RESEARCH
Peer reviewed scientific video journal
Video encyclopedia of advanced research methods
Visualizing science through experiment videos
EDUCATION
Video textbooks for undergraduate courses
Visual demonstrations of key scientific experiments
BUSINESS
Video textbooks for business education
OTHERS
Interactive video based quizzes for formative assessments
Products
RESEARCH
JoVE Journal
Peer reviewed scientific video journal
JoVE Encyclopedia of Experiments
Video encyclopedia of advanced research methods
EDUCATION
JoVE Core
Video textbooks for undergraduates
JoVE Science Education
Visual demonstrations of key scientific experiments
JoVE Lab Manual
Videos of experiments for undergraduate lab courses
BUSINESS
JoVE Business
Video textbooks for business education
Solutions
Language
ar
Menu
Menu
Menu
Menu
A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Research Article
Deirdre K Tucker1,2, Julie F Foley3, Schantel A Bouknight4, Suzanne E Fenton2
1Curriculum in Toxicology,University of North Carolina at Chapel Hill, 2National Toxicology Program Laboratory (NTPL), DNTP,National Institute of Environmental Health Sciences, 3Cellular and Molecular Pathology Branch, DNTP,National Institute of Environmental Health Sciences, 4Charles River Laboratories Inc.
Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.
Erratum Notice
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Retraction Notice
The article Assisted Selection of Biomarkers by Linear Discriminant Analysis Effect Size (LEfSe) in Microbiome Data (10.3791/61715) has been retracted by the journal upon the authors' request due to a conflict regarding the data and methodology. View Retraction Notice
قمنا بتطوير طريقة لإزالة بنجاح، عملية، قسم، وصمة عار، للتقييم الأنسجة، الأنسجة الثديية التي كانت أصلا تم إصلاحها على الشرائح كما يتصاعد كله. هذا الأسلوب قد تعزز جمع وتقييم الغدة الثديية يتصاعد كله في الدراسات الإرشادية الإنجابية والتنموية اختبار.
قد يتغير تطور الغدة الثديية العادية عن طريق التعرض للمواد السامة والبيئية، والتعرض المفرط للهرمونات، والتغيرات الجينية. الغدة الثديية يتصاعد كله هي وسيلة غير مكلفة لالتقاط تطور التغيرات المورفولوجية التي قد تنشأ بعد التعرض. ومع ذلك، في الحياة في وقت لاحق، عندما تشوهات أكثر عرضة للتطور، والاعتماد الوحيد على هذه الطريقة واحدة قد لا توفر دائما ما يكفي من المعلومات لإجراء التشخيص المناسب للشذوذ. تاريخيا، في الدراسات التوجيهية اختبار الكيمياء اختبار، يتم إزالة الغدة الثديية واحدة في التشريح وإعدادها على شكل هيماتوكسيلين و يوسين (H & E) -insted القسم. دمج المقابل الثديي بأكمله جبل جمع وتحليل يقلل من احتمال تقييم سلبية كاذبة. تقييم جبل كله يقتصر وجود واحد أو اثنين من الغدد الثديية بأكملها على شريحة، وفي بعض الحالات، فإن تشوهات لوحظ في جبل كله لاt ممثلة بشكل موحد في قسم H & E. وكان الهدف من هذه الدراسة لتطوير بروتوكول لتحويل يتصاعد كامل الثديي كوفيرسليبد إلى أقسام H & E الملون بحيث الآفات التي من شأنها أن تكون قد غاب عن ذلك أو التي يصعب تشخيصها يمكن تحديدها. هنا، ونحن بالتفصيل طريقة لإنتاج عالية الجودة، جزءا لا يتجزأ من البارافين H & E القسم من الغدة الثديية التي تم إعدادها في البداية كما جبل بأكمله. بالمقارنة مع الأنسجة التي أعدت عمدا ل H & E سيكتيونينغ، جبل كله يتطلب إعداد إضافي لإزالة الأنسجة ومعالجتها. ومع ذلك، تعتبر هذه الطريقة غير مكلفة، لأنها تتطلب الكواشف مختبر مشترك وقليل من الوقت الإضافي. ونتيجة لذلك، يمكن أن توفر هذه الطريقة معلومات لا تقدر بثمن حول كيفية التعرض الكيميائية والبيئية تغير تطور الثديية العادية، فضلا عن تغييرات العرض التي تحدث بسبب التعديلات الجينية.
الثديية بأكملها مونتيس طريقة مفيدة وغير مكلفة تنفيذها في العديد من الفئران والفأر الدراسات لفهم كل من الطبيعي والمستحثة كيميائيا، والتنمية غير طبيعية. بشكل عام، فإن الغدة الثديية التي تم جمعها في مراحل مختلفة خلال تطوير القوارض ( أي المراهقة، سن البلوغ، منتصف إلى وقت متأخر من الحمل، ومرحلة الانقلاب) تظهر التغيرات المورفولوجية في الأنسجة والهندسة المعمارية الخلوية تتأثر عوامل الغدد الصماء، والغدد الصماء، 1 - في الفئران الشيخوخة، وأجزاء الظهارية والانسجة من الغدة تصبح على نحو متزايد كثيفة، مما يجعل قياس المعلمات المورفولوجية صعبة في جبل بأكمله. وبالتالي، فمن الممارسة الشائعة لجمع غدة للتقييم النسيجي لتحديد التغيرات على مستوى المجهري. كلا العمليتين مفيدة بشكل خاص في الدراسات التي تنطوي على التعرض الكيميائي ( أي البيئية، أو الصيدلانية) أو لدراسة التغيرات المورفولوجية المصحوبة بتعديل وراثيبالجمع.
التقنيات والقدرات لاستخدام الغدة الثديية في تقييم المخاطر تستمر في التطور. في حين أن إعداد كامل جبل هو روتيني وموحدة، والتعديلات على باجتزاء تستمر 2 ، 3 . العديد من المجموعات البحثية من مختلف الخلفيات ( أي الأوساط الأكاديمية والحكومة والصناعة) تكيفت أقسام الاكليلية / الطولية من الأنسجة الثديية كطريقة مفضلة، في حين أن بعض المختبرات لا تزال تستخدم المقاطع عبر قطع من خلال الجلد 4 . هذا الأسلوب الأخير ينتج في تمثيل غير عادي للبشرة (الجلد)، بدلا من الأنسجة من الفائدة: ظهارة الغدة الثديية 2 . أقسام الاكليلية أو الطولية هي أكثر فائدة لتوصيف الأنسجة الطبيعية 5 وتحسين كبير في الكشف عن تشوهات والآفات بسبب زيادة مساحة السطح وعدد من الهياكل الحالية. عموما، وهذا يجعل مو كلهونت طريقة مناسبة للتقييم النسيجي المرضي للغدة الثديية 1 ، 2 . سواء باستخدام الفأرة أو فأر، واسترجاع، والحفاظ على ال 4 و 5 تشرين الغدد الأربية ينصح بشدة للمقارنة بين جبل بأكمله إلى قسم H & E المقابل.
عندما تستخدم في تركيبة، وقسم H & E وكل جبل يوفر حساب دقيق للتغيرات الخلوية والمورفولوجية الناجمة عن التعرض البيئي. وهذا صحيح بشكل خاص في بعض سلالات القوارض التي يكون النموذج فيها قابلية منخفضة لتشكيل الورم أو ورم ليس مرئيا بشكل واضح. في بعض الظروف، الحصول على الأنسجة المطلوبة قد لا يكون ممكنا دائما باستخدام كل من التقنيات ( أي عدم كفاية كمية الأنسجة، والموارد، أو نتائج تجريبية غير متوقعة). في حالتنا، لوحظت تشوهات في جبل كامل الثديية، في حين هيستوباثوالنتائج المنطقية في المقابل H & E الغدة كانت في الغالب طبيعية. أدى الاختلاف الساحق بين الغدد المقابل لنا لتطوير إجراءات اقتصادية وفعالة لتحديد تشوهات في يتصاعد كله. باستخدام إجراء المعالجة والتضمين المعدلة، تم إعداد أجزاء عالية الجودة H & E الملون من يتصاعد كامل جزءا لا يتجزأ من البارافين. ونحن نتصور هذا البروتوكول تصبح أداة قوية للكشف عن آثار التعرض الكيميائية، وتعزيز المقارنات بين المختبرات.
تمت الموافقة على جميع استخدام الحيوان والإجراءات لهذه الدراسة من قبل نيهس مختبر الحيوان
لجنة الرعاية والاستخدام، وأجريت في جمعية للتقييم والاعتماد
مختبر رعاية الحيوان منشأة معتمدة.
1. الثديية كله جبل إعداد 2 ، 3 ، 6 ، 7
2. إزالة جبل كله الثديية من شريحة زجاجية
3. تجهيز الأنسجة
4. تضمين الأنسجة الثديية المصنعة
5. سيكتيونينغ الأنسجة الثديية جزءا لا يتجزأ من البارافين على مشراح
6. الآلي ودليل H & E تلطيخ من الأنسجة الثديية المقسمة
هذه الطريقة فعالة في المساعدة مع التشخيصات التي قد تكون قد غاب خلاف ذلك إذا كان المقابل الأصلي H & E القسم من لوحة الثديية لا تظهر أي تغييرات نسيجية. ومع ذلك، فإن النتيجة تكون مفيدة فقط إذا تم اتخاذ الرعاية خلال الإعداد كامل جبل الأولي، وكذلك أثناء إعداد الأنسجة للتقييم النسيجي. سوف التضمين البارافين توفير الحماية وسوف تساعد على الحفاظ على الأنسجة ل سيكتيونينغ في المستقبل.
لتحديد سمك مثالي من الأنسجة الثديية، تم إعداد 4 ميكرون و 6 ميكرون أقسام. اختبرنا أعماق التي كانت أكبر من هامش الخطأ من ± 1 ميكرون على مشراح. أقسام سمك 6 ميكرون ( الشكل 1A ) كانت كثيفة جدا مع الخلايا المدمجة. وعموما، تفتقر الشرائح التفاصيل الخلوية متميزة من شأنها أن تكون ضرورية لجعل إيدنتيف السليمication. كان سمك الأمثل 4 ميكرون ( الشكل 1B ). وقدمت هذه الأنسجة أفضل النتائج، حيث تم تمييز المناطق الظهارية و انسجة وأنواع الخلايا المقابلة بسهولة.
استخدمت شرائح من دراسة كبيرة ومستمرة لتوضيح سهولة وفائدة هذه الطريقة. في العديد من الحالات، تم العثور على قسم H & E الأصلي من 14 عاما الإناث العذراء الإناث سد-1 لديها نتائج متضاربة مقارنة مع جبل كامل الثديية المقابل من نفس الحيوان. كانت الآفات واضحة في جبل كامل، ولكن لا يمكن التعرف عليها من دون مزيد من التقسيم وتلطيخ. وتم اختيار عينات من حيوانين مختلفين كقضايا تمثيلية. في كلتا الحالتين، تم استخدام قسم واحد للتلطيخ، ولكن تم إجراء عدة تخفيضات حتى تم الحصول على قسم تمثيلي. كان هناك عدد قليل جدا من التخفيضات اللازمة للحصول على قسم تمثيلي، منذ التحضيرات السابقة كلها جبل مسح موست من لوحة الدهون، وترك الغدة رقيقة جدا بالمقارنة مع الغدة الثديية أعدت أصلا لتضمين البارافين، والتي تحيط بها لوحة الدهون سميكة. الشكل 2 ألف والشكل (3) وتوضيح الأجزاء النسيجية من الغدد التي تم تقييمها بشكل طبيعي. يظهر كل من الغدد الهياكل الأقنية محاطة من قبل السكان المتينين الغنية بالكريات الشحمية متجانسة. ويصف كل قناة من طبقة واحدة من الخلايا الظهارية مكعبية بسيطة ويتم الحفاظ عليها من قبل طبقة ثانية من الخلايا القاعدية، وتتألف أساسا من الخلايا الظهارية، ولكن تشمل أيضا الجذعية والسكان الخلية السلف. ممثل يتصاعد كامل المقابل ( أرقام 2B والشكل 3 ب ) أظهرت قنوات و سدى مع زيادة التعتيم. ومع ذلك، كان من الصعب تحديد ما إذا كان أوباكينيس نتيجة للتغيرات مفرط التنسج، التهابات، أو الورم معحيث يوجد قسم H & E يمكن أن يوفر تفاصيل خلوية متميزة.
تم استخدام يتصاعد كله المقابل من نفس الحيوانات لتنفيذ الطريقة الموصوفة هنا ويمكن ملاحظتها في الشكل 2 C و D والشكل 3 C و D. تم تشخيص العينات في الشكل 2 C & D كما التهاب الأوعية بسبب زيادة عدد الخلايا الليمفاوية التي كانت موجودة حول الأوعية الدموية الكبيرة في قسم الغدة الثديية. في الحالة الثانية، تم الحفاظ على العمارة الغدة الثديية مفصص ولكن تم توسيعها متعددة من خلال زيادة عدد وحجم الحويصلات الهوائية والقنوات (تضخم لوبولوالفيولار). وكانت الخلايا الظهارية السنخية متباينة جيدا، مستديرة، في كثير من الأحيان، فاكولاتد، وشكلت طبقة متحدة المركز واحد حول التجويف التي تحتوي عادة السائل البروتيني. دوككانت تيسي مبطنة بالخلايا العمودي وكانت مشابهة للخلايا السنخية، مع ظهارة متباينة جيدا التي شكلت طبقة متحدة المركز واحد. وغالبا ما لوحظ هذا النمط الظاهري في الغدد الثديية من الفئران منتصف الحوامل والجرذان. لا ينبغي الخلط هذا مع الهياكل لوبولوفولار في الغدد الثديية من الذكور الذكور الفئران 8 . في الغدة الثديية الذكور البالغين، الحويصلات الهوائية بارزة والقنوات نادرة، ولكن الحويصلات الهوائية والقنوات تصطف من ظهارة الطبقية، مع طويل القامة، فاكولاتد مكعبة إلى خلايا ظهارية عمودية قصيرة.

الشكل 1 : سمك الموصى بها للفأر الغدة الثديية جبل كامل ل H & E أقسام . A) 6 ميكرون و B) 4 ميكرون. لم تكن قرارات هياكل الغدة الثديية مثالية للتقييم النسيجي باستخدام السمكا (6 - & #181؛ م) أقسام، وبالتالي ينصح القسم 4 ميكرون. وقد تم تعديل هذا الرقم من تاكر وآخرون. 9 - الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2 : جبل كامل ل H & E قسم التهاب الأوعية. هذه الصورة هي الغدة الثديية الماوس التي تم جمعها في ديستروس. أ) فورمالين ثابتة H & E القسم الغدة الثديية مع أي تعديلات هيستوباثوجيكال. ب) المقابل كله جبل القسم، مع مناطق زيادة التعتيم (منطقة محاصر). C) التكبير 20X من قسم H & E من جبل كامل الثديية (منطقة محاصر). حاصرت مجموعات من الخلايا وحيدات النوى الأوعية الدموية وامتدت إلى الأنسجة الدهنية المحيطة بها. د) ثه 40X التكبير من قسم H & E من جبل كامل الثديية (منطقة محاصر) يظهر بمزيد من التفصيل أن معظم السكان وحيدات النوى يتكون من الخلايا الليمفاوية ويسلط الضوء على شدة التهاب حول الأوعية. وقد تم تعديل هذا الرقم من تاكر وآخرون. 9 - الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3 : جبل كامل ل H & E القسم من تضخم السنخية مفصص . هذه الصورة هي الغدة الثديية الماوس التي تم جمعها في ديستروس. A) الفورمالين ثابتة H & E القسم الغدة الثديية مع أي تعديلات النسيجية. ب) المقابل كله جبل القسم مع زيادة التعتيم في المناطق الأقنية و انسجة (محاصرا). C) التكبير 20X من قسم H & E من جبل كامل الثديية (منطقة محاصر). تم الحفاظ على الهندسة المعمارية المرمى ولكن تم توسيعها بشكل متعدد من خلال زيادة عدد وحجم الحويصلات الهوائية والقنوات (تضخم لوبولوالفيولار). د) يكبر التكبير 40x لقسم H & E من جبل كامل الثديية (منطقة محاطة) أن الفصيصات الموسع تحتوي على عدد متزايد من الحويصلات الهوائية والقنوات التي تصطف من قبل خلايا ظهارية متباينة جيدا، في كثير من الأحيان، فاكولاتد الظهارية، والتي تشكل شمعة التي تحتوي على سائل بروتيني. وقد تم تعديل هذا الرقم من تاكر وآخرون. 9 - الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
ليس لدى المؤلفين أي مصالح متضاربة للإعلان فيما يتعلق بالبحث، أو التأليف، و / أو نشر هذه المقالة.
قمنا بتطوير طريقة لإزالة بنجاح، عملية، قسم، وصمة عار، للتقييم الأنسجة، الأنسجة الثديية التي كانت أصلا تم إصلاحها على الشرائح كما يتصاعد كله. هذا الأسلوب قد تعزز جمع وتقييم الغدة الثديية يتصاعد كله في الدراسات الإرشادية الإنجابية والتنموية اختبار.
ويود المؤلفون أن يعترفوا بام باموفويغو، وتينيت جونز، وناتاشا كلايتون، نيهس، بخبرتهم الفنية ودعمهم لهذا المشروع.
| وسائط تركيب Xylene | Sigma-Aldrich | 214736 | |
| Permount | Thermo Fisher Scientific | SP15-100 | لتغطية الحوامل الكاملة و H& الأقسام E |
| المعالج الآلي | لايكا الحيوية | نموذج # ST5020 | |
| HM 355S الأوتوماتيكي ميكروتوم | ثيرمو فيشر العلمية | 905200 | |
| البارافين | لايكا بيوأنظمة | EM-400 | |
| Superfrost plus شرائح المجهر | Thermo Fisher Scientific | 4951PLUS-001 | مشحونة إلكتروستاتيكيا |
| فيشر أرقى 24x60x1 | ثيرمو فيشر Scientific | 12-548-5P | أغطية |
| Varistain Gemini ES ملطخ منزلق | أوتوماتيكي Thermo Fisher Scientific | A78000014 | |
| Sta-On | Leica Biosystems | 3803107 | مادة لاصقة سائلة ؛ تستخدم في الحمام المائي عند التقطيع |
| Harris Hematoxylin المعدل 72711 | Richard-Allan Scientific (جزء من Thermo Scientific) | 72711 | |
| Eosin | Leica Biosystems | 3801600 | |
| كربونات الليثيوم | مختبرات SkyTech | LCQ500 | |
| حمض الخليك الجليدي | الحراري فيشر ساينتفيك | A38-500 | المطلوب في |
| كلوروفورم | ماكرون المثبت من كارنويماكرون للكيماويات الدقيقة | 4440-04 | المطلوبة في الإيثانول المثبت 100٪ من كارنوي |
| 6505001050000 شركة وارنر جراهام | مطلوبة في شرائح التثبيت والغسيل من كارنوي | ||
| 95٪ إيثانول | شركة وارنر جراهام | 6505011137320190 | |
| الشب كارمين | Sigma-Aldrich | C1022-25G | |
| كبريتات البوتاسيوم الألومنيوم دوديكاهيدرات ، سيجما الترا | سيجما-ألدريتش | A7210-500G | |
| عازلة غسيل أتمتة ، 20X | Biocare Medical | TWB945 |