موسع لأخذ العينات من السوائل البطانة المخاطية للتحديد الكمي للمناعة-الوسيط في فيفو مجرى الهواء العلوي في مستويات

يجعل السائل البطانة المخاطية للأنف حتى الجزء السائل من النظام مجرى الهواء العلوي. وهو يتألف من مصفوفة معقدة من الوسطاء المستمدة من التفاعل بين ظهارة والخلايا المناعية التي تشكل الخط الأول للدفاع ضد غزو الكائنات الحية الدقيقة. الغشاء المخاطي للأنف يتم الوصول إليها بسهولة، وهناك علاقة وظيفية ومناعية قوية بين الآنف و القصبات الهوائية¹. هذه المقصورة باهتمام خاص فيما يتعلق بمجرى الهواء من الأمراض الشائعة في الطفولة، مثل الربو وحساسية الآنف، ولكن أيضا إلى مجموعة من اضطرابات الجهاز التنفسي الأخرى أكثر انتشارا في وقت لاحق في الحياة.

وهنا يصف لنا تنفيذ أسلوب بعينه دون عائق المخاطية بطانة السائل من تجويف الآنف باستخدام تقنية التصفية الورقية، noninvasive، فضلا عن إجراءات استخراج لاحقة، تستخدم الوتي تحليلها على أساس البروتين من أوراق التصفية قبل كمياً. يمكن، على سبيل المثال، استخدام هذا الأسلوب للحصول على توقيعات محصنة ضد كل من الأشخاص الأصحاء والأفراد بمختلف أمراض الجهاز التنفسي في فيفو . وعلاوة على ذلك، فمن الممكن لدراسة حالات التعرض لأهمية لتوقيع المناعي محدد وتقييم إذا كان التوقع أو الوسيط لتطور المرض لاحق.

سائل البطانة المخاطية حصلت سابقا بالغسل الآنف²، الذي هو غالباً ما يسبقه اختبار تحدي الآنف، حيث أدخلت حساسية في المستويات العالية الحث استجابة التهابية^3،4. ومع ذلك، تقنية الغسل الآنف ليس ممكناً في الأطفال الصغار ويدخل عامل إضعاف غير معروف، مما يفند النتائج، كوسيط المخفف يمكن أن تنخفض مستويات أقل من حد الكشف والرزن⁵. وعلاوة على ذلك، نظراً لعامل إضعاف غير معروف، ردود مدروسة أكثر من اختبارات التحدي الآنف ليست قابلة للمقارنة بين الأفراد، مما يحد من جدوى تقنية الغسل الآنف في مجموعة الإعداد. وأخيراً، التحدي حساسية لا ينطبق إلا في مواضيع توعية، والتحديات الأخرى، مثل الهستامين والتحدي، ليست فسيولوجيا ذات الصلة، يحتمل أن تسبب أثرا سقف على الإفراج عن الوسيط. يتم الالتفاف على هذه المشاكل في تقنية التصفية الورقية المقدمة لجمع السائل البطانة المخاطية، حيث يتم إفراز الفردية من السوائل ومستويات أكثر العوامل الوحيدة التي تؤثر على الفرق بين الفرد.

أثناء عملية الاستخراج، التيد تحليلها هي لجميع عينات من أوراق التصفية بعد إضافة كميات متماثلة من المخزن المؤقت. وهذا تفضل مماثلة السابقين فيفو تمييع جميع العينات. يتم استخدام مخزن مؤقت لاستخراج الحل الملح متساوي التوتر القائم على الزلال لخطوة الاستخراج؛ فهو يمكن استخراج الوسطاء القائم على البروتين وتستقر البروتينات إلى الحد من تمسخ أثناء تجميد اللاحقة من البروتينات الوتيد قبل التحديد الكمي. لتجنب تدهور البروتين خلال مرحلة الاستخراج، يتم إضافة خليط مثبطات البروتياز إلى المخزن المؤقت الاستخراج.

تنفيذ التقنيات التي تسمح للتقدير الكمي من دون عائق، في فيفو-الوسطاء المناعية التي تم إنشاؤها في مواقع المخاطية من الأهمية بمكان. أولاً، تشكل الموقع المخاطية أكبر جهاز المناعة في الجسم. ثانيا، موقع الآنف هو الموقع الرئيسي للتعرض المحمولة جوا وأحكام متصلة إلى حجرة المناعية التنفسية ل الرئتين¹. ثالثا، يفتح إمكانية مسح هذا الجهاز الهام مع تقنية موسع في إمكانية توفير عدد كبير معلومات على محور التفاعل المناعي ميكروب هامة فيما يتعلق بالصحة والمرض في الخطوط الجوية. رابعا، هناك العديد من التطبيقات الممكنة الأخرى لهذه التقنية، مثل دراسة التعديلات المناعية المحلية في تجارب معشاة ذات شواهد، رقابة الأدوية والمغذيات الدقيقة.

في البداية نفذنا التقنية في "الدراسات المستقبلية" كوبنهاغن على الربو في الطفولة فوج₂₀₀₀ (كوبساك₂₀₀₀)، حيث عقدنا العزم الشخصية محصنة من السوائل البطانة المخاطية لدى الأطفال عمرها 7 سنوات مع حساسية الآنف مقابل ضوابط صحية¹³. فيما بعد، نحن طبقت بنجاح هذا الأسلوب إلى الفوج₂₀₁₀ كوبساك الطولي والملامح المناعية مجرى الهواء المقررة في شهر 1, 2 سنة، و 6 سنوات من العمر، وفي حالات من الأعراض التنفسية الحادة. أظهرت نتائج من الولدان 1 أشهر الجمعيات الهامة بين توقيع المناعي والتعرض البيئي المبكر الحياة^7،،من^{89،10،11،12}.

الدراسات التي أجريت وفقا للمبادئ التوجيهية "إعلان هلسنكي". وتم الحصول على الموافقات من "لجنة الأخلاقيات" كوبنهاغن (KF 01-289/96 كوبساك₂₀₀₀ ) وحاء-ب-2008-093 كوبساك₂₀₁₀والوكالة الدانمركية لحماية البيانات، وتم الحصول على الموافقة الخطية من كلا الوالدين لكل موضوع قبل التسجيل.

1-الإعداد التجريبية

1. استخدام أوراق التصفية (ألياف البوليستر الهيدروكسيلية أوراق، انظر الجدول للمواد)^6،7.
   1. قطع شرائح 3 × 15 ملم في الحجم لطفلة تبلغ من العمر 1 شهر وفي شكل L للأطفال الأكبر سنا والبالغين (5 × 20 × 10 مم (الذراع القصير للأم)).
2. إدراج قطعة واحدة من ورق الترشيح في كل منخر الرضيع باستخدام الملقط. ضع ورق الترشيح في الجزء الأمامي من أدنى توربيناتي (حوالي 1 سم داخل الآنف الولدان و 1.5 سم لجميع الإعمار الأخرى).
   1. ضع الولدان على سرير وإعطائهم الماء والسكر للراحة.
      ملاحظة: للأطفال من جميع الإعمار الأخرى، أخذ العينات يتم بسهولة مع هذا الموضوع جالساً على كرسي.
   2. للأطفال الأكبر سنا، إدراج الذراع الطويلة للورقة على شكل L عامل التصفية في كل منخر.
3. تطبيق قصاصة آنف حول الخياشيم لتقليل عدم الراحة وتجنب فقدانها ورقة تصفية.
4. إزالة أوراق التصفية بعد 2 دقيقة من الاستيعاب.
5. وضع ورقات عامل التصفية في الأنابيب المسماة وتجميدها فورا في-80 درجة مئوية.
6. دون ملاحظة عن أي من أعراض التهاب مجرى الهواء يبديه الطفل اليوم لأخذ العينات.
7. تسجيل أي العطس، البكاء المستمر، أو رعاف يحدث خلال 2 دقيقة لأخذ العينات.

2-التحديد الكمي للمناعة-وسطاء الشحن الجوي

1. أخذ عينات عشوائية تصل إلى 10 من الثلاجة. تسجيل أرقام تحديد الهوية. تبقى العينات على الجليد خلال كامل عملية العامل.
2. بعد ذوبان الجليد على الجليد، تزج أوراق التصفية (لكل موضوع) من كلا الخياشيم في 300 ميليلتر من الطازجة المخزن المؤقت (انظر الجدول للمواد) التي تحتوي على مبطلات كاملة المانع قرص واحد (انظر الجدول للمواد) كل 25 مل من المخزن المؤقت.
   1. ضبط حجم المخزن المؤقت وفقا لحجم الورق عامل التصفية.
      1. استخدام 300 ميليلتر من المخزن المؤقت لتصفية ورقات 3 × 15 ملم في الحجم.
      2. إذا كان فقط واحد تصفية الورق المتوفرة، استخدم نصف حجم المخزن المؤقت (150 ميليلتر).
3. نقل العينات لوحة شاكر (400 لفة في الدقيقة) لأدنى 5 استخدام جهاز ضبط وقت.
4. نقل رطبة تصفية الأوراق والمقايسة المخزن المؤقت في كأس وعامل تصفية أنبوب خلات السليولوز (حجم المسام ميكرومتر 0.22) توضع داخل ميكروسينتريفوجي الأنبوبة (انظر الجدول للمواد).
5. الطرد المركزي في 16,000 س ز لمدة 5 دقائق في أجهزة الطرد مركزي تبريد (عند 4 درجة مئوية) للحصول على استخراج الآنف التي تمت تصفيتها في الأنبوب.
6. إزالة الكأس وإبقاء الأنابيب على الجليد بينما اليقوتينج استخراج الآنف في آبار ألواح التخزين ملزمة البروتين المنخفض (انظر الجدول للمواد).
7. تخزين في-80 درجة مئوية حتى التحليل.
8. تحديد تركيزات السيتوكينات والمستقطبات في المقتطفات الآنف باستخدام نظام صفيف متعدد عالية الحساسية، على أساس اليكتروتشيميلومينيسسي (انظر الجدول للمواد).
   ملاحظة: التحليل سيتوكين 2 1/تي_حتي_حالبشرية 10-من نوع plex، 9-من نوع plex chemokine المقايسة، وواحد-من نوع plex إيل-17A، TGF-β1، وتسلب أجريت هنا.
   1. لفحوصات، احتضان مقتطفات الآنف بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. إجراء القياسات كما الواحد الصانع القياسية البروتوكول (انظر الجدول للمواد).
      ملاحظة: تحديدكم (انظر الجدول للمواد) وعادة ما يكون مجموعة ديناميكية عالية لقياس تتراوح ما بين 1 & 10,000 بيكوغرام/مل، ولكن يمكن لبعض فحوصات، 100,000 بيكوغرام/مل. وهذا يعني أن جميع العينات التي يمكن تشغيلها في إضعاف نفسه، مما يحد من تأثير تخفيف متباينة في مواضيع صحية والمريضة، كما الحال في سائر تحديدكم مماثلة. وكان الحد الأدنى للكشف عن جميع السيتوكينات 1 بيكوغرام/مل أو أقل، والمستقطبات، تراوحت بين 1 & 50 بيكوغرام/مل. تسلب لم يكن يمكن اكتشافها في 98 في المائة عينات خلال شهر واحد من العمر.

3-الإحصاءات

1. سجل تحويل البيانات قبل تحليلها للحصول على البواقي توزع عادة على المستويين سيتوكين وتشيموكيني.
2. إذا كان يتم تحليل العينات في دفعة واحدة أو أكثر، تصحيح بيانات سيتوكين وتشيموكيني باتشويسي تتمحور حول تحويل سجل البيانات.
   1. إدراج يعني عموما وتحويل سجل المضادة للحصول على البيانات في وحدات القياس الأصلي.
      ملاحظة: لكل مجموعة من التحليلات التي فعلت، النظر في تعديل المتغيرات التي تؤثر في مستوى السيتوكينات والمستقطبات. وهذا يمكن أن تكون الأمهات التأثيرات (مثل تعاطي الكحول والتدخين أثناء الحمل)، والرضاعة الطبيعية، والآثار الضائرة أثناء أخذ العينات، الأخوة والأخوات، والحيوانات الأليفة في المنزل، إلخ

الخصائص الأساسية للملامح المناعية لمجرى الهواء:
تم الحصول على بيانات كاملة عن مستويات الوسيط المناعي في الغشاء المخاطي العلوي في مجرى الهواء في عمر شهر واحد في 620 (89٪) من 700 طفل مسجلين في مجموعة COPSAC2010. تم تسجيل عشرة حديثي الولادة قبل إنشاء هذه التقنية ، ولم يحضر 19 الزيارة التي استمرت شهرا. بالإضافة إلى ذلك ، تم استبعاد 47 عينة لأنه تم استخراجها وقياسها في مختبر آخر استخدم في دراسة تجريبية ، وفقدت 4 عينات أثناء النقل (انظر مخطط انسيابي الدراسة ، <الفئة القوية = "xfig" >الشكل 1). يتم عرض خصائص خط الأساس للمجموعة في الجدول 1.

< p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >كان لدى معظم الوسطاء مستوى منخفض من الكشف <10 بيكوغرام / مل (IL-1β ، IL-2 ، IL-4 ، IL-5 ، IL-10 ، IL-12p70 ، IL-13 ، IL-17A ، TGF-β1 ، IFN-γ ، TNF-α ، CXCL8 ، CCL13 ، CCL4 ، و CCL17) ، في حين أن 5 كان لديه مستوى كشف >10 بيكوغرام / مل (CXCL10 و CCL2 و CCL11 و CCL26 و CCL22) (الجدول 2). كان متوسط عدد العينات (IQR) أقل من حد الكشف (أي من 0 إلى الحد الأدنى للكشف) لكل وسيط 29 (7.25 - 119.5) (الجدول 2). كانت مستويات IFN-γ أقل من حد الكشف الأدنى في ما يقرب من نصف العينات (46٪) ، في حين كانت مستويات CXCL8 و IL-1β قابلة للاكتشاف في جميع العينات ، وكانت مستويات TGF-β1 و CCL4 و TNF-α أقل من حد الكشف الأدنى في <1٪ من العينات. تم اكتشاف أحد الوسطاء ، TSLP ، في 2٪ فقط من العينات ، وبالتالي لم يتم استخدام بيانات TSLP لتحليلات البيانات المتتالية. كان من الواضح تعدد الخط القوي لمستويات الوسيط المناعي ال 20 المكتشفة ، والتي يتم تصورها في خريطة حرارية (<فئة قوية = "xfig">الشكل 2). < p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" > تأثير بكتيريا مجرى الهواء وفيروسات الأطفال حديثي الولادة:
وجدنا سابقا ارتباطا بين المظهر المناعي لمجرى الهواء والاستعمار في بكتيريا مجرى الهواء المحددة التي تم أخذ عينات منها بالتزامن مع سائل البطانة المخاطية في عمر شهر واحد. لوحظ وجود ملف مناعي مجرى الهواء القائم على النوع 1 والنوع 17 في حديثي الولادة المستعمرين بالبكتيريا داخل الخلايا ، في حين ارتبط وجود بكتيريا خارج الخلية بملف تعريف قائم على النوع 17 < sup class = "xref" >7. لقد أظهرنا سابقا أيضا أن وجود فيروس البيكورنا كان مرتبطا بملف تعريف منظم يتكون بشكل أساسي من وسطاء مناعة من النوع 1 (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 3) < فئة الدعم = "xref" >11. تم الحصول على هذه النتائج في الأطفال الذين لا يعانون من أعراض تنفسية (أي بدون أعراض) في يوم أخذ العينات ، مما يشير إلى دور استعمار البكتيريا والفيروسات في الجزء الأول من الحياة.

تأثير التعرض قبل الولادة والفترة المحيطة بالولادة:
لقد لاحظنا أيضا وجود ارتباط بين مستوى الوسطاء المناعيين في عمر شهر واحد وتاريخ الأم من التأتب < sup class = "xref" >8 ، حيث أظهر الأطفال المولودون لأمهات أتأتبيات مستوى أقل من الوسطاء المناعيين بشكل عام من أطفال الأمهات غير التأتبيين. حددنا لاحقا ارتباطا بين وجود الأشقاء في المنزل عند الولادة واستجابة مناعية مخاطية محددة موجهة من النوع 1 / النوع 17 ، مع وجود دليل على ارتباط ذلك بتأثير التحضير المناعي في الرحم ، حيث كانت الاستجابة المناعية مرتبطة عكسيا بالوقت منذ آخر ولادة (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 4) < فئة الدعم = "xref" >12. تم تحديد مزيد من البينات لتأثيرات التحضير المناعي في الرحم من الارتباط بين حالة التطعيم الأنفلونزا H1N1 للأمهات وزيادة تنظيم مستويات TGF-β1 في مجرى الهواء الوليدي10.

< p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" > دليل على آليات عمل المغذيات الدقيقة:
في COPSAC2010 ، أجرينا تجربة تدخل جرعة عالية مقابل جرعة معيارية من فيتامين D أثناء الحمل ، والتي أظهرت انخفاضا بمقدار الربع تقريبا في خطر الإصابة بالربو / الصفير المتكرر في النسل عند سن 3 سنوات < فئة sup = "xref" >9. باستخدام الملف المناعي لمجرى الهواء الوليدي المقاس ، لاحظنا أن الأطفال المولودين لأمهات يتلقين جرعة عالية من فيتامين د ، مقارنة بالجرعة القياسية ، تميزوا بتنظيم وسطاء محددين (IL-12p70 و IL-13 و CCL17 و TGF-β1 و IL-2) ، مما يشير إلى أن فيتامين د يعزز نظام دفاعي مضاد للبكتيريا يختلف عن ذلك الذي تسببه البكتيريا والفيروسات والأشقاء وطبقة الأم < sup class = "xref" >9 (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 5).

<فئة قوية = "xfig" >الشكل 1: مخطط انسيابي لمجموعة الدراسات. تم الحصول على بيانات كاملة عن مستويات الوسيط المناعي في الغشاء المخاطي العلوي في مجرى الهواء في عمر شهر واحد في 620 (89٪) من 700 طفل مسجلين في مجموعة COPSAC2010. تم تسجيل عشرة حديثي الولادة قبل إنشاء هذه التقنية ، ولم يحضر 19 الزيارة التي استمرت شهرا. بالإضافة إلى ذلك، تم استبعاد 47 عينة لأنها استخراجت وقياست في مختبر آخر استخدم في دراسة تجريبية، وفقدت 4 عينات أثناء النقل. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

<فئة قوية = "xfig">الشكل 2: خريطة الحرارة للارتباطات الزوجية بين 20 سيتوكينات وكيميائية. يمثل اللون الأحمر ارتباطا موجبا ويمثل اللون الأزرق ارتباطا سلبيا. يشير الرقم الموجود داخل كل مربع إلى الارتباط بين وسيطين. يوضح الشكل أن جميع الوسطاء مرتبطون ارتباطا إيجابيا. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

< p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
<فئة قوية = "xfig">الشكل 3: يرتبط وجود فيروس البيكورنا بملف تعريف منظم يتكون أساسا من وسطاء مناعي من النوع 1. توضح هذه الأرقام نسب المتوسط الهندسي (GMR) ، مع فترات ثقة 95٪ (CI) ، لوسطاء مجرى الهواء عند حديثي الولادة مع / بدون الوجود المصاحب لفيروس البيكورنا ، تم قياسه في عمر شهر واحد. تم تعديل هذا الرقم من Wolsk et al.11، بإذن. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

<فئة قوية = "xfig" >الشكل 4: آثار وجود الأشقاء في المنزل عند الولادة. أ) التوقيع المناعي لمجرى الهواء (PC1) في حديثي الولادة مع الأشقاء وبدمهم عند الولادة. ب) مخطط مبعثر يظهر ارتباطا عكسيا بين التوقيع المناعي لمجرى الهواء (PC1) والوقت منذ الولادة السابقة للأطفال الذين لديهم أشقاء. تم تعديل هذا الرقم من Wolsk et al.< sup class = "xref" >12 ، بإذن. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

<فئة قوية = "xfig">الشكل 5: تحليل المكون الرئيسي ثنائي المخطط لتأثير تدخل فيتامين د في COPSAC2010 على مستوى الوسيط المناعي لمجرى الهواء في عمر شهر واحد. تمثل كل نقطة عينة ملونة وفقا لتخصيص التدخل للطفل. يتم عرض الأحمال (أي التأثير) للمتغيرات الأصلية على المكونات الرئيسية كأسهم. نتج عن التدخل ملف مناعي منظم بشكل كبير في PC1 ، والذي يرتبط ارتباطا إيجابيا بجميع وسطاء المناعة. تم تعديل هذا الرقم من Chawes et al. < sup class = "xref" >9 ، بإذن. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

<جدول fo:keep-together.within-page="1"> N = 620 (٪) تأتب الأم 334 (54) غير قوقازي 29 (5) الولادة القيصرية 134 (22) المضادات الحيوية في الثلث الثالث من الحمل 126 (20) الأشقاء في المنزل عند الولادة 358 (58) الأليفة (القط و / أو) في المنزل 216 (35) الرضاعة الطبيعية الكاملة في عمر 1 شهر 570 (92) ممنوع التدخين في الثلث الثالث من الحمل 597 (96) ممنوع استهلاك الكحول في الثلث الثالث من الحمل 591 (95) دخل الأسرة >100.000 يورو / سنة 89 (14) العمر الحملي >37 أسبوعا 601 (97) نقاط أبغار >7 في 5 دقيقة 591 (95)

الجدول 1: الخصائص الأساسية لمجموعة COPSAC2010.

<جدول fo:keep-together.within-page="1"> وسيط حد الكشف pg / مل < حد الكشف N (٪) متوسط pg / مل معدل الذكاء pg / مل IL-12p70 1.4 102 (16٪) 10.80 4.99 - 22.22 CXCL10 31 8 (1٪) 1787.78 دولار 722.8 - 5423 IFN-γ 4.1 285 (46٪) 20.14 [إك] 7.63 - 48.51 TNF-α 0.6 5 (<1٪) 28.33 [إك] 10.06 - 88.55 CCL4 4.3 4 (<1٪) 194.90 71.22 - 655.8 CCL2 16.0 9 (1٪) 256.11 دولار 134.4 - 468.5 CCL13 2.8 13 (2٪) 15.17 [إك] 10.35 - 22.80 IL-4 1.1 196 (32٪) 1.37 [إ] 0.42 - 2.86 IL-5 1.2 172 (28٪) 3.72 دولار أمريكي 1.42 - 8.10 IL-13 2.7 [إ] 48 (8٪) 14.49 6.84 - 27.51 CCL11 22.0 39 (6٪) 139.54 دولار 85.00 – 236.0 CCL26 45.0 252 (41٪) 164.93 دولار 56.33 - 350.02 CCL17 7.2 90 (15٪) 41.30 26.83 - 60.68 سي سي إل 22 25.0 78 (13٪) 398.31 دولار 243.4 - 575.7 IL-1β 0.4 0 (0٪) 225.49 دولار 50.07 - 1169 IL-17A 1.5 285 (46٪) 1,480 0.43 - 4.79 CXCL8 3 0 (0٪) 19465 6321 - 38274 TGF-β1 5.2 1 (<1٪) 28.66 دولار 20.76 - 39.50 IL-10 1 13 (2٪) 22.32 9.28 - 49.16 IL-2 1.5 19 (3٪) 18.72 دولار 8.29 - 37.33 < p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" > الجدول 2: عينات سائل البطانة المخاطية من حديثي الولادة البالغين من العمر شهرا واحدا من COPSAC2010 المجموعة. كان لدى معظم الوسطاء مستوى منخفض من الكشف <10 بيكوغرام / مل (IL-1β ، IL-2 ، IL-4 ، IL-5 ، IL-10 ، IL-12p70 ، IL-13 ، IL-17A ، TGF-β1 ، IFN-γ ، TNF-α ، CXCL8 ، CCL13 ، CCL4 ، و CCL17) ، في حين أن 5 كان لديهم مستوى كشف >10 بيكوغرام / مل (CXCL10 ، CCL2 ، CCL11 ، CCL26 ، و CCL22).

أن تعلن جميع المؤلفين أي تعارض المتصورة أو محتملاً أو حقيقيا في المصالح فيما يتعلق بمحتوى هذه المخطوطة. وكالات التمويل لم يكن أي دور في تصميم وإجراء الدراسة؛ جمع، وإدارة، وتفسير البيانات؛ أو إعداد ومراجعة والموافقة على المخطوطة. لا توجد شركة صيدلانية متورط في الدراسة.