Method Article

جيل من الفئران المعدلة وراثيا من خلال ميكروينجكتيون من البويضات

DOI:

10.3791/55765

⸱

June 15th, 2017

 , 
1Transgenic Animal Unit, Mark Wainwright Analytical Centre, University of New South Wales

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يستخدم حقن ميكروينجكتيون من البويضات الماوس لكل من ترانسجينيسيس الكلاسيكية ( أي التكامل العشوائي للجينات المحورة وراثيا) و كريسبر بوساطة استهداف الجينات. هذا البروتوكول يستعرض أحدث التطورات في ميكروينجكتيون، مع التركيز بشكل خاص على مراقبة الجودة واستراتيجيات التنميط الجيني.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد ساهم استخدام الفئران المعدلة وراثيا بشكل كبير في الدراسات على كل من الفسيولوجية والمرضية في عمليات الجسم الحي . حقن برونوكلار من التعبير الحمض النووي يبني في البويضات المخصبة لا يزال الأسلوب الأكثر شيوعا لتوليد الفئران المعدلة وراثيا ل أوفيركسريسيون. مع إدخال تكنولوجيا كريسبر لاستهداف الجينات، وقد تم تمديد حقن برونوكلار في البويضات المخصبة لتوليد كل من خروج المغلوب والفئران نوكين. ويصف هذا العمل إعداد الحمض النووي للحقن وتوليد أدلة كريسبر لاستهداف الجينات، مع التركيز بشكل خاص على مراقبة الجودة. إجراءات التنميط الجيني المطلوبة لتحديد المؤسسين المحتملين أمر بالغ الأهمية. وترد في هذا التقرير استراتيجيات مبتكرة للتنميط الجيني تستفيد من قدرات "تعدد الإرسال" في نظام كريسبر. كما يتم تحديد الإجراءات الجراحية. معا، فإن خطوات البروتوكول تسمح لتوليد جينالفئران المعدلة إيكاليا ولإنشاء لاحق من مستعمرات الماوس لمجموعة كبيرة من مجالات البحث، بما في ذلك علم المناعة، علم الأعصاب، والسرطان، وعلم وظائف الأعضاء، والتنمية، وغيرها.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وكانت النماذج الحيوانية، سواء في الفقاريات واللافقاريات، مفيدة لفحص الفيزيولوجيا المرضية للظروف البشرية مثل مرض الزهايمر 1 ، 2 . وهي أيضا أدوات لا تقدر بثمن للبحث عن معدلات المرض وتطوير استراتيجيات العلاج الجديدة في نهاية المطاف على أمل العلاج. على الرغم من أن كل نموذج له قيود جوهرية، واستخدام الحيوانات والنماذج النظامية بأكملها أمر حيوي للبحوث الطبية الحيوية. وذلك لأن البيئة الفسيولوجية الأيضية والمعقدة لا يمكن محاكاة تماما في زراعة الأنسجة.

حتى الآن، لا يزال الفأر أنواع الثدييات الأكثر شيوعا المستخدم....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تمت الموافقة على جميع الإجراءات من قبل جامعة نيو ساوث ويلز رعاية الحيوانات والأخلاقيات اللجنة.

1. إعداد التحوير (التكامل العشوائي)

  1. تحليلي أغاروس هلام الكهربائي.
    1. هضم البلازميد لاستخراج التحوير باستخدام الانزيمات المناسبة (1 ساعة حضانة) أو سريع الهضم الإنزيمات (15 إلى 30 دقيقة الحضانة) في ثيرمويكلر بعد توصيات الشركة الصانعة (انظر الشكل 2A

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أدناه، يتم وصف سير العمل ل ميكروينجكتيون في حالة التكامل العشوائي و كريسبر بوساطة استهداف الجينات ( الشكل 1 ).

figure-results-1
الشكل 1: سير العمل النموذجي لتوليد الفئران المعدلة وراثيا. للتكامل العشوائي، يتم حقن التحوير المنقى في نواة ا.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

خطوات حاسمة داخل البروتوكول

ومن المعروف أن توليد الفئران المعدلة وراثيا أن يكون تحديا من الناحية الفنية. ومع ذلك، فإن بروتوكول المقدمة هنا هو الأسلوب الأمثل والمبسط الذي يسمح لإتقان واستكشاف هذه التقنية في وقت قياسي. هناك خطوتان ضروريتان لإنجاز هذه التقنية بنجاح. أولا، يمكن أن يتم تركيب قوالب الحمض النووي الخطي (لتوليف سغرناس) دون كلوريد المغنيسيوم (مغكل 2 ). ومع ذلك، فمن المستحسن أن تضيف بانتظام مغكل

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوفر المؤلفون خدمات ترانزجينيسيس الأكاديمية في الفئران عبر جامعة نيو ساوث ويلز مركز مارك وينوريت التحليلية.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويشكر المؤلفون موظفي مرفق الحيوانات (برك) على دعمهم المستمر. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المجلس الوطني للصحة والبحوث الطبية ومجلس البحوث الأسترالي.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ماصة دقيقة 0.1-2.5 مو ؛ LEppendorf4920000016
ماصة دقيقة 2 - 20 & LEppendorf4920000040
ماصة دقيقة 20 - 200 مو ؛ LEppendorf4920000067
ماصة دقيقة 100 - 1,000 مو ؛ LEppendorf4920000083
علامة الوزن الجزيئي  BiolineBIO-33025HyperLadder 1 kb
علامة الوزن الجزيئي BiolineBIO-33056HyperLadder 100 bp
AgaroseBiolineBIO-41025
EDTA bufferSigma-Aldrich9329610x - تمييع إلى 1x
بروميد الإيثيديومThermo Fisher Scientific15585011
SYBR صبغة جل آمنةInvitrogenS33102
طقم استخراج جلQiagen28706
طقم تنقية PCR (Qiaquick) نظامفراغ Qiagen28106
(مشعب) PromegaA7231
عازلة الحقن المجهري الخالية من Nuclease   ؛MilliporeMR-095-10F
Ultrafree-MC مرشح الطرد المركزي الدقيق MilliporeUFC30GV00
Cas9 mRNASigma-AldrichCAS9MRNA
CRISPR يعبر عن البلازميد (px330)Addgene42230
ماء خال من النوياتSigma-AldrichW4502
Phusion polymeraseNew England BiolabsM0530L
T7 مجموعة الحمض النووي الريبي السريع عالي الإنتاجيةنيو إنجلاند BiolabsE2050S
أعمدة تدور تنقية الحمض النووي الريبي (NucAway)Thermo Fisher ScientificAM10070
ssOligosSigma-AldrichOLIGO STANDARD
المتبرع بلازميدثيرمو فيشر العلميالجينات Art
HyaluronidaseSigma-AldrichH3884
KSOMaa وسط زراعة الأجنةZenith Biotech ZEKS-100
الزيوت المعدنيةZenith Biotech ZSCO-100
M2 متوسطسيجما-ألدريتشM7167
السيتوكالاسين بسيجما-ألدريتشC6762
لسان حالسيجما-ألدريتشA5177
الشعيرات الدموية الدقيقة الزجاجيةأداة سوترBF100-78-10
بروتيناز KApplichemA3830.0100
ملقط دومون # 5أدوات العلوم الدقيقة 91150-20
مقص قزحيةأدوات العلوم الدقيقة 91460-11
مشبك السفينةأدوات العلوم الدقيقة 18374-43
مشابك الجرح أدوات العلوم الدقيقة 12040-01
تطبيق المقاطع  أدوات العلوم الدقيقة 12018-12
مقص دقيق أدوات العلوم الدقيقة 15000-03
أدواتالعلوم الدقيقة للكي 18000-00
خيوط جراحية غير قابلة للامتصاص (Ethilon 3-0)Ethicon1691H
5٪ CO2< / sub> حاضنةMG ScientificGalaxy 14S
مقياس الطيف الضوئيThermo Fisher ScientificNanodrop 2000c
ThermocyclerEppendorf6321 000.515
إعداد الرحلان الكهربائيBioRad1640300
Transilluminator للأشعة فوق البنفسجيةBioRad1708110EDU
ThermocyclerEppendorfمجهر مجهري 6334000069
OlympusSZX7
مجهر مقلوبأوليمبوسIX71
2x معالجات دقيقةEppendorf5188000.012
البويضات مناورEppendorf5176000.025
حاقن دقيق (Femtojet)Eppendorf5247000.013
الفئران C57BL / 6J سلالةالموارد الحيوية الأستراليةC57BL / 6JAusb  

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ittner, L. M. Dendritic function of tau mediates amyloid-beta toxicity in Alzheimer's disease mouse models. Cell. 142 (3), 387-397 (2010).
  2. Ittner, A. Site-specific phosphorylation of tau inhibits amyloid-beta toxicity in Alzheimer's mice. ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Genetically Modified MiceOocyte MicroinjectionPronuclear InjectionCRISPR Gene TargetingGuide RNA SynthesisDNA PurificationRNA TranscriptionSurgical ReimplantationGenotyping ProceduresFounder Identification

Related Articles