الجريزوفولفوغرافيا من بلورات البروتين و<em&gt; في سيليولو</em&gt; الانعراج

ملخص

يتم تقديم بروتوكول لعلم البلورات بالأشعة السينية باستخدام الجريزوفريستالز البروتين. يتم مقارنة مثالين تحليل في الجريزوفريستالز الجسم الحي -grown بعد تنقية أو في السليلو .

الملخص

وقد أتاح ظهور خطوط ميكروفوكوس عالية الجودة في العديد من مرافق السنكروترون التحليل الروتيني للبلورات أصغر من 10 ميكرون في أكبر بعد لها، والتي كانت تمثل تحديا. نقدم اثنين من سير العمل البديلة لتحديد هيكل البروتينات الكريستالات بواسطة البلورات بالأشعة السينية مع التركيز بشكل خاص على بلورات نمت في الجسم الحي . يتم استخراج الجريزوفولفات إما من الخلايا عن طريق سونيكاتيون وتنقيته بواسطة الطرد المركزي التفاضلي، أو تحليلها في السليلو بعد فرز الخلايا عن طريق التدفق الخلوي للخلايا التي تحتوي على الكريستال. اختياريا، بلورات نقية أو الخلايا المحتوية على الكريستال غارقة في حلول ذرة ثقيلة للمرحلة التجريبية. ثم يتم إعداد هذه العينات لتجربة الانعراج بطريقة مماثلة من خلال تطبيق على دعم ميكروميش والتبريد فلاش في النيتروجين السائل. نحن تصف بإيجاز ومقارنة التجارب حيود المسلسل من البلورات الصغيرة معزولة والكريستال،التي تحتوي على خلايا باستخدام شعاع ميكروفوكوس سينكروترون لانتاج مجموعات البيانات مناسبة للمرحلة، وبناء نموذج والصقل.

وتتمثل هذه سير العمل مع بلورات من بومبيكس موري سيبوفيروس 1 (BmCPV1) بوليهدرين تنتجها عدوى الخلايا الحشرية مع فيروس باكولوف المؤتلف. في هذه الدراسة الحالة، في تحليل السليلو هو أكثر كفاءة من تحليل البلورات المنقى وتنتج بنية في ~ 8 أيام من التعبير إلى صقل.

المقدمة

وقد شهد استخدام بلورات الأشعة السينية لتحديد هياكل عالية الدقة من الجزيئات البيولوجية تقدما مطردا على مدى العقدين الماضيين. إن الإقبال المتزايد على التصوير البلوري بالأشعة السينية من قبل الباحثين غير الخبراء يمثل نموذجا ديموقراطيا لهذا النهج في العديد من مجالات علوم الحياة ¹ .

تاريخيا، بلورات مع أبعاد أدناه ~ 10 ميكرون وقد اعتبرت صعبة، إن لم يكن غير صالحة للاستعمال، لتحديد هيكل. وقد أدى ازدياد توافر مصادر الإشعاع السنكروتروني المكروية المتناهية الصغر في جميع أنحاء العالم، والتقدم التكنولوجي، مثل تطوير الأدوات لمعالجة الجراثيم الصغيرة، إ....

البروتوكول

ملاحظة: في التبلور الجسم الحي وقد ذكرت في العديد من الكائنات الحية بما في ذلك البكتيريا والخميرة والنباتات والحشرات والثدييات (استعرض في المرجع ²¹ ). كما تم تحقيق تبلور البروتينات المؤتلف في المختبر باستخدام ترنسفكأيشن عابرة من خلايا الثدييات وعدوى باكولوفيروس من خلايا الحشرات. وقد تم تطوير البروتوكول التالي باستخدام بومبيكس موري سيبوفيروس 1 (BmCPV1) بولهيدرين الجينات المستنسخة في فيروس باكولوف المؤتلف تحت المروج بولهيدرين باكولوفيرين، ولدت وفقا للتعليمات في المرجع ²² . وهكذا، على الرغم من أن هذا البروتوكول قد تتكيف مع أنواع الخلايا الأخرى (على سبيل ....

النتائج

يتم عرض لمحة عامة عن كل من الطرق البديلة لتحديد هيكل باستخدام في ميكروفروستالس الجسم الحي ( الشكل 1 ). بوليهيدرا يمكن بسهولة تنقيته سونيكاتيون والطرد المركزي. نظرا لكثافتها، فإنها تشكل طبقة في الجزء السفلي من الأنبوب تحت طبقة من الحطام التي يمكن إزالتها بواسطة بيبتينغ ( الشكل 3A و 3 B ). ثم يتم إخضاع العينة لعدة جولات من سونيكاتيون ويغسل حتى يتم التوصل إل.......

المناقشة

ويوفر هذا البروتوكول نهجين لتحليل البلورات الصغيرة بهدف تسهيل تحليل بلورات صغيرة جدا التي كان يمكن التغاضي عنها في الماضي.

خطوات حاسمة لتنقية ميكروكريستال
وقد تم تحسين البروتوكول المقدم باستخدام بومبيكس موري CPV1 بوليهدرين أعرب في الخلايا Sf9 كنموذج النظام. ومع ذلك، في ميكروفروستالس الجسم الحي عرض تباين كبير في المقاومة الميكانيكية. على سبيل المثال، كاثبسين B بلو.......

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
Sf9 cells	Life Technologies
SF900-SFM الحشرات المتوسطة	Life Technologies
1 L قارورة زراعة الخلايا	Thermofisher حاضنة اهتزاز علمية
لزراعة خلايا الحشرات	Eppendorf
50 مل أنابيب مخروطية	Falcon
مع دلاء متأرجحة ل 50 مل أنابيب	Eppendorf
Sonicator مجهزة بمسبار 19 مم	MSE Soniprep 150 & nbsp ؛
الشرائح الزجاجية	هامبتون للأبحاث
الدم	سيجما ألدريتش
بروبيديوم يوديد	ثيرموفيشر العلمي
BD فارز الخلايا	BD Biosciences هامبتون
شاشات ذرة ثقيلة	هامبتون ريسيرش
أجهزة الطرد المركزي	الدقيقة Eppendorf
Micromesh	Mitigen		700/25 توفر الشبكات سطحا أكبر. يمكن شراء الشبكات المفهرسة للدراسات المنهجية.
الفتيل الورقي	Mitigen		يمكن أن يختلف حجم الفتيل الورقي لتحقيق التدفق الأمثل. سيعتمد هذا إلى حد كبير على طبيعة البلورات والقوام بالتبريد المستخدمة.
الإيثيلين جلايكول	سيجما-ألدريتش
تريبان الأزرق	لايف تكنولوجيز
MX2 خط شعاع التركيز الدقيق	السنكروترون		يمكن العثور على قائمة بخطوط الشعاع الدقيقة المتاحة في Boudes et al.< / em> (2014) تأملات في العديد من جوانب البروتين Microcrystallography.< / em> المجلة الأسترالية للكيمياء 67 (12) ، 1793 & ndash; 1806 ، < br / > doi: 10.1071 / CH14455.

مقياس الأسترالي