هذا البروتوكول قد تعمل على تطوير فهم الآليات المسببة للأمراض المسؤولة عن أمراض الصمام التاجي من خلال دراسة مكونات بروتين صمام التاجي. والواقع أن الفهم الأكبر للعمليات المرضية الكامنة يمكن أن يساعد على تحسين الإدارة السريرية لأمراض الصمامات التي تعتمد مؤشراتها الحالية للتدخل إلى حد كبير على اعتبارات الدورة الدموية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذا البروتوكول، يتم جمع قلوب الإنسان خلال إكسبلانتاتيون متعدد الأجسام (وقت نقص التروية الباردة من 4-12 ساعة، يعني 6 ± 2 ح) من الجهات المانحة متعددة الأعضاء استبعادها من زرع الأعضاء لأسباب تقنية أو وظيفية، على الرغم من المعلمات مخطط صدى القلب العادي. يتم إرسالها إلى بنك الأنسجة القلبية الوعائية في ميلانو، مركز مونزينو كارديولوجيك (ميلان، إيطاليا) لمصارف الصمامات الأبهري والرئوي. لا تستخدم المنشورات الخلفية التاجية للأغراض السريرية، لذلك يتم جمعها خلال عزل الصمام الأبهري والرئوي بعد الحصول على موافقة مستنيرة من أقارب المانحين. يتم جمع الأنسجة لزرع والبحوث إلا بعد موافقة الوالدين. على ورقة الموافقة، فإنهم يأذنون (أو لا) استخدام الأنسجة القلبية للبحث فقط إذا لم يكن مناسبا للاستخدام السريري البشري ( أي الميكروبيولوجية والوظيفية، والمرضية المشاكل)، وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة الأخلاق منمركز مونزينو كارديولوجيك.

1. إعداد الصمام التاجي

  1. حصاد صمام الصمام التاجي البشري في أقرب وقت ممكن بعد الجهاز إكسلانتاتيون (وقت نقص التروية الباردة من 4-12 ح).
  2. في غرفة نظيفة، وإزالة القلب من حقيبة النقل التي تحتوي على البرد (4 درجات مئوية) حل ( أي محلول ملحي أو متوازنة وروكولينز المتوسطة أو ولاية ويسكونسن). وضعه في دلو ووضعه في مجلس الوزراء السلامة الأحيائية (بيوهازارد تدفق الهواء العمودي، فئة A، تصنيف ممارسات التصنيع الجيدة (غمب) للمضي قدما في إعداد صمام.
  3. وضع القلب على ثنى المتاح العقيمة في مجلس الوزراء. باستخدام مشرط العقيمة القابل للتصرف، وقطع القلب تماما، عموديا على محورها الرئيسي، على مستوى البطينين الأيسر والأيمن، حوالي 4 سم بعيدا عن قمة.
  4. نقل الشريان الأورطي الصاعد والشريان الرئوي لعرض السقف الأذيني الأيسر.
  5. مع ملقط أوتوكلافابل معقمة ويختار، وقطع حول أوريكل الأيسر علىتركت الأذيني سقف، مما يجعل الصمام التاجي مرئية والسماح للنشرة التاجية كبيرة (الأمامي) ومنشور التاجي الصغيرة (الخلفي) التي سيتم تحديدها.
    ملاحظة: أنتيرو الجانبي والمسامير الإنسية الخلفي تحديد الحدود من النشرة الأمامية والمنطقة الخلفية.
  6. باستخدام مقص قابل للتعقيم معقمة والملقط غير الصدمة، تشريح الأذين الأيسر وسماكة جدار البطين حول محيط صمام التاجي كله .
  7. تحديد استمرارية الصمام الشريان الأورطي.
    ملاحظة: البطين الأيسر يحتوي على صمام التاجي كله والحبال.
  8. فصل نشرة الصمام التاجي الأمامي من النشرة الخلفية الصمام التاجي، وقطع المنشور الخلفي على طول الإدراج مع البطين (الصوار).
  9. غسل النشرة الخلفية في محلول ملحي. قطع النشرة إلى قطع صغيرة (<1 سم 2 ) ولفها بشكل فردي في رقائق الألومنيوم. المفاجئة تجميد لهم مع النيتروجين السائل.
    تنبيه: اتبع إجراءات السلامة التنظيمية عند استخدام النيتروجين السائل.
    1. تطهير الجدول من مجلس الوزراء مع 70٪ محلول الأيزوبروبيل و 6٪ محلول بيروكسيد الهيدروجين في نهاية الإجراء.

2. استخراج البروتين

  1. استخدام ملقط لالتقاط العينة المخزنة في النيتروجين السائل ووضعه على الفور على الجليد الجاف في حين لا تزال ملفوفة في رقائق الألومنيوم. لا تترك العينة إلى ذوبان الجليد أثناء أي نقل.
  2. قبل طحن، والبرد الخزف / الزركونيوم هاون و بيستليس من نظام طاحونة (على سبيل المثال، كريوغريندر)، جنبا إلى جنب مع العينة، عن طريق وضعها في قارورة ديوار تحتوي على النيتروجين السائل (~ 500 مل).
    تنبيه: اتبع إجراءات السلامة التنظيمية عند استخدام النيتروجين السائل.
  3. وضع هاون والمدقة في مربع البوليسترين التي تحتوي على الثلج الجاف. إزالة العينة من رقائق الألومنيوم ووضعها في هاون.
  4. طحن روقال انه عينة مع مدقة كبيرة ضد هاون 15-20 مرات، وذلك باستخدام مفك لتدوير المدقة. مزج العينة مع طرف ملعقة قبل المبردة أثناء عملية الطحن.
    1. كرر مع المدقة الصغيرة.
  5. نقل عينة الأرض إلى أنبوب وزنه سابقا (على سبيل المثال، 15 مل أنبوب الطرد المركزي) عن طريق قلب الأنبوب، ووضعه على هاون، وعكسها معا لنقل العينة إلى الأنبوب. استخدام ملعقة قبل المبردة لاستعادة جميع المواد من الهاون.
    1. إبقاء الأنبوب مع العينة على الجليد الجاف لتجنب عينة ذوبان أثناء نقل.
  6. حساب الوزن الصافي للعينة.
  7. تنظيف الهاون والمدقات بعد كل عينة وتطهيرها عن طريق التعقيم أو تسخينها في 200 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
  8. نقل عينة المسحوق من أنبوب الطرد المركزي إلى أنبوب زجاجي من الخالط عن طريق انقلاب.
  9. إضافة تصفية اليوريا بوف(8 M اليوريا، 2 M ثيوريا، 4٪ ث / V تشابس، 20 ملي تريس، و 55 ملي ديثيوتريتول) إلى أنبوب زجاجي، 200 ميكرولتر من اليوريا العازلة لكل 10 ملغ من الأنسجة المسحوقة.
    ملاحظة: المتبقية عينة مسحوق اليسار في أنبوب الطرد المركزي يمكن استردادها باستخدام جزء من حجم المحسوبة من اليوريا العازلة.
  10. تجانس العينة باستخدام النمام مجهزة هاون الزجاج البورسليكات و بيتيترافلوروثيلين (بتف) مدقة. اضغط ببطء المدقة على العينة مع حركة التواء (1500 دورة في الدقيقة) 10 مرات.
  11. استعادة طاف ونقله إلى أنبوب الطرد المركزي 1.7 مل نظيفة. مرة أخرى استخراج العينة المتبقية مع العازلة اليوريا الطازجة، مضيفا نصف حجم المستخدمة خلال الاستخراج الأول.
  12. كرر الخطوة 2.10.
  13. استعادة طاف والجمع بينه وبين طاف من الخطوة 2.11. وضع طاف مجتمعة على مدورة أنبوب لمدة 30 دقيقة.
  14. الطرد المركزي أنبوب لمدة 30 دقيقة في 13،000 زغ و 4 درجة مئوية.
  15. استرداد طاف أد قياس تركيز البروتين باستخدام فحص البروتين برادفورد، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. تخزين العينة في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

استخراج و حل البروتينات في العازلة اليوريا هو متوافق مباشرة مع الأساليب البروتينية على أساس إزلكتروفوكوسينغ (ثنائي الأبعاد الكهربائي (2-دي) 11 والتركيز السائل تركيز كهروضوئية (إيف) 12 ) مع إمونوبلوتينغ بعد التخفيف في العازلة ليملي 13 تحتوي على كوكتيل البروتيني مثبط 14 .

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

خطوة واحدة حاسمة من هذا البروتوكول هو استخدام النيتروجين السائل لتجميد العينة والبرد نظام طاحونة. إن استخدام النيتروجين السائل يمنع التدهور البيولوجي ويسمح بالمسحوق الفعال، ولكنه يتطلب تدريبا خاصا للتعامل الآمن.

في هذا البروتوكول يتميز نظام طاحونة لعينة طحن لأن عينات صغيرة من الصعب استرداد من هاون القياسية والمدقات. في هذه الحالة، عينات صغيرة تنتشر على شكل مسحوق ناعم على سطح الهاون، مما يجعل جمع الصعب. ميزة أخرى ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد دعمت وزارة الصحة الإيطالية هذه الدراسة (أرسي 2013-بيو 15). نشكر باربرا ميشيلي لمساعدتها التقنية الممتازة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
محلول0.9٪ كلوريد الصوديوم
Eurocollins ASALF30874046وسط نقل العضو المتوازن. امزج 400 مل من Eurocollins A مع 100 مل Eurocollins B للحصول على متوسط متوازن Eurocollins
Eurocollins BSALF30874022وسيط نقل العضو المتوازن. اجمع بين 400 مل من Eurocollins A مع 100 مل Eurocollins B للحصول على عمر Eurocollins متوسط متوازن من Eurocollins
WisconsinBridgeRM / N 4081متوسط نقل الأعضاء المتوازن هواء
التدفق الرأسيBiohazard BurdinolaClass A تصنيف GMP Dewar
FlaskThermo ScientificNalgene 4150-1000
نظام المطحنة بالتبريدOPS التشخيصCG 08-01نظام مطحنة يحتوي على ملاط ومدقات ومفك براغي
ملقط
ملعقة
مشرط معقم يمكن التخلص منهMedisafeMS-10
مقصقابل
للتعقيم
القابل للتصرف معقمةMon& Tex3.307.08
محلول تعقيم بكحول70٪ كحول الأيزوبروبيل
محلول تعقيم ببيروكسيد6٪ بيروكسيد الهيدروجين
ماصة دقيقة ، 1 مل ، مع أطراف
15 مل أنابيب الطرد المركزيVWR international9278
1.7 مل أنابيب الطرد المركزيVWR PIER90410
عازلة8 M اليوريا ، 2 M thiourea ، 4٪ وزن / حجم CHAPS ، 20 ملي تريزما ، 55 ملي ديثيوتريتول
اليورياسيجما ألدريتشU6504-1KGلاستخدامها في عازلة اليوريا
ThioureaSigma aldrichT8656لاستخدامها في عازلة اليوريا
CHAPSSigma aldrichC3023-5GRلاستخدامها في عازلة
اليورياDithiotreitolSigma aldrichD0632-5Gلاستخدامها في حقنة اليوريا العازلة
50 ملPICلاستخدامها لتصفية اليوريا عازلة
0.22 & micro; مرشحm MilliporeSLGP033RBلاستخدامه لتصفية اليوريا العازلة
PFTE مدقة ، 2 ملKartell6302جزء من خالط Potter-Elvehjem
ملاط زجاجي البورسليكاتKartell6102جزء من Potter-Elvehjem
homogenizer StirrerVELP scientificaStirrer DLHلاستخدامها في التجانس بواسطة Potter-Elvehjem
فحص البروتين برادفوردمختبرات Bio-Rad5000006
أنبوب دوارPbi InternationalF205
رقائق
الألومنيوم النيتروجين
صندوق البوليسترين
للطرد المركزي لأنابيب الطرد المركزي سعة 1.7 مل عند 13,000 × جم
فريزر -80 درجة ؛ C
الدقة
التوازن الأوتوكلافللتعقيم
قفازات التبريد للنيتروجين
قفازات
التهوية القسرية المهنية وفرنللهواء الطبيعي للتعقيم
كوكتيل مثبط البروتيازSigma aldrichP8340-5ML100X محلول
ProteoExtract طقم ترسيب البروتينCalbiochem539180
RapiGestWaters186001861
Cytoscapewww.cytoscape.org الإصدار 2.7منصة برمجية لتحليل الأنطولوجيا الجينية
BiNGOhttp://apps.cytoscape.org/apps/bingoالإصدار 3.0.3البرنامج المساعد لتحليل الأنطولوجيا الجينية
AlphaB Crystallin / CRYAB الأجسام المضادةNovus BiologicalsNBP1-97494الجسم المضاد أحادي النسيلة للفأر ضد CryAB
Septin-11 الجسم المضادNovus BiologicalsNBP1-83824الجسم المضاد متعدد النسيلة للأرانب ضد septin-11
FHL1 الجسم المضادNovus BiologicalsNBP-188745الأرانب الأجسام المضادة متعددة النسيلة ضد FHL-1
Dermatopontin الأجسام المضادةNovus BiologicalsNB110-68135أجسام مضادة متعددة النسيلة للأرانب ضد dermatopontin
الماعز المضاد للفأر IgG HRPSigma aldrichA4416-0.5MLجسم مضاد ثانوي للنشاف المناعي
مختبرات الماعز المضادة للأرانب IgG HRPBio-Rad170-5046الجسم المضاد الثانوي للنشاف المناعي
ملحي من الفولاذ المقاوم للصدأمن الفولاذ المقاوم للصدأ من الفولاذ المقاوم للصدأ للتعقيم قابل الأيزوبروبيل الهيدروجين الدولي اليوريا السائل الثلجي جهاز طرد مركزي للثلج الجافالسائل الحمل الحراري

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nat Rev Genet. 13 (4), 227-232 (2012).
  2. de Sousa Abreu, R., Penalva, L. O., Marcotte, E. M., Vogel, C. Global signatures of protein and mRNA expression levels. Mol Biosyst. 5 (12), 1512-1526 (2009).
  3. Hanash, S. Disease proteomics. Nature. 422 (6928), 226-232 (2003).
  4. Ahram, M., Petricoin, E. F. Proteomics Discovery of Disease Biomarkers. Biomark Insights. 3, 325-333 (2008).
  5. Chandramouli, K., Qian, P. Y. Proteomics: challenges, techniques and possibilities to overcome biological sample complexity. Hum Genomics Proteomics. 2009, (2009).
  6. Singleton, C. Recent advances in bioanalytical sample preparation for LC-MS analysis. Bioanalysis. 4 (9), 1123-1140 (2012).
  7. Williams, T. H., Jew, J. Y. Is the mitral valve passive flap theory overstated? An active valve is hypothesized. Med Hypotheses. 62 (4), 605-611 (2004).
  8. Rabkin, E., et al. Activated interstitial myofibroblasts express catabolic enzymes and mediate matrix remodeling in myxomatous heart valves. Circulation. 104 (21), 2525-2532 (2001).
  9. Martins Cde, O., et al. Distinct mitral valve proteomic profiles in rheumatic heart disease and myxomatous degeneration. Clin Med Insights Cardiol. 8, 79-86 (2014).
  10. Tan, H. T., et al. Unravelling the proteome of degenerative human mitral valves. Proteomics. 15 (17), 2934-2944 (2015).
  11. Banfi, C., et al. Proteome of platelets in patients with coronary artery disease. Exp Hematol. 38 (5), 341-350 (2010).
  12. Banfi, C., et al. Proteomic analysis of human low-density lipoprotein reveals the presence of prenylcysteine lyase, a hydrogen peroxide-generating enzyme. Proteomics. 9 (5), 1344-1352 (2009).
  13. Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem. 193 (1), 265-275 (1951).
  14. Banfi, C., et al. Very low density lipoprotein-mediated signal transduction and plasminogen activator inhibitor type 1 in cultured HepG2 cells. Circ Res. 85 (2), 208-217 (1999).
  15. Brioschi, M., et al. Normal human mitral valve proteome: A preliminary investigation by gel-based and gel-free proteomic approaches. Electrophoresis. 37 (20), 2633-2643 (2016).
  16. Brioschi, M., Lento, S., Tremoli, E., Banfi, C. Proteomic analysis of endothelial cell secretome: a means of studying the pleiotropic effects of Hmg-CoA reductase inhibitors. J Proteomics. 78, 346-361 (2013).
  17. Sun, S., Zhou, J. Y., Yang, W., Zhang, H. Inhibition of protein carbamylation in urea solution using ammonium-containing buffers. Anal Biochem. 446, 76-81 (2014).
  18. Rabilloud, T., Adessi, C., Giraudel, A., Lunardi, J. Improvement of the solubilization of proteins in two-dimensional electrophoresis with immobilized pH gradients. Electrophoresis. 18 (3-4), 307-316 (1997).
  19. Santoni, V., Molloy, M., Rabilloud, T. Membrane proteins and proteomics: un amour impossible? Electrophoresis. 21 (6), 1054-1070 (2000).
  20. Shechter, D., Dormann, H. L., Allis, C. D., Hake, S. B. Extraction, purification and analysis of histones. Nat Protoc. 2 (6), 1445-1457 (2007).
  21. Fujiki, Y., Hubbard, A. L., Fowler, S., Lazarow, P. B. Isolation of intracellular membranes by means of sodium carbonate treatment: application to endoplasmic reticulum. J Cell Biol. 93 (1), 97-102 (1982).
  22. Gorg, A., Weiss, W., Dunn, M. J. Current two-dimensional electrophoresis technology for proteomics. Proteomics. 4 (12), 3665-3685 (2004).
  23. Mann, M., Kelleher, N. L. Precision proteomics: the case for high resolution and high mass accuracy. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18132-18138 (2008).
  24. Thakur, S. S., et al. Deep and highly sensitive proteome coverage by LC-MS/MS without prefractionation. Mol Cell Proteomics. 10 (8), M110.003699(2011).
  25. Loardi, C., et al. Biology of mitral valve prolapse: the harvest is big, but the workers are few. Int J Cardiol. 151 (2), 129-135 (2011).
  26. Schoen, F. J. Evolving concepts of cardiac valve dynamics: the continuum of development, functional structure, pathobiology, and tissue engineering. Circulation. 118 (18), 1864-1880 (2008).
  27. Lelovas, P. P., Kostomitsopoulos, N. G., Xanthos, T. T. A comparative anatomic and physiologic overview of the porcine heart. J Am Assoc Lab Anim Sci. 53 (5), 432-438 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Protein ExtractionMitral ValveProteomic AnalysisUrea BufferLiquid Nitrogen GrindingBradford AssayTwo Dimensional ElectrophoresisLiquid Chromatography Mass SpectrometryGene Ontology AnalysisCardiac Valve Disease

Related Articles