مقالة منهجية

موسع لأخذ العينات من السوائل البطانة المخاطية للتحديد الكمي للمناعة-الوسيط في فيفو مجرى الهواء العلوي في مستويات

DOI:

10.3791/55800

⸱

أغسطس 7, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Copenhagen Prospective Studies on Asthma in Childhood (COPSAC), Herlev and Gentofte Hospital, University of Copenhagen, 2Department of Biotechnology and Biomedicine, Technical University of Denmark

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويصف هذا البروتوكول تقنية موسع لأخذ عينات السوائل البطانة المخاطية دون عائق من الخطوط الجوية العليا. ويمكن استخدامه لإجراء التقدير الكمي في فيفو مستويات البروتين الوسطاء، مثل السيتوكينات والمستقطبات، في موضوعات في جميع الإعمار.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويصف هذا البروتوكول موسع لأخذ العينات من مجرى الهواء العلوي دون عائق البطانة المخاطية السائل. أنها أيضا تفاصيل إجراءات استخراج المستخدمة قبل تحليل الوسطاء محصنة في السوائل الواتس لدراسة التوقيع المناعية الموضعية مجرى الهواء، دون الحاجة لإجراءات التحفيز (غالباً ما تستخدم بتقنيات أخرى). يتم أخذ عينات السوائل البطانة المخاطية على شريط من ورق الترشيح وضعت في الجزء الأمامي من أدنى توربيناتي وتترك لمدة 2 دقيقة للاستيعاب. تحليلها هي التيد من أوراق التصفية، ويتم تحليل الواتس على أساس البروتين المستخرج من المناعة المستندة إلى اليكتروتشيميلومينيسسينسي، مما يسمح لحساسية عالية التحديد الكمي لتحليلها منخفضة ورفيع المستوى في نفس العينة. قمنا بقياس المستويات في فيفو 20 الوسطاء المناعية المختارة المتعلقة بالمناعة محددة مما يشير إلى مسارات في الغشاء المخاطي مجرى الهواء العلوي، ولكن هذا الأسلوب لا يقتصر على ذلك لوحة محددة أو موقع أخذ العينات. الأسلوب الذي نفذ أولاً في الأطفال عمرها 7 سنوات من "الدراسات المستقبلية" كوبنهاغن على الربو في الطفولةعام 2000 (كوبساك2000) الفوج مع حساسية الآنف. وبعد ذلك استخدامه في كوبساك طولية2010 الولادي، عينات في الشهر 1، 2 سنة، و 6 سنوات من العمر، وفي حالات من الأعراض التنفسية الحادة. نحن التي تم الحصول عليها بنجاح، وتحليل عينات من 620 (89 في المائة) من 700 1 شهرا الأطفال؛ وكانت عينات قليلة أقل من حد الكشف والرزن (ذكرت كالوسيط (ربعي بين مجموعة (IQR)). وكان العدد العينات الكشف عن الحد الأدنى (أي من 0 إلى النقطة المحددة للحد الأدنى للكشف) لكل وسيط 29 (7.25-119.5). هذا الأسلوب يتيح التحديد الكمي للشخصية فيفو في المناعة المخاطية مجرى الهواء من الولادة ويمكن تطبيقها طوليا، ويمكن تطبيقها على دراسات بشأن تأثير الوراثة والتعرض البيئي المبكر الحياة والفيزيولوجيا المرضية، اندوتيبينج، ورصد أمراض الجهاز التنفسي، وتطوير وتقييم للمداواة الرواية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يجعل السائل البطانة المخاطية للأنف حتى الجزء السائل من النظام مجرى الهواء العلوي. وهو يتألف من مصفوفة معقدة من الوسطاء المستمدة من التفاعل بين ظهارة والخلايا المناعية التي تشكل الخط الأول للدفاع ضد غزو الكائنات الحية الدقيقة. الغشاء المخاطي للأنف يتم الوصول إليها بسهولة، وهناك علاقة وظيفية ومناعية قوية بين الآنف و القصبات الهوائية1. هذه المقصورة باهتمام خاص فيما يتعلق بمجرى الهواء من الأمراض الشائعة في الطفولة، مثل الربو وحساسية الآنف، ولكن أيضا إلى مجموعة من اضطرابات الجهاز التنفسي الأخرى أكثر انتشارا في وقت لاحق في الحياة.

وهنا يصف لنا تنفيذ أسلوب بعينه دون عائق المخاطية بطانة السائل من تجويف الآنف باستخدام تقنية التصفية الورقية، noninvasive، فضلا عن إجراءات استخراج لاحقة، تستخدم الوتي تحليلها على أساس البروتين من أوراق التصفية قبل كمياً. يمكن، على سبيل المثال، استخدام هذا الأسلوب للحصول على توقيعات محصنة ضد كل من الأشخاص الأصحاء والأفراد بمختلف أمراض الجهاز التنفسي في فيفو . وعلاوة على ذلك، فمن الممكن لدراسة حالات التعرض لأهمية لتوقيع المناعي محدد وتقييم إذا كان التوقع أو الوسيط لتطور المرض لاحق.

سائل البطانة المخاطية حصلت سابقا بالغسل الآنف2، الذي هو غالباً ما يسبقه اختبار تحدي الآنف، حيث أدخلت حساسية في المستويات العالية الحث استجابة التهابية3،4. ومع ذلك، تقنية الغسل الآنف ليس ممكناً في الأطفال الصغار ويدخل عامل إضعاف غير معروف، مما يفند النتائج، كوسيط المخفف يمكن أن تنخفض مستويات أقل من حد الكشف والرزن5. وعلاوة على ذلك، نظراً لعامل إضعاف غير معروف، ردود مدروسة أكثر من اختبارات التحدي الآنف ليست قابلة للمقارنة بين الأفراد، مما يحد من جدوى تقنية الغسل الآنف في مجموعة الإعداد. وأخيراً، التحدي حساسية لا ينطبق إلا في مواضيع توعية، والتحديات الأخرى، مثل الهستامين والتحدي، ليست فسيولوجيا ذات الصلة، يحتمل أن تسبب أثرا سقف على الإفراج عن الوسيط. يتم الالتفاف على هذه المشاكل في تقنية التصفية الورقية المقدمة لجمع السائل البطانة المخاطية، حيث يتم إفراز الفردية من السوائل ومستويات أكثر العوامل الوحيدة التي تؤثر على الفرق بين الفرد.

أثناء عملية الاستخراج، التيد تحليلها هي لجميع عينات من أوراق التصفية بعد إضافة كميات متماثلة من المخزن المؤقت. وهذا تفضل مماثلة السابقين فيفو تمييع جميع العينات. يتم استخدام مخزن مؤقت لاستخراج الحل الملح متساوي التوتر القائم على الزلال لخطوة الاستخراج؛ فهو يمكن استخراج الوسطاء القائم على البروتين وتستقر البروتينات إلى الحد من تمسخ أثناء تجميد اللاحقة من البروتينات الوتيد قبل التحديد الكمي. لتجنب تدهور البروتين خلال مرحلة الاستخراج، يتم إضافة خليط مثبطات البروتياز إلى المخزن المؤقت الاستخراج.

تنفيذ التقنيات التي تسمح للتقدير الكمي من دون عائق، في فيفو-الوسطاء المناعية التي تم إنشاؤها في مواقع المخاطية من الأهمية بمكان. أولاً، تشكل الموقع المخاطية أكبر جهاز المناعة في الجسم. ثانيا، موقع الآنف هو الموقع الرئيسي للتعرض المحمولة جوا وأحكام متصلة إلى حجرة المناعية التنفسية ل الرئتين1. ثالثا، يفتح إمكانية مسح هذا الجهاز الهام مع تقنية موسع في إمكانية توفير عدد كبير معلومات على محور التفاعل المناعي ميكروب هامة فيما يتعلق بالصحة والمرض في الخطوط الجوية. رابعا، هناك العديد من التطبيقات الممكنة الأخرى لهذه التقنية، مثل دراسة التعديلات المناعية المحلية في تجارب معشاة ذات شواهد، رقابة الأدوية والمغذيات الدقيقة.

في البداية نفذنا التقنية في "الدراسات المستقبلية" كوبنهاغن على الربو في الطفولة فوج2000 (كوبساك2000)، حيث عقدنا العزم الشخصية محصنة من السوائل البطانة المخاطية لدى الأطفال عمرها 7 سنوات مع حساسية الآنف مقابل ضوابط صحية13. فيما بعد، نحن طبقت بنجاح هذا الأسلوب إلى الفوج2010 كوبساك الطولي والملامح المناعية مجرى الهواء المقررة في شهر 1, 2 سنة، و 6 سنوات من العمر، وفي حالات من الأعراض التنفسية الحادة. أظهرت نتائج من الولدان 1 أشهر الجمعيات الهامة بين توقيع المناعي والتعرض البيئي المبكر الحياة7،،من89،10،11،12.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الدراسات التي أجريت وفقا للمبادئ التوجيهية "إعلان هلسنكي". وتم الحصول على الموافقات من "لجنة الأخلاقيات" كوبنهاغن (KF 01-289/96 كوبساك2000 ) وحاء-ب-2008-093 كوبساك2010والوكالة الدانمركية لحماية البيانات، وتم الحصول على الموافقة الخطية من كلا الوالدين لكل موضوع قبل التسجيل.

1-الإعداد التجريبية

  1. استخدام أوراق التصفية (ألياف البوليستر الهيدروكسيلية أوراق، انظر الجدول للمواد)6،7.
    1. قطع شرائح 3 × 15 ملم في الحجم لطفلة تبلغ من العمر 1 شهر وفي شكل L للأطفال الأكبر سنا والبالغين (5 × 20 × 10 مم (الذراع القصير للأم)).
  2. إدراج قطعة واحدة من ورق الترشيح في كل منخر الرضيع باستخدام الملقط. ضع ورق الترشيح في الجزء الأمامي من أدنى توربيناتي (حوالي 1 سم داخل الآنف الولدان و 1.5 سم لجميع الإعمار الأخرى).
    1. ضع الولدان على سرير وإعطائهم الماء والسكر للراحة.
      ملاحظة: للأطفال من جميع الإعمار الأخرى، أخذ العينات يتم بسهولة مع هذا الموضوع جالساً على كرسي.
    2. للأطفال الأكبر سنا، إدراج الذراع الطويلة للورقة على شكل L عامل التصفية في كل منخر.
  3. تطبيق قصاصة آنف حول الخياشيم لتقليل عدم الراحة وتجنب فقدانها ورقة تصفية.
  4. إزالة أوراق التصفية بعد 2 دقيقة من الاستيعاب.
  5. وضع ورقات عامل التصفية في الأنابيب المسماة وتجميدها فورا في-80 درجة مئوية.
  6. دون ملاحظة عن أي من أعراض التهاب مجرى الهواء يبديه الطفل اليوم لأخذ العينات.
  7. تسجيل أي العطس، البكاء المستمر، أو رعاف يحدث خلال 2 دقيقة لأخذ العينات.

2-التحديد الكمي للمناعة-وسطاء الشحن الجوي

  1. أخذ عينات عشوائية تصل إلى 10 من الثلاجة. تسجيل أرقام تحديد الهوية. تبقى العينات على الجليد خلال كامل عملية العامل.
  2. بعد ذوبان الجليد على الجليد، تزج أوراق التصفية (لكل موضوع) من كلا الخياشيم في 300 ميليلتر من الطازجة المخزن المؤقت (انظر الجدول للمواد) التي تحتوي على مبطلات كاملة المانع قرص واحد (انظر الجدول للمواد) كل 25 مل من المخزن المؤقت.
    1. ضبط حجم المخزن المؤقت وفقا لحجم الورق عامل التصفية.
      1. استخدام 300 ميليلتر من المخزن المؤقت لتصفية ورقات 3 × 15 ملم في الحجم.
      2. إذا كان فقط واحد تصفية الورق المتوفرة، استخدم نصف حجم المخزن المؤقت (150 ميليلتر).
  3. نقل العينات لوحة شاكر (400 لفة في الدقيقة) لأدنى 5 استخدام جهاز ضبط وقت.
  4. نقل رطبة تصفية الأوراق والمقايسة المخزن المؤقت في كأس وعامل تصفية أنبوب خلات السليولوز (حجم المسام ميكرومتر 0.22) توضع داخل ميكروسينتريفوجي الأنبوبة (انظر الجدول للمواد).
  5. الطرد المركزي في 16,000 س ز لمدة 5 دقائق في أجهزة الطرد مركزي تبريد (عند 4 درجة مئوية) للحصول على استخراج الآنف التي تمت تصفيتها في الأنبوب.
  6. إزالة الكأس وإبقاء الأنابيب على الجليد بينما اليقوتينج استخراج الآنف في آبار ألواح التخزين ملزمة البروتين المنخفض (انظر الجدول للمواد).
  7. تخزين في-80 درجة مئوية حتى التحليل.
  8. تحديد تركيزات السيتوكينات والمستقطبات في المقتطفات الآنف باستخدام نظام صفيف متعدد عالية الحساسية، على أساس اليكتروتشيميلومينيسسي (انظر الجدول للمواد).
    ملاحظة: التحليل سيتوكين 2 1/تيحتيحالبشرية 10-من نوع plex، 9-من نوع plex chemokine المقايسة، وواحد-من نوع plex إيل-17A، TGF-β1، وتسلب أجريت هنا.
    1. لفحوصات، احتضان مقتطفات الآنف بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. إجراء القياسات كما الواحد الصانع القياسية البروتوكول (انظر الجدول للمواد).
      ملاحظة: تحديدكم (انظر الجدول للمواد) وعادة ما يكون مجموعة ديناميكية عالية لقياس تتراوح ما بين 1 & 10,000 بيكوغرام/مل، ولكن يمكن لبعض فحوصات، 100,000 بيكوغرام/مل. وهذا يعني أن جميع العينات التي يمكن تشغيلها في إضعاف نفسه، مما يحد من تأثير تخفيف متباينة في مواضيع صحية والمريضة، كما الحال في سائر تحديدكم مماثلة. وكان الحد الأدنى للكشف عن جميع السيتوكينات 1 بيكوغرام/مل أو أقل، والمستقطبات، تراوحت بين 1 & 50 بيكوغرام/مل. تسلب لم يكن يمكن اكتشافها في 98 في المائة عينات خلال شهر واحد من العمر.

3-الإحصاءات

  1. سجل تحويل البيانات قبل تحليلها للحصول على البواقي توزع عادة على المستويين سيتوكين وتشيموكيني.
  2. إذا كان يتم تحليل العينات في دفعة واحدة أو أكثر، تصحيح بيانات سيتوكين وتشيموكيني باتشويسي تتمحور حول تحويل سجل البيانات.
    1. إدراج يعني عموما وتحويل سجل المضادة للحصول على البيانات في وحدات القياس الأصلي.
      ملاحظة: لكل مجموعة من التحليلات التي فعلت، النظر في تعديل المتغيرات التي تؤثر في مستوى السيتوكينات والمستقطبات. وهذا يمكن أن تكون الأمهات التأثيرات (مثل تعاطي الكحول والتدخين أثناء الحمل)، والرضاعة الطبيعية، والآثار الضائرة أثناء أخذ العينات، الأخوة والأخوات، والحيوانات الأليفة في المنزل، إلخ

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخصائص الأساسية للملامح المناعية لمجرى الهواء:
تم الحصول على بيانات كاملة عن مستويات الوسيط المناعي في الغشاء المخاطي العلوي في مجرى الهواء في عمر شهر واحد في 620 (89٪) من 700 طفل مسجلين في مجموعة COPSAC2010. تم تسجيل عشرة حديثي الولادة قبل إنشاء هذه التقنية ، ولم يحضر 19 الزيارة التي استمرت شهرا. بالإضافة إلى ذلك ، تم استبعاد 47 عينة لأنه تم استخراجها وقياسها في مختبر آخر استخدم في دراسة تجريبية ، وفقدت 4 عينات أثناء النقل (انظر مخطط انسيابي الدراسة ، ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مع تقنية المعروضة هنا، كنا قادرين على تحديد في فيفو مجرى الهواء العلوي المخاطية المناعي التشكيل الجانبي في الأطفال من أقرب شهر واحد من العمر، والتي لم يتم مسبقاً. ولاحظنا أن وجود البكتيريا مجرى الهواء محددة وبيكورنافيروسيس7،11، فضلا عن أخرى من قبل والتعرض قبل الولادة، وكانت معكوسة في الشخصية محصنة ضد مجرى الهواء الولدان. وعلاوة على ذلك، نحن استخدام هذه البيانات الشخصية محصنة ضد مجرى الهواء لدراسة إليه العمل لمحاكمة معشاة ذات شواهد المغذيات الدقيقة لجرعة ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أن تعلن جميع المؤلفين أي تعارض المتصورة أو محتملاً أو حقيقيا في المصالح فيما يتعلق بمحتوى هذه المخطوطة. وكالات التمويل لم يكن أي دور في تصميم وإجراء الدراسة؛ جمع، وإدارة، وتفسير البيانات؛ أو إعداد ومراجعة والموافقة على المخطوطة. لا توجد شركة صيدلانية متورط في الدراسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن نعرب عن امتناننا للأطفال والأسر دراسة الأتراب كوبساك2010 لجميع الدعم والالتزام. نحن نعترف ونقدر جهود فريق البحث كوبساك ومساعدة تقنية من فني ليزبيث بووس روشولم، "جامعة الدنمارك التقنية"، لقياس السيتوكينات والمستقطبات فريدة من نوعها.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
صفائح البوليستر الليفية المهيدروكسيلةAccuwik Ultra   ؛SPR0730ورق الترشيح
Milliplex Assay Buffer   ؛MilliporeL-ABBuffer
لوحات تخزين ملزمة منخفضة البروتين Thermo ScientificCLS8161Plates
Protease InhibitorRoche11873580001قارئ كوكتيل مثبط البروتياز الخالي من EDTA
من الألواح متعددة البقعMesoscaleNASector imager 6000
Assays مقايسة السيتوكين البشرية المتوسطة 10-plex TH1 / TH2 ومقايسة الكيموكين 9-plex ، و singleplex IL-17A ، TGF- & beta ؛ 1 و TSLP. يمكن العثور على وصف على الإنترنت على www.mesoscale.com

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bousquet, J., van Cauwenberge, P., Khaltaev, N. Allergic Rhinitis and Its Impact on Asthma. J Allergy Clin Immunol. 108 (5), Supplement 147-334 (2001).
  2. Howarth, P. H., Persson, C. G. A., Meltzer, E. O., Jacobson, M. R., Durham, S. R., Silkoff, P. E. Objective monitoring of nasal airway inflammation in rhinitis. J Allergy Clin Immunol. 115 (3), Supplement 414-441 (2005).
  3. Bensch, G. W., Nelson, H. S., Borish, L. C. Evaluation of cytokines in nasal secretions after nasal antigen challenge: lack of influence of antihistamines. Ann Allergy Asthma Immunol. 88 (5), 457-462 (2002).
  4. Sussman, G. L., Mason, J., Compton, D., Stewart, J., Ricard, N. The efficacy and safety of fexofenadine HCl and pseudoephedrine, alone and in combination, in seasonal allergic rhinitis. J Allergy Clin Immunol. 104 (1), 100-106 (1999).
  5. Bisgaard, H., Robinson, C., Rømeling, F., Mygind, N., Church, M., Holgate, S. T. Leukotriene C4 and histamine in early allergic reaction in the nose. Allergy. 43 (3), 219-227 (1988).
  6. Chawes, B. L. K., et al. A novel method for assessing unchallenged levels of mediators in nasal epithelial lining fluid. J Allergy Clin Immunol. 125 (6), 1387-1389 (2010).
  7. Følsgaard, N. V., et al. Pathogenic bacteria colonizing the airways in asymptomatic neonates stimulates topical inflammatory mediator release. Am J Respir Crit Care Med. 187 (6), 589-595 (2013).
  8. Følsgaard, N. V., et al. Neonatal Cytokine Profile in the Airway Mucosal Lining Fluid Is Skewed by Maternal Atopy. Am J Respir Crit Care Med. 185 (3), 275-280 (2012).
  9. Chawes, B. L., et al. Effect of Vitamin D3 Supplementation During Pregnancy on Risk of Persistent Wheeze in the Offspring: A Randomized Clinical Trial. JAMA. 315 (4), 353-361 (2016).
  10. Bischoff, A. L., et al. Altered Response to A(H1N1)pnd09 Vaccination in Pregnant Women: A Single Blinded Randomized Controlled Trial. PloS One. 8 (4), 56700(2013).
  11. Wolsk, H. M., et al. Picornavirus-Induced Airway Mucosa Immune Profile in Asymptomatic Neonates. J Infect Dis. 213 (8), 1262-1270 (2016).
  12. Wolsk, H. M., Chawes, B. L., Følsgaard, N. V., Rasmussen, M. A., Brix, S., Bisgaard, H. Siblings Promote a Type 1/Type 17-oriented immune response in the airways of asymptomatic neonates. Allergy. 71 (6), 820-828 (2016).
  13. Alam, R., Sim, T. C., Hilsmeier, K., Grant, J. A. Development of a new technique for recovery of cytokines from inflammatory sites in situ. J Immunol Methods. 155 (1), 25-29 (1992).
  14. Ishizaka, A., et al. New bronchoscopic microsample probe to measure the biochemical constituents in epithelial lining fluid of patients with acute respiratory distress syndrome. Crit Care Med. 29 (4), 896-898 (2001).
  15. Ishizaka, A., et al. Elevation of KL-6, a lung epithelial cell marker, in plasma and epithelial lining fluid in acute respiratory distress syndrome. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 286 (6), 1088-1094 (2004).
  16. Nakano, Y., et al. Endothelin-1 level in epithelial lining fluid of patients with acute respiratory distress syndrome. Respirology. 12 (5), 740-743 (2007).
  17. Komaki, Y., et al. Cytokine-mediated xanthine oxidase upregulation in chronic obstructive pulmonary disease's airways. Pulm Pharmacol Ther. 18 (4), 297-302 (2005).
  18. Moeller, A., Franklin, P., Hall, G. L., Horak, F., Wildhaber, J. H., Stick, S. M. Measuring exhaled breath condensates in infants. Pediatr Pulmonol. 41 (2), 184-187 (2006).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Mucosal Lining FluidUpper AirwayImmune Mediator QuantificationNoninvasive SamplingFilter Paper AbsorptionElectrochemiluminescence ImmunoassayNasal Extract AnalysisProtease Inhibitor SupplementLow Protein Binding StoragePediatric Respiratory Diseases

مقالات ذات صلة