الهدف من هذا البروتوكول هو توفير نهج مباشر وغير مكلفة لجمع الأجنة ذبابة الفاكهة على نطاق متوسط (0.5-1 ز) وإعداد مقتطفات البروتين التي يمكن استخدامها في التطبيقات البروتين المصب، مثل تقارب مطياف الكتلة تنقية (أب-مس ).
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
أصبح تحليل التفاعلات البروتينية البروتين نهجا لا غنى عنه لدراسة العمليات والآليات البيولوجية، مثل إشارات الخلية، وتطوير الكائن الحي، والمرض. وغالبا ما يكون من المرغوب فيه للحصول على معلومات مؤشر أسعار المنتجين باستخدام في الجسم الحي المواد، للحصول على وجهة نظر الأكثر طبيعية وغير منحازة من شبكات التفاعل. ذبابة الفاكهة ذبابة الفاكهة ميلانوغاستر هو منصة ممتازة لدراسة مؤشر أسعار المنتجين في الجسم الحي ، ويتيح نفسه لنهج واضحة لعزل المواد للتجارب البيوكيميائية. على وجه الخصوص، تمثل الأجنة ذبابة الفاكهة نوع مناسب من الأنسجة لدراسة مؤشر أسعار المنتجين، ويرجع ذلك إلى سهولة جمع الحيوانات في هذه المرحلة التنموية وحقيقة أن غالبية البروتينات وأعرب في التطور الجنيني، وبالتالي توفير بيئة ذات صلة للكشف عن معظم مؤشر أسعار المنتجين. هنا نقدم بروتوكول لجمع الأجنة ذبابة الفاكهة على نطاق متوسط (0.5-1 ز)، وهو مبلغ مثالي لمجموعة واسعة منتطبيقات البروتين، بما في ذلك تحليل مؤشر أسعار المنتجين من قبل تقارب مطياف الكتلة تنقية (أب-مس). نحن تصف تصاميمنا ل 1 L و 5 L أقفاص لمجموعات الجنين التي يمكن أن تكون بسهولة وتكلفة اقامة في أي مختبر. ونحن نقدم أيضا بروتوكول عام لجمع الجنين واستخراج البروتين لتوليد ليسيتس التي يمكن استخدامها مباشرة في التطبيقات المصب مثل أب-مس. هدفنا هو توفير وسيلة متاحة لجميع الباحثين لتنفيذ تحليلات مؤشر أسعار المنتجين في الجسم الحي .
المقدمة
الشاشات الجينية، ومؤخرا، النهج الجينومية ثورة في دراسة الوظائف البيولوجية. ومع ذلك، يتم ترميز المعلومات الخلوية الهامة في البروتينات ومجموعتها من الشركاء المتفاعلين. في حين أن شاشات المعدل الجيني التقليدية يمكن تحديد مكونات مسار الحد من معدل واستعادة التفاعلات غير المباشرة، وقوة النهج البروتين يكمن في قدرتها على تحديد شبكات التفاعل الفوري الكامل للبروتينات ذات الاهتمام. وبالتالي، فإن بروتيوميكس طريقة متعامدة قيمة لدراسة النظم البيولوجية، ويكمل علم الجينوم، ترانسكريبتوميكس، والشاشات الوراثية التقليدية. وقد أثبتت تقارب مطياف الكتلة تنقية (أب-مس) أن يكون نهجا قويا لدراسة التفاعلات البروتين البروتين (بي) في بيئتهم الأصلية في الخلاي....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. إعداد 5 L أقفاص يطير (لتتناسب مع 15 سم لوحات)
- الحصول على المواد اللازمة: 5-كوارت (4.7-L) الحاويات مع غطاء ( الشكل 1A )، شبكة النايلون، وشفرة الحلاقة.
- علامة دائرة قطرها 12 سم وقطع حفرة في الجزء السفلي من الحاوية باستخدام شفرة حلاقة ( الشكل 1B ). قطع حفرة قطرها 15 سم في الغطاء ( الشكل 1C ).
- قطع شبكة النايلون في 25 × 25 سم الساحات.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
لتوضيح استخدام هذا البروتوكول في تجربة تنقية معقدة البروتين، أنشأنا خط متماثل قابلة للحياة ذبابة، الذراع إغف- إرك، معربا عن إغف الموسومة ذبابة الفاكهة خارج الخلية ينظم إشارة كيناز (إرك، المشفرة من قبل الجينات توالت ) تحت السيطرة من المدرع أعرب عنها في كل مكان ( الذراع ) المروج 18 ، 19 . الذراع المروج نشط خلال م.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
بروتوكول المقدمة هنا هو إجراء بسيط وعمومي لإعداد أقفاص السكان ذبابة الفاكهة على نطاق متوسط، وجعل مقتطفات البروتين خلية كاملة من الأجنة. ويمكن استخدام مقتطفات الناتجة في مجموعة متنوعة من التطبيقات المصب، مثل تنقية المجمعات البروتين على راتنجات تقارب. فمن الأهمية بمكان لأداء خطوات استخراج على الجليد واستخدام تثبيط البروتيني قوية، للحد من تدهور البروتين. كما هو موضح، والبروتوكول هو مناسبة لعزل معظم سيتوبلازميك وبعض الغشاء والبروتينات النووية القابلة للذوبان
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
شكر وتقدير
يشكر المؤلفون أعضاء مختبر فيراكسا على تعليقات مفيدة حول المخطوطة واقتراحات لتحسين البروتوكول. تم دعم أف من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح GM105813 و NS096402. وقد دعم لي من جامعة ماساتشوستس بوسطن سانوفي جنزيمي الدكتوراه زمالة.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| Leaktite 5-Qt. حاوية طبيعية متعددة الخلطات (عبوة من 3) | هوم ديبوت | 209330 | لصنع أقفاص سعة 5 لتر. |
| Leaktite 5-Qt. غطاء طبيعي متعدد المزيج (عبوة من 3) | هوم ديبوت | 209320 | قطر 8.37 بوصة. أغطية لأقفاص 5 لتر. |
| أطباق فيشربراند بتري بغطاء شفاف ، 100 × 15 مم | FB0875712 فيشر العلمي | المادة: بوليسترين. يستخدم مع أقفاص 1 لتر. | |
| أطباق فيشربراند بتري بغطاء شفاف ، 150 × 15 مم | FB0875714 فيشر العلمي | المادة: البوليسترين. يستخدم مع أقفاص سعة 5 لتر. | |
| أطباق فيشربراند بتري بغطاء شفاف ، 60 × 15 ملم | FB0875713A فيشر العلمي | المادة: بوليسترين. تستخدم أثناء تفكك الجنين. | |
| شبكة نايلون سيفر نيتكس | سيفر | 03-180 / 44 | 180 ميكرون ، 44٪ منطقة مفتوحة ، تستخدم لأقفاص الذباب. |
| ميلووكي 3 في. منشار ثقب الجرار مع مستودع Arbor | Home | Depot 49-56-9670 | أداة قطع مقاس 3 بوصات لصنع أقفاص سعة 1 لتر. |
| Nalgene واسعة الفم مستقيمة الوجهين PMP الجرار مع إغلاق المسمار البولي بروبلين الأبيض | فيشر Scientific | 11-823-33 | لصنع أقفاص 1 لتر. القط العلمي الحراري # 21171000. يمكن استخدام حاويات بديلة سعة 1 لتر. |
| الخميرة الجافة النشطة ريد ستار ، 2 رطل كيس | ريد ستار ؛ | يمكن شراؤها من Amazon.com أو موردين آخرين. | |
| عصير التفاح المجمد 100٪ | يمكن شراؤها من محل بقالة. يجب أن تقول "عصير تفاح 100٪" على العلبة. | ||
| ميثيل 4-هيدروكسي بنزوات | Acros Organics | AC126965000 | أيضا باسم ميثيل بارابين أو تيغوسيبت. تستخدم كمادة حافظة في ألواح AJ. |
| IGEPAL CA-630 للبيولوجيا الجزيئية ، 100 مل | Sigma | I8896 | تستخدم لإعداد عازلة التحلل. |
| وحدات تصفية معقمة سريعة التدفق يمكن التخلص منها من Nalgene مع غشاء CN ؛ | فيشر العلمي | 09-740-2A | 0.2 & م حجم المسام. تستخدم لتصفية 5x تحلل المخزن المؤقت. القط العلمي الحراري # 1260020. |
| كوكتيل CO-RO ROCHE كوكتيل | سيجما | 11697498001 | من 20 قرصا. تستخدم لتثبيط الإنزيم البروتيني في عازلة التحلل. |
| مرشحات حقنة Corning SFCA | فيشر Scientific | 09-754-21 | غشاء SFCA ، قطر 26 مم ، حجم المسام 0.45 مو م. تستخدم لتصفية عينات المستخلصات النهائية. |
| BD محاقن Luer-Lok التي تستخدم لمرة واحدة بدون إبر | فيشر Scientific | 14-823-2A | لتصفية عينات المستخلصات النهائية. BD القط # 309604. |
| شراء Bleach | Clorox | المستخدم في تفكيك الأجنة بنسبة 50٪ (حجم / حجم) في الماء ، من أي سوبر ماركت. من المهم استخدام ماركة كلوركس ، حيث قد تؤدي العلامات التجارية الأخرى إلى عدم اكتمال الكسرة أو قد تكون سامة للأجنة. | |
| لوحات Corning Costar Netwell Plates | Fisher Scientific | 07-200-213 | حاويات شبكية لمجموعات الأجنة. 74 مو ؛ م حجم شبكة ، 6 بئر. |
| مطاحن المناديل من Wheaton Dounce ، سعة 15 مل | الخالط Fisher Scientific | 06-435B | للأجنة ، مع مدقات فضفاضة وضيقة. قطة ويتون # 357544. |
المراجع
- Veraksa, A. Regulation of developmental processes: insights from mass spectrometry-based proteomics. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 723-734 (2013).
- Gavin, A. C., Maeda, K., Kuhner, S. Recent advances i....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
