هذا العمل يدل على نهج جديد لتقييم الانتشار، والتمايز، وإمكانية تشكيل السفينة من الخلايا الجذعية البطانية الأوعية الدموية (فيسس) من خلال الثديية زرع لوحة الدهون تليها كامل جبل إعداد الأنسجة للمراقبة المجهرية. كما يتم عرض استراتيجية تتبع النسب للتحقيق في سلوك فيسكس في الجسم الحي .
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تقنية زرع الثدي الثديية الرواية جديدة لتصور الجيل سفينة من الخلايا الجذعية البطانية الأوعية الدموية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الخلايا البطانية (إكس) هي اللبنات الأساسية للهندسة المعمارية الأوعية الدموية والتوسط نمو الأوعية الدموية وإعادة عرض لضمان التنمية السليم السفينة والتوازن. ومع ذلك، لا تزال الدراسات على التسلسل الهرمي البطانة بعيد المنال بسبب عدم وجود أدوات للوصول وكذلك لتقييم مباشرة سلوكهم في الجسم الحي . لمعالجة هذا القصور، تم تطوير نموذج أنسجة جديدة لدراسة الأوعية الدموية باستخدام لوحة الدهون الثديية. الغدة الثديية تتطور في الغالب في مراحل ما بعد الولادة، بما في ذلك سن البلوغ والحمل، ويرافق خلالها انتشار ظهارة قوية عن طريق إعادة عرض الأوعية الدموية واسعة النطاق. منصات الثدي الثديية توفر مساحة، مصفوفة، والمحفزات وعائية غنية من ظهارة الثديية المتنامية. وعلاوة على ذلك، وتقع منصات الدهون الثديية خارج تجويف البريتوني، مما يجعلها موقع التطعيم يمكن الوصول إليها بسهولة لتقييم إمكانات وعائية للخلايا الخارجية. يصف هذا العمل أيضا فعاليةنت تتبع النهج باستخدام الفئران مراسل الفلورسنت لتسمية على وجه التحديد السكان المستهدفين من الخلايا الجذعية البطانية الأوعية الدموية (فيسس) في الجسم الحي . هذه الطريقة تتبع النسب، إلى جانب الأنسجة اللاحقة المجهر كامل جبل، وتمكين التصور المباشر من الخلايا المستهدفة ونسلهم، والتي من خلالها يمكن قياس القدرة على التكاثر ويمكن أن يكون التزام التمايز مصير تعيينها. باستخدام هذه الأساليب، وقد تم مؤخرا تحديد عدد من البروتينات C مستقبلات البروتين (بروكر) معربا عن فيسكس في أنظمة الأوعية الدموية متعددة. بروكر + فيسكس، مما يؤدي إلى كل من إكس و بيريسيتس جديدة، وتساهم بنشاط في تكوين الأوعية أثناء التنمية والتوازن، وإصلاح الإصابات. عموما، هذه المخطوطة يصف جديد الثديية زرع لوحة الدهون وفي الجسم الحي تقنيات تتبع النسب التي يمكن استخدامها لتقييم خصائص الخلايا الجذعية من فيسكس.
المقدمة
خلال التنمية والتوازن، ونمو الأوعية الدموية وإعادة عرض بأمانة تأخذ مكان وفقا لنمو الجهاز وإصلاحه. يصف الأوعية الدموية توليد سفن جديدة من الأوعية الدموية الموجودة من قبل، ويعتبر قوة رئيسية تتوسط هذه التغيرات الأوعية الدموية الحيوية. كل الأوعية الدموية هي مبطنة الداخلية مع طبقة من الخلايا البطانية (إكس)، ويبدو أنها أساس بنية السفينة. لفترة طويلة، والآلية التي من خلالها يتم تجديد تجمع المفوضية الأوروبية خلال التوازن لا تزال غير واضحة، وأثيرت الحجج حول ما إذا كان دوران الأوعية الدموية هو نتيجة للانتشار إيك ناضجة أو هو مساهمة أنشطة الخلايا الجذعية الأوعية الدموية / السلف. نظرا لعدم وجود أدلة فسيولوجية مباشرة، ووجود والهوية الخلوية للخلايا الجذعية البطانية الأوعية الدموية (فيسس) ظلت أيضا مثيرة للجدل.
واحدة من النهج الأكثر شيوعا المستخدمة للتحقق من سلوك الخلايا الجذعية هي من خلال ترانسبلانتاتيون من الخلايا الجذعية المفترضة في الفئران المتلقية. يقيس هذا الأسلوب إمكانات الجذعية من الخلايا الجذعية المرشحة في الجسم الحي. تم تطبيق زرع لأول مرة لدراسة الخلايا الجذعية نخاع العظم 1 ، والتي ساهمت في إنشاء الخصائص الهرمية للنظام المكونة للدم 2 . في مجال البطانية، وكان مصفوفة الغشاء القاعدي (على سبيل المثال، ماتريجيل) المكونات المدرجة تحت الجلد تحت الجلد الجناح معيارا في الجسم الحي فحص الأوعية الدموية المستخدمة لمعالجة قدرات تكوين السفن من إكس المزروعة. وقد اقترح أساليب تجريبية متعددة، بما في ذلك تشكيل مستعمرة في نظم الثقافة 3D وزرع، المحتملين السلف الأوروبي / سكان فيسك 3 ، 4 ، 5 ، 6 . ومع ذلك، منذ إكس جزءا لا يتجزأ من مصفوفة الغشاء القاعدي منفصلة نسبيا عنالأنسجة المحيطة بها، وهذا لا يوفر البيئة المتخصصة الأمثل المطلوبة لاستكشاف كامل إمكانات وعائية من الخلايا المزروعة. ونتيجة لذلك، فإن السفن التي تشكلت داخل قابس المصفوفة تكون في الغالب شبيهة بالشعرية، ولا يمكن قياسها وظيفيا.
الغدة الثديية تتطور بعد الولادة، مع النمو الأكثر قوة التي تحدث أثناء سن البلوغ والحمل. في مرحلة البلوغ، ظهارة الثديية يخضع التوسع السريع، لاحتلال كامل لوحة الدهون الثديية، يرافقه إعادة عرض كفاءة الهياكل الأوعية الدموية المحيطة بها. وبالتالي، فإن الغدة الثديية تقدم نموذجا ممتازا لدراسة الأوعية الدموية. أنه يوفر مساحة، مصفوفة، والمحفزات وعائية غنية من ظهارة الثديية المتنامية، وبالتالي هو موقع تطعيم مثالية لتقييم إمكانات وعائية للخلايا الخارجية. وبالإضافة إلى ذلك، لوحة الدهون الثديية يسمح للسفن الخارجية شكلت لدمج مع نظام الدورة الدموية المضيف، مما يتيح مزيد من وتقييم وظيفي ويمثل ميزة على زرع تحت الجلد.
على الرغم من أن في المختبر زراعة وفحوصات زرع هي وسيلة فعالة للتحقيق في خصائص تجديد السكان الخلية، فمن المعروف أن مثل هذه المقايسات قد تحفز اللدونة كما تؤخذ الخلايا بعيدا عن موائلها الأصلية، والتغيرات التي قد تحدث عندما يتم فصل الخلايا من محيطهم الفسيولوجية 7 . لذلك، والحصول مباشرة في دليل الجسم الحي من مصير الخلية هو النهج الرئيسي لتعزيز الفهم الحالي لسلوك السكان البطانية.
رسم الخرائط الوراثية مصير ( أي في الجسم الحي تتبع النسب) أمر حتمي لتحديد فيسكس والتحقيق في خصائصها في نظام الجسم، كما يمكن أن تكشف في الجسم الحي سلوك الخلايا الجذعية في سياقها الفسيولوجي، ويمكن أن تكون الجذعية الفعلية تقييم. النسب تراسينانوغرام يوفر دليلا مباشرا على استمرار على المدى الطويل ( أي التجديد الذاتي) من المرشحات فيسكس وقدرتها على إنتاج أنواع الخلايا للأنسجة المنشأ ( أي قوة التمايز).
يصف هذا البروتوكول الرواية الثديية تقنية زرع لوحة الدهون وطريقة تتبع النسب لمراقبة قدرة توليد السفن من فيسكس. هذه التقنيات التغلب على أوجه القصور من المقايسات المتاحة حاليا وتوفير طريقة جديدة لتقييم أمثل خصائص الخلايا الجذعية فيسكس. هذه النهج هي أدوات فعالة التي يمكن استخدامها لتقييم السلوك والخصائص تشكيل السفن من السكان البطانية، وكذلك لتحديد الأوعية الدموية تعديل قوة عزم في بيئة مرضية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تمت الموافقة على الإجراءات التجريبية من قبل لجنة رعاية الحيوان واستخدام معهد شنغهاي للكيمياء الحيوية وبيولوجيا الخلية، والأكاديمية الصينية للعلوم بموجب بروتوكول المعتمدة سيبسب-ناف-15-002-S335-003.
1. عزل فيسكس من الغدة الثديية الماوس
- الغدة الثديية الحصاد والأنسجة الهضم.
- استخدام أكتين-غفب البالغ من العمر 8 أسابيع الفئران مراسل العذراء الناضجة، مع الأوزان تتراوح بين 20 و 25 غراما، والمانحين الأنسجة.
ملاحظة: خلايا نشأت من المتبرع يمكن تعقبها بسهولة عن طريق التعبير غفب. - إعداد الأنسجة المتوسطة قاعدة الهضم تتكون من 5٪ مصل بقري الجنين (فبس)، 1٪ القلم / بكتيريا، و 25 ملي هيبيس في RPMI1640. تصفية الخليط من خلال مرشح 0.22 ميكرون لتعقيم وقبل دافئ إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي.
- التضحية الفئران في غرفة كو 2 . تشريح من الزوج الرابع من الغدد الثديية الأربية من خلال صنع أول الجلد العمودي طنسيسيون في خط الوسط السفلي في البطن باستخدام مشرط (أو مقص جراحي). قشر بلطف الجلد إلى جانب واحد لفضح الغدة الثديية الأربية باستخدام ملقط. الحصول على الغدد الثديية الأربية الرابعة من كلا الجانبين وقطعها إلى قطع غرامة في طبق بتري 6 سم باستخدام مقص.
- قياس الوزن الكلي للأنسجة المفروم ووضعه في أنبوب 50 مل.
ملاحظة: تأكد من أن اللحم المفروم الأنسجة الناتجة أصغر من 1 ملم 3 في الحجم لكل قطعة. العائد النموذجي هو حوالي 5000 فيسكس لكل حيوان.
- قياس الوزن الكلي للأنسجة المفروم ووضعه في أنبوب 50 مل.
- إعداد وسط قاعدة الهضم في 50 مل أنبوب الطرد المركزي توج في حجم 10 مل لكل 1 غرام من اللحم المفروم الأنسجة. إضافة كولاجيناز نوع 3 بتركيز 300 وحدة لكل 10 مل من وسط قاعدة الهضم لتشكيل العازلة الهضم. مزيج بالتساوي وإضافته إلى اللحم المفروم الأنسجة.
- أفقيا وضع أنبوب الطرد المركزي 50 مل على منصة هزاز وتعيين السرعة إلى 100 دورة في الدقيقة ودرجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية. حاورالأنسجة الثديية لمدة 2 ساعة. تحقق ويهز أنبوب يدويا كل 20 دقيقة لضمان الهضم السليم.
ملاحظة: الغرض من هضم الأنسجة قبل فاكس هو إعداد حل خلية واحدة من الأنسجة الصلبة. لذلك، بحلول نهاية الهضم، يجب أن يكون المحتوى حلا سميكا دون قطعة الأنسجة المرئية.
- استخدام أكتين-غفب البالغ من العمر 8 أسابيع الفئران مراسل العذراء الناضجة، مع الأوزان تتراوح بين 20 و 25 غراما، والمانحين الأنسجة.
- إعداد حل خلية واحدة.
- بعد الهضم، أعلى متابعة أنبوب الطرد المركزي 50 مل مع ما قبل تحسنت، برنامج تلفزيوني العقيمة وعكس الأنبوب لخلط بالتساوي. الطرد المركزي أنبوب في 200 x ج لمدة 5 دقائق للحصول على بيليه الخلية.
- إزالة طاف ونفض الغبار الجزء السفلي من أنبوب لتخفيف بيليه الخلية. إضافة في 3 مل من خلايا الدم الحمراء يسينغ العازلة (انظر الجدول من المواد) واحتضان في هود ثقافة الأنسجة في درجة حرارة الغرفة (رت) لمدة 5 دقائق للقضاء على خلايا الدم الحمراء.
- إضافة 10 مل من برنامج تلفزيوني العقيمة وعكس الأنبوب لخلط بالتساوي. الطرد المركزي محتوى الأنسجة في 200 x ج لمدة 5 دقائق والقرصأرد طاف. إضافة في 3 مل من قبل تحسنت 0.05٪ التربسين وتخزين الأنبوب عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لمزيد من هضم الأنسجة المتبقية.
- إضافة في 3 مل من إدمم قبل تحسنت ثم قم بإضافة 100 ميكرولتر من الدناز I حل (0.25 ملغ من الدناز الأول المخفف في 1 مل من برنامج تلفزيوني). تخزين الأنبوب في 37 درجة مئوية لتفريق خيوط الحمض النووي. تمرير خليط الأنسجة من خلال مصفاة خلية 70 ميكرون للحصول على حل الخلية. شطف مصفاة مرتين مع 2 مل من برنامج تلفزيوني + 5٪ فبس لتحييد الهضم الأنزيمي.
- الطرد المركزي خليط الخلية في 200 x ج لمدة 5 دقائق إلى بيليه الخلايا. تجاهل طاف و ريسوسبيند بيليه الخلية في 1 مل من برنامج تلفزيوني + 5٪ فبس لتلطيخ الأجسام المضادة.
- فاكس على أساس بروكر + فيسك العزلة.
- موضوع خليط الخلية التي تم الحصول عليها من الأنسجة الثديية المانحة إلى تلطيخ الأجسام المضادة بعد نشر بروتينات روتينية 8 .
ملاحظة: تم استخدام الأجسام المضادة التالية: مكافحة الماوس(فيك، المضادة للماوس CD31 (PECAM1) -PECY7، المضادة للماوس CD105-أبك (كل استخدامها في تركيز 1 ميكروغرام / مل)، ومكافحة الماوس CD201 (بروكر) -بيوتين (تستخدم بتركيز 2.5 ميكروغرام / مل)، و ستريبتافيدين-v450 (تستخدم بتركيز 0.5 ميكروغرام / مل).- بعد تلطيخ الأجسام المضادة، أعلى متابعة الخلايا مع برنامج تلفزيوني + 5٪ فبس ثم الطرد المركزي في 200 غرام لمدة 5 دقائق. تجاهل طاف و ريسوسبيند الخلايا مع 1 مل من برنامج تلفزيوني + 5٪ فبس. تصفية من خلال مصفاة الخلية 40 ميكرون. مكان على الجليد حتى فرز فاكس.
- المضي قدما لإجراء فرز يستند إلى نظام التشغيل فاكس لعزل بروكر + فيسكس.
- تحليل العينة غير ملوثين وكل عنصر تحكم لون واحد لتحديد الجهد لكل لون. حساب المعلمات تعويض لتجنب لصناعة السيارات في مضان أو تلطيخ الخلفية. إعداد قالب للتباعد الصحيح والفرز للسكان الخلية المطلوب.
- لإنشاء التسلسل الهرمي لل فاكس فرز، أولا القضاء على الحطام منكل الأحداث ومن ثم تجاهل دوبلتس أو مجموعات الخلايا اللاصقة عن طريق اثار مع العرض. بوابة خارج خلايا الأنساب الدم ومن ثم استخدام CD31 + و CD105 + لتحديد السكان البطانية.
ملاحظة: تم عزل بروكر + الخلايا من CD31 + CD105 + إكس مقارنة مع التحكم فمو. ويرد مخطط تحليل فاكس فاكس في الشكل 1 . يجب أن يتم تعليق سكان فيسك معزولة فاكس في إدم + 50٪ فبس وتخزينها على الجليد حتى مزيد من المعالجة.
- موضوع خليط الخلية التي تم الحصول عليها من الأنسجة الثديية المانحة إلى تلطيخ الأجسام المضادة بعد نشر بروتينات روتينية 8 .
2. في فيفو فيسك سفينة تشكيل الفحص باستخدام الدهون الثديية الوسادة
- إعداد إكس الأولية لزرع.
- أعلى متابعة الخلايا فرزها فاكس مع 10 مل من برنامج تلفزيوني + 5٪ فبس ثم الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 5 دقائق لتسوية الخلايا وصولا الى القاع.
- نضح السائل بعناية، عد عدد الخلايا باستخدام عدادة الكريات، و ريسوسبيند بيليه الخلية مع خليط مصفوفة الغشاء القاعدي (كونسياللدغة من 50٪ مصفوفة الغشاء القاعدي و بس مع 20٪ فبس، تستكمل مع 100 نانوغرام / مل رمفيغف و 60 U / مل الهيبارين) للوصول إلى تركيز العمل من 15،000 خلية / 15 ميكرولتر.
ملاحظة: يجب دائما تخزين خليط المصفوفة الغشاء القاعدي على الجليد. - تمييع متسلسل الخلايا فرز وفرزها للوصول إلى تركيزات المدخلات المطلوبة في ميكروتوب 1.5 مل، والتأكد من أن أحجام حقن النهائي لا تتجاوز 15 ميكرولتر في المجموع. إضافة 0.1٪ الأزرق تريبان لكل أنبوب لتحسين التصور المحتوى أثناء زرع. ماصة تماما لخلط. تخزين الأنابيب على الجليد حتى الاستخدام.
ملاحظة: يمكن تحقيق توليد الأوعية الناجحة بما لا يقل عن 100 فيسك.
- زرع الابتدائي إكس إلى لوحة الدهون الثديية.
- تطهير الأدوات الجراحية و بينشتوب. إذا كان استخدام نفس الأدوات على الحيوانات متعددة، يمكن استخدام جهاز التعقيم حبة للتطهير.
- تخدير 3 أسابيع من العمر بالب / ج هيئة التصنيع العسكري عاريةه باستخدام بروتوكول مخدر الموصى بها من قبل الطبيب البيطري مؤسستك و إاكوك. وضع كل الماوس في موقف ضعيف، مع ظهرها على طاولة العمليات. شل أطرافه باستخدام شريط لاصق.
- تراجع مسحة القطن إلى محلول مطهر اليود. مسح منطقة البطن بأكملها من الماوس تماما لتعقيم سطح الجلد قبل الجراحة.
- عقد ورفع جلد البطن من الماوس مع ملقط. استخدام مشرط جراحي لجعل صغيرة، 1 سم شق عمودي. جعل اثنين من التخفيضات حوالي 0.5 - 1 سم في الطول، كل نحو الساق الخلفية، لتحقيق رأسا على عقب، على شكل Y شق.
- استخدام ملقط ومسحة القطن لفصل بلطف الجلد من البطن وتثبيت الجلد جانبية لفضح الغدد الثديية الأربية. ضع الماوس تحت مجسام وتعيين التكبير إلى 2.0X. تأكد من ضبط التركيز بحيث لوحة الدهون الثديية يمكن رؤيتها بوضوح وتشغيلها على.
- وضع 27G 1/2 "إبرةe على الجليد قبل البرد. رئيس حقنة 1 مل مع الطابق السفلي غشاء مصفوفة خليط مقدما لإزالة فقاعات الهواء المحتملة المحاصرين في المنطقة إبرة إرفاق. ماصة من 15 ميكرولتر من محلول مختلطة على غطاء أنبوب ميكروسنتريفوج ومن ثم نضح حجم كامل في حقنة تستعد.
- عقد لوحة الدهون الثديية أمام العقدة الليمفاوية الأربية، وذلك باستخدام ملاقط غرامة، ورفعه قليلا لحقن سهلة. إدراج حوالي 1/4 من حقنة إبرة بلطف في لوحة الدهون.
- الافراج عن ملاقط من لوحة بدعة لقبضة واستقرار إبرة حقنة. حقن الحل ببطء لمنع تسرب السائل. عقد لبضع ثوان للتأكد من أن خليط الخلية هو عززت للحد من التسرب عند سحب الإبرة.
- إغلاق رفرف الجلد مع خيوط امتصاص. خياطة رفرف الجلد باستخدام حجم 5-0 غير حيدة خياطة حيدة وإغلاق الجروح مع عقدة على غرار الجراح، كل عقدة تقتربأتيلي 0.3 سم بعيدا. بدلا من ذلك، أغلق الجلد مع المواد الغذائية الجرح.
- وضع الفئران تعمل في قفص منفصل للشفاء. وضع مصباح التدفئة فوق القفص لمنع الفئران تخدير من يعانون من انخفاض حرارة الجسم. وضع ورقة لينة والقطن في الجزء السفلي من القفص للحفاظ على الفئران الحارة بعد الجراحة.
- مراقبة الفئران بعناية حتى جميع المستلمين مستيقظا تماما. للأيام القليلة المقبلة، وتطبيق المسكنات ما بعد الجراحة بشكل وقائي لجميع الحيوانات أو وفقا لتوجيهات الطبيب البيطري منشأة. تطبيق المضادات الحيوية وفقا لبروتوكول الحيوان المعتمدة إذا حدث عدوى الجرح. إذا تم إغلاق الجرح الجراحي مع المواد الغذائية الجرحية، وإزالة مقاطع الجرح بعد 10 أيام من الجراحة، عندما يكون الجرح قد أغلقت تماما.
3. كامل جبل إعداد الأنسجة للمراقبة المجهرية
- حصاد الأنسجة
- في 2-4 أسابيع بعد الزرع، تخدير المتلقي بالب / جالفئران عارية مع حقن داخل البريتوني من 2.5٪ وكيل تخدير بجرعة 0.12 مل لكل 20 غرام من وزن الجسم، كما هو الحال في الخطوة 2.2.2.
ملاحظة: يمكن الكشف عن نمو إيجابي للسفن 2-4 أسابيع بعد زرع الخلايا. - تسمية المتلقي النظامية الدورة الدموية مع حقن الذيل الوريد من إيسولكتين-647 صبغ في جرعة من 50 ميكروغرام / 25 غرام من وزن الجسم، معلق في 50 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني العقيمة. السماح فترة الراحة من 5-10 دقيقة. التضحية الفئران باستخدام كو 2 .
- تشريح منطقة الأنسجة الثديية حيث تم حقن الخلايا في البداية بعد الخطوة 2.2.4. استخدام مقص جراحي. باستخدام شفرة الجراحية، ختم الأنسجة إلى ما يقرب من 3-4 ملم 3 مكعبات في طبق بتري 6 سم.
- في 2-4 أسابيع بعد الزرع، تخدير المتلقي بالب / جالفئران عارية مع حقن داخل البريتوني من 2.5٪ وكيل تخدير بجرعة 0.12 مل لكل 20 غرام من وزن الجسم، كما هو الحال في الخطوة 2.2.2.
- هضم الأنسجة وإعداد تلطيخ الأجسام المضادة.
- هضم قطع الأنسجة في أنبوب الطرد المركزي 15 مل مليئة 10 مل من قبل تحسنت المتوسطة قاعدة الهضم (الخطوة 1.1.2) تستكمل مع كولاجيناز الثالث(300 U لكل 10 مل).
- وضع أنبوب الطرد المركزي 15 مل أفقيا على منصة هزاز مع سرعة تعيين إلى 100 دورة في الدقيقة ودرجة الحرارة تعيين إلى 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة لتخفيف بنية الأنسجة وإزالة الأنسجة الدهنية المفرطة.
ملاحظة: أديبوسيتس تميل إلى إنتاج لصناعة السيارات في مضان التي يمكن أن تؤدي إلى خلفية الفلورسنت صاخبة. وبحلول نهاية الهضم، يجب أن يكون قطعة الأنسجة لينة، مظهر غائم. فترة الهضم الأمثل يعتمد على حجم قطع الأنسجة المفروم، وبالتالي ينبغي تعديلها وفقا لذلك للحصول على أفضل النتائج. منذ الأوعية الدموية الأنسجة وقد وصفت بالفعل مع إسولكتين مضان الموسومة، ينبغي أن تنفذ جميع الإجراءات التالية من الحماية من الضوء. - غسل قطع الأنسجة مع برنامج تلفزيوني في رت لمدة 10 دقيقة. إصلاح النسيج كله جبل عن طريق وضع بعناية القطع في طبق بتري 6 سم نصف كامل مع 4٪ بفا (الرقم الهيدروجيني 7.2 - 7.4) للحفاظ على مضان. ضع طبق بتريعلى منصة هزاز ويهيج بلطف الأنسجة لمدة 30 دقيقة في رت.
ملاحظة: بفا هو مادة مسرطنة ويجب التعامل معها بحذر. - إزالة بفا المتبقية وغسل الأنسجة الثابتة ثلاث مرات مع كامل جبل غسل العازلة (0.1٪ توين في برنامج تلفزيوني)، مع فاصل 10 دقيقة بين كل غسل.
- كله جبل الأنسجة الأجسام المضادة تلطيخ.
- تمييع الأجسام المضادة الأولية في الأجسام المضادة تلطيخ العازلة في أنبوب الطرد المركزي 2 مل. احتضان الأنسجة مع الأجسام المضادة الأولية بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
ملاحظة: تم استخدام الجرذان المضادة لل CD31 (تركيز: 10 ميكروغرام / مل) أو الفئران المضادة للفي كادهيرين (CD144 / Cdh5؛ تركيز: 2.5 ميكروغرام / مل) كأجسام مضادة الأولية. كل من CD31 و في-كادهرين هي علامات سطح الخلية المستخدمة للتعرف على إندوثليوم. يتم إعداد 5X العازلة تلطيخ الأجسام المضادة مع 500 ملي حمض ماليك، ودرجة الحموضة 7.5. 750 ملي كلوريد الصوديوم؛ و 0.5٪ (الخامس / الخامس) توين حل في برنامج تلفزيوني. فقط إضافة في حجم المصل المناسب (5٪) عند إعداد الطازجة حل العمل 1X9 - - إزالة العازلة تلطيخ الأجسام المضادة وغسل النسيج كله جبل ثلاث مرات مع غسل العازلة، مع فاصل زمني 10 دقيقة. احتضان الأنسجة مع الأجسام المضادة الثانوية (انظر جدول المواد ) بالإضافة إلى دابي في رت لمدة 4 ساعات على منصة هزاز أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
ملاحظة: استخدام دابي (4 '، 6-دياميدينو-2-فينيليندول) في تركيز النهائي من 5 ميكروغرام / مل لتصور نوى. - غسل كامل جبل الأنسجة مع غسل العازلة 3 مرات لمدة 10 دقيقة لكل منهما. احتضان قطع الأنسجة في 80٪ الجلسرين أو 80٪ السكروز بين عشية وضحاها لتجفيف الأنسجة للحفاظ على أفضل.
- وضع قطعة الأنسجة الفردية على شريحة زجاجية وإزالة العازلة الجفاف المفرط. تغطية الأنسجة مع تصاعد المتوسطة، وضع ساترة، والضغط بلطف الأنسجة لضبطه.
- أداء متحد البؤر اكتساب الصورة المجهرية. لكامل جبل الغدد الثديية، والحصول على الصور باستخدام 40X مع نا = 1.3 النفط أوبجكتيلقد. الحصول على مسح البلاط من Z- مداخن في قرار قسم بصري من 1024 × 1،024 وفصل طبقة 1.0-1،2 ميكرون.
ملاحظة: لالتقاط إشارة ضوء مضان الصحيح، يجب تعيين الخائن شعاع مرشح إلى الثلاثي مزدوج اللون (تد) 488/553/638، مع الإعداد مكاسب في بمت كسب 600-800. وينبغي استخدام مصادر الإثارة / الانبعاث التالية: مغف، مع الحد الأقصى للإثارة / الانبعاث البالغ 488/509 نانو متر؛ متوماتو مع الإثارة / الانبعاثات ماكسيما من 532/588 نانومتر. اليكسا-647، مع الإثارة / الانبعاثات ماكسيما من 594/665؛ و دابي، مع الإثارة / الانبعاثات ماكسيما من 350/470.
- تمييع الأجسام المضادة الأولية في الأجسام المضادة تلطيخ العازلة في أنبوب الطرد المركزي 2 مل. احتضان الأنسجة مع الأجسام المضادة الأولية بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
4. النسب تتبع باستخدام نموذج الفأر المعدلة وراثيا
- كشف بروكر + فيسكس باستخدام نموذج الماوس.
- استخدام بروكر CreERT2-إيريس-تدتوماتو / + (المشار إليها بروكر CreERT2 ) تدق في سلالة الماوس.
ملاحظة: في هذا النموذج الماوس، و CreERT2-إيريس-تدتوماتو كاسيت 10 بعد أول كودون أتغ من بروكر 11 .- الصليب بروكر CrERT2 الفئران مع متاتوماتغف Rosa26 (المشار إليها باسم R26 ممغ ) سلالة مراسل لتتبع مصير بروكر + إكس الذاتية في الجسم الحي 11 . تحديد كل المسمى بروكر + إكس وذريتهم باستخدام التعبير غفب.
- إدارة حل تاموكسيفين 11 (10 ملغ من تاموكسيفين المذاب في 1 مل من زيت الفول السوداني + 10٪ من الإيثانول لتعويض محلول المخزون من 10 ملغ / مل) داخل الصفاق بجرعة 4 ملغ / 25 غرام من وزن الجسم خلال مرحلة البلوغ (5 أسابيع القديمة) لتتبع مصير التنمية بروكر + إكس.
- تحليل كفاءة تشكيل استنساخ الخلايا المسمى من قبل المناعية جبل كامل بعد خطوات إعداد المبينة في الخطوة 3. الحصول على منصات الدهون الثديية من الفئران المعالجة على حد سواء بعد المدى القصير (2 أيام) وفترات زمنية ممتدة (تصل إلى 10 أشهر). انظر الشكل 3 .
- استخدام بروكر CreERT2-إيريس-تدتوماتو / + (المشار إليها بروكر CreERT2 ) تدق في سلالة الماوس.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
فيسكس الثديية العزلة:
لعزل السكان البطانية لمرحلة ما بعد الفحص زرع، ناضجة (8 أسبوعا)، تم حصاد الغدد الثديية الماوس البكر كمادة المانحة. تم عزل الخلايا البطانية باستخدام تقنية الفرز الخلية القائمة على الأجسام المضادة. وترد المؤامرات التمثيلية من تحليل فاكس للسكان فيسك في C57BL / 6 أسابيع الغدة الثديية إكس 8 أسابيع في الشكل 1
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
مقايسات الأوعية الدموية تمثل نهجا تجريبيا جيدا لدراسة ديناميات الأوعية الدموية. الماوس الأوعية الدموية في شبكية العين، الذي يتطور بعد الولادة، وقد ثبت أن يكون نموذجا جذابا لدراسة الأوعية الدموية 12 . على الرغم من أنه يمكن الوصول إليها نسبيا، والتلاعب الفعلي داخل سرير الأوعية الدموية شبكية العين أمر صعب نوعا ما. حتى الآن، كان أفضل وصفها في زرع الجسم الحي مقايسة المكونات، الذي يرفق الخلايا داخل كتلة مصفوفة الغشاء القاعدي وزرع جراحيا / حقن تح...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ويعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.
شكر وتقدير
وأيد هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (31530045 و 31371500 ل ياز، 31401245 إلى كسي)، وزارة العلوم والتكنولوجيا في الصين (2014CB964800)، والأكاديمية الصينية للعلوم (XDB19000000 إلى ياز)، والصينيين جمعية البيولوجيا الخلوية (الزمالة في وقت مبكر الوظيفي ل كسي).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 0.05٪ حمض رباعي الأسيتيك تريبسين - إيثيلين ديامين (EDTA) (1x) | جيبكو (تقنيات الحياة) | 25300-062 | 0.05٪ تريبسين |
| 0.22 وميكرو ؛ م وحدة التصفية | ميرك ميليبور المحدودة | SLGP033RB | 0.22 وميكرو ؛ م فلتر |
| 2-ميثيل بوتانول -2 ، كاشف بلس | سيجما ألدريتش | 24 ، 048-6 | تيرتي أميل كحول |
| 222 ، ثلاثي الميثانول | سيجما ألدريتش | T48402-25 جم | 222 ، ثلاثي الميثانول |
| 4 '، 6-دياميدينو-2-فينيليندول (DAPI) | إنفيتروجين | D1306 | DAPI |
| 70 & مايكرو ؛ م مصفاة خلية | BD FAL | 352350 | 70 & micro; م مصفاة الخلية |
| التصاق المجهر الشرائح | CITOGLAS | 188105 | الشرائح الزجاجية |
| المضادة للفأر CD105 APC | eBioscience | 17-1051-82 ، استنساخ MJ7 / 18 | لاستخدام تحليل FACS في 1 & micro ؛ جم / مل |
| مضاد للفأر CD201 Biotin | eBioscience | 13-2012-82 | لاستخدام تحليل FACS عند 2.5 & مايكرو ؛ جم / مل |
| مضاد للفأر CD31 PE-Cyanine 7 | eBioscience | 25-0311-82 ، استنساخ 390 | لاستخدام تحليل FACS عند 1 & micro ؛ جم / مل |
| BD FACSazz فارز الخلايا | BD Biosciences | 655489 | FACS |
| مصل الأبقار الألبومين | سيجما | 100190332 | BSA |
| الطرد المركزي | Eppendorf | 5810R | الطرد المركزي |
| الكولاجيناز نوع 3 | ورثينجتون بيوكيم | #LS004183 | الكولاجيناز الثالث |
| المجهر متحد البؤر | Leica | sp8 | متحد البؤر |
| Deoxyribonuclease I من البنكرياس البقري | Sigma | D2463-5VL | Dnase I |
| Donkey anti-Rat Cy3 | Jackson ImmunResearch | 712-165-150 | الجسم المضاد الثانوي ، استخدم في 0.5 & micro ؛ جم / مل |
| ملقط دومون | WPI | 500342 | ملقط |
| دومون - أطراف دقيقة حادة | FST | 11253-20 | ملقط |
| مصل الأبقار الجنين | Hyclone | SH30396.03 | FBS |
| FITC Ms CD3 / Gr1 / CD11b / CD45R (B220) / Ter-119 | BioLegend | 78022 | كوكتيل سلالة الدم لتحليل FACS ، استخدم في 25 & micro ؛ L لكل اختبار |
| Glycerol | Sigma | G6279 | Glycerol |
| Iscov's Modified Dulbecco's Medium | Gibco (Life Technologies) | 12440-053 | IMDM |
| Isolectin GS-IB4 من Griffonia Simplicifolia, Alexa Fluora 647 | Invitrogen | Z32450 | Isolectin-647 |
| Matrigel مصفوفة (انخفاض عامل النمو) | BD | 356231 | |
| سلالة Matrigel Mouse (Actin-GFP) | Jax Laboratories | 3773 | Actin-GFP |
| سلالة الماوس (C57BL / 6) | SLAC | C57BL / 6 | C57BL / 6 |
| سلالة الماوس ؛ (BALB / ج عارية) | SLAC | BALB / c عارية | الفئران |
| عارية Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | PFA |
| Penicilin Streptomycin | Gibco (Life Technologies) | 5140-122 | Pen / Strep |
| Phosphate Buffered Saline (pH7.2) 1x | Gibco (Life Technologies) | c20012500BT | PBS |
| PRIM1640 | Gibco (Life Technologies) | c11875500CP | PRIM1640 |
| ProLong Gold الكاشف المضاد للبهتان | Life Technologies | P36934 | تصاعد الفئران المتوسطة |
| المضادة ل CD144 | BD Biosciences | 550548 | لتحليل التثبيت الكامل ، مضاد للتلف المضاد ل VE-Cadherin / Cdh5 للتقاطع البطاني الضيق ، يستخدم عند 2.5 وميكرو ؛ جم / مل |
| الفئران المضادة CD31-البيوتين | BD Biosciences | 553371 | لتحليل كامل الجبل ، والجسم المضاد المضاد CD31 / PECAM1 لجزيء التصاق السطح البطاني ، يستخدم في 10 & micro ؛ جم / مل |
| عازلة تحلل الخلايا الحمراء | Sigma | R7767-100ML | عازلة تحلل خلايا الدم الحمراء |
| مستقيم / حاد حاد / 10 سم | FST | 14028-10 | مقص ناعم |
| Streptavidin eFluor 450 | eBioscience | 48-4317-82 | لاستخدام تحليل FACS عند 0.5 & micro ؛ جم / مل |
| تاموكسيفين | سيجما | 101551374 | تام |
| تريتون X-100 | سيجما-ألدريتش | T8787-250ML | |
| حرير مضفر مطلي بالشمع TritonX (مقاس 5-0 USP (1 متري) ، 18 بوصة (45 سم) أسود على إبرة C-1) COVIDIEN | S1173 | Suture ؛ | |
| Scaplels معقم يمكن التخلص | منه Swann Morton | # 10 | مشرط |
| Betadine | Yifeng محلول مطهر 20160101 طبي |
المراجع
- Thomas, E. D., Lochte, H. L., Lu, W. C., Ferrebee, J. W. Intravenous infusion of bone marrow in patients receiving radiation and chemotherapy. N Engl J Med. 257 (11), 491-496 (1957).
- Chao, M. P., Seita, J., Weissman, I. L. Establishment of a normal hematopoietic and leukemia stem cell hierarchy. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 73, 439-449 (2008).
- Bompais, H., et al. Human endothelial cells derived from circulating progenitors display specific functional properties compared with mature vessel wall endothelial cells. Blood. 103 (7), 2577-2584 (2004).
- Fang, S., Wei, J., Pentinmikko, N., Leinonen, H., Salven, P. Generation of functional blood vessels from a single c-kit+ adult vascular endothelial stem cell. PLoS Biol. 10 (10), e1001407(2012).
- Naito, H., Kidoya, H., Sakimoto, S., Wakabayashi, T., Takakura, N. Identification and characterization of a resident vascular stem/progenitor cell population in preexisting blood vessels. EMBO J. 31 (4), 842-855 (2012).
- Yoder, M. C., et al. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109 (5), 1801-1809 (2007).
- Snippert, H. J., Clevers, H. Tracking adult stem cells. Embo Rep. 12 (2), 113-122 (2011).
- Yu, Q. C., Song, W., Wang, D., Zeng, Y. A. Identification of blood vascular endothelial stem cells by the expression of protein C receptor. Cell Res. 26 (10), 1079-1098 (2016).
- Rios, A. C., Fu, N. Y., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. In situ identification of bipotent stem cells in the mammary gland. Nature. 506, 322-327 (2014).
- Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449, 1003-1007 (2007).
- Wang, D. S., et al. Identification of multipotent mammary stemcells by protein C receptor expression. Nature. 517, 81-U201 (2015).
- Stahl, A., et al. The Mouse Retina as an Angiogenesis Model. Invest Ophth Vis Sci. 51 (6), 2813-2826 (2010).
- Mammoto, T., Mammoto, A. Implantation of Fibrin Gel on Mouse Lung to Study Lung-specific Angiogenesis. J. Vis. Exp. (94), e52012(2014).
- Snippert, H. J., et al. Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells. Cell. 143 (1), 134-144 (2010).
- Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nat Genet. 21 (1), 70-71 (1999).
- Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
- Solar, M., et al. Pancreatic exocrine duct cells give rise to insulin-producing beta cells during embryogenesis but not after birth. Dev Cell. 17 (6), 849-860 (2009).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
