يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

إطار منهجي موحد لبحوث شفاني الدهليزي

7.3K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/55827

⸱

يونيو 20, 2017

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

والهدف من هذا البروتوكول هو الخطوط العريضة لجمع ومعالجة العينات الجراحية البشرية لتطبيقات المصب متعددة في شفاني الدهليزي والبحوث خلية شوان.

الملخص

ششوانوماس الدهليزي هي الأورام الأكثر شيوعا من زاوية سيريبيلوبونتين، مما يشكل 6-8٪ في المئة من جميع النمو داخل الجمجمة. على الرغم من أن هذه الأورام تسبب فقدان السمع العصبي في ما يصل إلى 95٪ من الأفراد المتضررين، والآليات الجزيئية الكامنة وراء هذا فقدان السمع تبقى بعيد المنال. توضح هذه المقالة الخطوات المنصوص عليها في مختبرنا لتسهيل جمع ومعالجة مختلف عينات الأنسجة البشرية الأولية لتطبيقات البحوث المصب لا يتجزأ من دراسة ششوانوماس الدهليزي. على وجه التحديد، يصف هذا العمل إطار منهجي موحد لجمع ومعالجة وثقافة شوان وخلايا شفاني من العينات الجراحية. يتم دمج هذا مع خطوات المعالجة المتوازية التي تعتبر ضرورية حاليا للبحوث الحالية: جمع الورم وإفرازات الأعصاب، والحفاظ على الحمض النووي الريبي واستخراج البروتين من الأنسجة التي تم جمعها، تثبيت الأنسجة لإعداد أقسام،د تعرض الخلايا البشرية الأولية إلى الفيروسات المرتبطة الغدة لتطبيق العلاج الجيني. بالإضافة إلى ذلك، هذا العمل يسلط الضوء على النهج الجراحي ترانزبيرينثين لجمع هذا الورم كفرصة فريدة للحصول على ظهارة حسية الإنسان من الأذن الداخلية و بيرليمف. وتقدم نصائح لتحسين الجودة التجريبية والمزالق المشتركة أبرزت.

المقدمة

ششوانوماس الدهليزي (فس) هي الأورام الأكثر شيوعا من زاوية سيريبيلوبونتين، وتشخص في 1 من كل 100،000 شخص. على الرغم من غير النقيلي، وهذه الأورام تؤثر بشدة على نوعية حياة المريض 1 ، 2 ، 3 ، 4 ، 5 ، 6 . الأفراد المصابون عادة يعانون من فقدان السمع، وطنين، والشعور بالامتلاء السمعي. الأعراض تصبح المنهكة على نحو متزايد مع نمو الورم، مما تسبب في مشاكل التوازن، وشلل في الوجه، وضعف وظائف العصب القحفي الأخرى. المضاعفات التي تهدد الحياة بسبب ضغط ....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم الحصول على الموافقة الخطية المستنيرة لجمع جميع العينات قبل الجراحة، وأجريت التجارب وفقا لمدونة أخلاقيات الجمعية الطبية العالمية (إعلان هلسنكي). تمت الموافقة على جميع أقسام بروتوكول الدراسة من قبل مجلس المراجعة المؤسسية في مستشفى ماساتشوستس للعيون والأذن ومستشفى ماساتشوستس العام.

ملاحظة: تم تصميم الأقسام 1-7 أدناه ليتم تنفيذها بالتتابع عند استلام عينة أساسية فس أو غان الإنسان من غرفة العمليات. وينبغي أن تبدأ المعالجة دائما بالقسم 1. ثم، كقاعدة عامة، ينبغي الحفاظ على الحمض النووي الريبي أولا (القسم 2)، تليها إعداد الأنسجة لجمع إفرازات (القسم 3) واستخراج البرو....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

ويمكن معالجة الخلايا فس الإنسان الأولية في الثقافة، على النحو المنصوص عليه في القسم 5، كنماذج إعلامية للعمليات المرتبطة بالمرض في العديد من تطبيقات البحوث المصب ( الشكل 1 ). خلايا شوان صحية مثقف في القسم 6 توفر نقطة مباشرة ومفيدة من المقارنة. وكما هو مبين أدناه، تتوفر بيانات واسعة من محطات فس و غان وفقا لهذا الإطار المنهجي الموحد في مقالات متعددة نشرت سابقا 12 و 13

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تصف هذه المخطوطة إطارا منهجيا موحدا للبحث فس، وتحدد المعالجة المتزامنة للعينات البشرية فس و غان لتطبيقات البحث المصب. كما يدخل بحث فس عمر الطب الدقة، وإعداد نفس العينة في أشكال قادرة على الإجابة على العديد من الأسئلة البحثية سوف تمكن من اكتشاف رؤى الجزيئية والخلوية والجينية، والبروتينية محددة للمرضى الفردية.

تم تقييم نقاء الخلايا شوان الإنسان والثقافات فس بدقة مع مرور الوقت عن طريق إمونوسيتوشيميستري، وذلك باستخدا.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

وأيد هذا العمل من قبل المعهد الوطني للصمم وغيرها من منح اضطرابات الاتصالات R01DC015824 (كمز) و T32DC00038 (دعم جيس و سد)، ومنح وزارة الدفاع W81XWH-14-1-0091 (كمز)، ومؤسسة بيرتاريللي (كمز) ، ومؤسسة يوم نانسي سايلز (كمز)، ومركز لور تينيتوس للبحوث (كمز)، ومؤسسة بارنز (كمز).

....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
BioCoat Poly-D-Lysine / Laminin 12 مم # 1 غطاء زجاجي ألمانيCorning354087أو قم بإعداد أغطية باستخدام Corning Laminin (CB-40232) و Cultrex Poly-L-Lysine (3438-100-01) أنابيب
الطرد المركزي CELLSTAR 15 مل ، قاع مخروطي ، تخرج ،Greiner Bio-One188161
CELLSTAR 50 مل ، قاع مخروطي ، تخرج ، معقمGreiner Bio-One227261
طبق ثقافة الخلية CELLSTAR ، 60 ممGreiner Bio-One628160
كولاجيناز من Clostridium histolyticum ،Sigma-AldrichC1639
Costar 24 ألواح آبار متعددة معالجة بتقنية TCكورنينجمعقمة 3526
DAPI (4 '، 6-Diamidino-2-Phenylindole ، ثنائي هيدروكلوريد)Thermo Fisher ScientificD1306
DMEM ، نسبة عالية من الجلوكوز ، البيروفات ، بدون جلوتامين ، 500 ملثيرمو فيشر Scientific10313-039
DMEM / F-12 ، 500 ملثيرمو فيشر Scientific11320-033
Dumont # 3 ملقط ، DumoxelFine Science Tools11231-30الأوتوكلاف قبل الاستخدام
Dumont # 5 Fallps ، طرف قياسي ، InoxFine Science Tools11251-20الأوتوكلاف قبل الاستخدام
مصل الأبقار الجنيني ، المؤهل ، المناطق المعتمدة من وزارة الزراعة الأمريكية ، 500 ملThermo Fisher Scientific10437-028Aliquot في أنابيب 50 مل وتخزينها في -20 درجة ؛ C فريزر
هيالورونيداز من الخصيتين البقرية ، النوع I-S ، مسحوق المجفف بالتجميدSigma-AldrichH3506
Millex-GP وحدة تصفية حقنة ، 0.22 & micro ؛ م ، بولي إيثر سلفون ، 33 مم ،EMD Milliporeمعقم SLGP033RS
بارافورمالدهيد ، درجة الكاشف ، بلوريسيجما-ألدريتشP6148قبل الاستخدام: ضع إجراءات تشغيل قياسية بناء على البروتوكولات المتاحة عبر الإنترنت
PBS ، درجة الحموضة 7.4 ، 500 ملThermo Fisher Scientific10010-023الأوتوكلاف قبل استخدام
البنسلين الستربتومايسين (10,000 وحدة / مل) ، 100 ملحراري فيشر ساينتفيك15140-122
أقراص مثبطات الفوسفاتيز PhosSTOP أقراصمثبطات البروتياز Roche04906845001
Pierce Thermo Fisher Scientific88666
ماصات وأطراف ماصة ، 5/10/25 ملمتغير
تجانس بلاستيكي متغير مدقة ل 1.5 / 2.0 مل MicrotubesE & إبر K ScientificEK-10539
PrecisionGlide ، 27 جم × 1 1/2 بوصةBD301629
RIPA BufferBoston BioProductsBP-115
RNAlater (محلول تثبيت الحمض النووي الريبي)الآمن من Thermo Fisher ScientificAM7021
، بولي بروبيلين ، 0.5 ملEppendorf022363719الأوتوكلاف قبل الاستخدام
أنابيب الطرد المركزي الدقيقة ذات القفل الآمن ، بولي بروبيلين ، 1.5 ملإيبندورف022363204الأوتوكلاف قبل الاستخدام
محلول ملحي - 0.9٪ حقن كلوريد الصوديوم ، جراثيم ، 20 ملHospira0409-1966-05
شفرات مشرط - # 15أدوات العلوم الدقيقة10015-00
أنبوب شفط Schuknecht 24 مقياسBausch + LombN1698 42مفيد للنهج الجراحي (بالإضافة إلى الأدوات الجراحية الشائعة للأنف والأذن) و على سبيل المثال < / em> حاوية عينة علامة جراحية
زرقاء ، أو معقمة ، 4OZMedlineDYND30331H
Stemi 2000-C مجهر ستيريوZeiss0000000-1106-133
مزيج حقنة / إبرة ، طرف Luer-Lok ، 5 مل ، 22 جم × 1 بوصة.BD309630
حقنة توبركولين فقط ، طرف انزلاق ، 1 ملBD309659
حقنة توبركولين فقط ، طرف انزلاق ، 3 ملBD309656
الخالط بالموجات فوق الصوتية ، سلسلة 4710 ، مسبار CV18Cole-ParmerCP25013
أنابيب الطرد المركزي المعقمة معقمة ، متغير أنابيب الطرد المركزي الدقيقة ذات القفل

المراجع

  1. Babu, R., et al. Vestibular schwannomas in the modern era: epidemiology, treatment trends, and disparities in management. J Neurosurg. 119 (1), 121-130 (2013).
  2. Gal, T. J., Shinn, J., Huang, B. Current epidemiology and manage....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

خلايا شوانزراعة الخلايا الأوليةجمع إفرازات الورمحفظ الحمض النووي الريبوزياستخلاص البروتينتثبيت الأنسجةالفيروس المرتبط بالغدةالنهج عبر المتاهةبروتوكول زراعة الخلايا