وصف وظيفة مستقبلات الرائحة يخدم جزءا لا غنى عنه في عملية ديورفانيزيشن. يصف لنا طريقة لقياس تنشيط مستقبلات الرائحة في الوقت الحقيقي باستخدام مقايسة مخيم.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
خلية يعيش "قياس الرائحة مستقبلات التنشيط باستخدام" مقايسة مخيم في الوقت الحقيقي
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
أحجام ضخمة من الأسر (أو) مستقبلات الرائحة الثدييات صعوبات للعثور على يغاندس المشابهة بين العديد من المواد الكيميائية المتطايرة. بكفاءة ودقة ديورفانيزي أملاح الإماهة الفموية، ونحن الجمع بين استخدام خط الخلية مغايرة للتعبير عن الثدييات أملاح الإماهة الفموية وبلازميد biosensor معدلة وراثيا لقياس إنتاج المخيم المصب أو التنشيط في الوقت الحقيقي. يمكن استخدام هذا التحليل للشاشة odorants ضد أملاح الإماهة الفموية، و العكس بالعكس. يمكن تأكيد التفاعلات مستقبلات الرائحة من على شاشات في وقت لاحق عن طريق اختبار ضد مختلف رائحة تركيزات، توليد منحنيات التركيز-استجابة إيجابية. هنا استخدمنا هذا الأسلوب لإجراء فرز الفائق مجمع معطر ضد بشرية أو مكتبة المعرب عنها في الخلايا Hana3A وأكدت أن مستقبلات ردا إيجابيا من مستقبلات المشابهة لمجمع الفائدة. وجدنا هذا الأسلوب الكشف عن الفائق لتكون فعالة وموثوق بها في تقييم أو التنشيط وتقديم البيانات المتوفرة لدينا مثال على إمكانية استخدامها في الدراسات الفنية أو.
المقدمة
حاسة الشم دوراً هاما في بقاء الحيوانات كما أنهم يعتمدون على قدراتهم حاسة الشم للحصول على الغذاء وتجنب الحيوانات المفترسة وخطر، والتمييز بين الأنواع وحدد ماتي1،2. ويتوقف تحقيق هذه المهام على مستقبلات الرائحة (أملاح الإماهة الفموية)، التي يتم التعبير عنها على حدة على السطح الهدبية الخلايا العصبية الحسية حاسة الشم (أوسنس) الواقعة في ظهارة حاسة الشم (عمر الفاروق). أملاح الإماهة الفموية تشكل أكبر عائلة من فوق مستقبلات (GPCR) ز-البروتين إلى جانب عائلة مع حوالي 400 و 1200 الجينات أو متنوعة في الإنسان والفأر، على التوالي3،4،5....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1-كولتورينج وصيانة الخلايا Hana3A
- المحافظة على الخلايا في 10 مل متوسطة الأساسية الدنيا (MEM) مع 10% الجنيني البقري المصل (FBS)، 100 ميكروغرام/مل البنسلين-ستربتوميسين، و 1.25 ميكروغرام/مل الامفوتريسين ب في 100 ملم خلية ثقافة طبق في حاضنة ثقافة خلية 37 درجة مئوية مع 5% CO 2. مع كل مرور أخرى، أضف 1 ميكروغرام/مل بوروميسين للحفاظ على تعداء مستقرة من البلازميدات (انظر المقدمة).
ملاحظة: تنفيذ جميع الخطوات التي تنطوي على زراعة الخلايا في الصف الثاني السلامة البيولوجية مجلس الوزراء لضمان بيئة معقمة. - ثقافة فرعية بنسبة 10-20% في 100 ملم الأطباق كل 2-3 أيام-
2. طلاء الخلايا تعداء
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
مسكون هو العنصر الرئيسي العطرية من المسك الطبيعي. الدراسات الأخيرة OR5AN1 التي تم تحديدها كمستقبل بشرية مسكون وغيرها من المركبات المسك ماكروسيكليك استناداً إلى التماثل بالماوس، أو MOR215-1، مستنسخ من glomeruli مسكون المراعية في التصرف الفئران37،38. بفحص مرجع أو البشرية ومجموعتنا ومجموعة تورا أيضا التعرف على OR5AN1 كمستقبل رئيسي لمركبات المسك ماكروسيكليك اثنين وسيكلوبينتاديكانوني ومسكون، على التوالي، استخدام لوسيفراس فحص نظام
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
دقة قياس التنشيط أو عند التعرض للرائحة معينة هو الخطوة الأولى في فك ترميز المعلومات حاسة الشم. أظهرت التجارب في هذه الدراسة تمثل مثالاً لأحد كيف يمكن تحديد، باستخدام في المختبر أو تعبير النظام، استجابة أملاح الإماهة الفموية بين مرجع أو البشرية للمادة الكيميائية معطر للفائدة وتميز في وقت لاحق مستقبلات علم الأدوية باستخدام تركيزات مختلفة من هذه المادة الكيميائية. وتؤكد النتائج التي توصلنا إليها OR5AN1 كمستقبل حسن النية مسكون. وهذا يتسق مع تقرير سابق39 وتوفر المزيد من الأدلة للتكهنا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
شكر وتقدير
وكان دعم العمل "مؤسسة العلوم الوطنية الصينية" (31070972)، والعلوم و "التكنولوجيا لجنة من بلدية شانغهاي" (16ZR1418300)، برنامج "مبتكر البحث فريق من شانغهاي البلدية لجنة التعليم"، شرق شانغهاي الباحث (J50201)، وبرنامج البحوث الأساسية الوطنية للصين (2012CB910401).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| أمفوتريسين ب | سيجما | A2942 | |
| DMSO | سيجما | D2650 | |
| FBS | جيبكو | 10099-141 | |
| كاشف GloSensor cAMP | Promega | E1290 | |
| pGloSensor-20F cAMP البلازميد | خلايا Promega | E1171 | |
| Hana3A | متاحة من المؤلفين عند الطلب | ||
| HBSS ، بدون الكالسيوم أو المغنيسيوم | GIBCO | 14175095 | |
| HEPES | Hyclone | SH30237 | |
| Lipofectamine2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| M3R بلازميد | مستنسخ في ناقل تعبير الثدييات مثل pCI | ||
| MEM ، مع EBSS و L-glutamine | Hyclone | SH30024 | |
| Muscone | Cruz | sc-200528 | |
| المسك التبتية | Sigma-Aldrich | S359165 | |
| أو البلازميدات | المستنسخة باستخدام علامة Rho في ناقل تعبير الثدييات مثل pCI | ||
| PBS ، بدون الكالسيوم أو المغنيسيوم | Cellgro | 21-040-CV | |
| Penicillin-Streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
| Plasmid miniprep kit | Tiangen | DP103-03 | |
| Puromycin | Sigma | P8833 | |
| RTP1S بلازميد | مستنسخ في ناقل تعبير للثدييات مثل pCI | ||
| Trypsin-EDTA | Hyclone | SH30236 | |
| أنبوب PCR 0.2 مل | Axygen | PCR-02-C | |
| 1.5 مل أنبوب Eppendorf | |||
| 15 مل 17 مم × 120 مم أنبوب مخروطي الشكل | BD Falcon | 352096 | |
| آبار و / أو 12 بئر متعدد القنوات | Eppendorf | ||
| زراعة الخلايا البيضاء ذات القاع المسطح 96 بئر | Greiner | 655098 | |
| 100 مم × 20 مم | Fal | 353003 | |
| خزانة السلامة البيولوجية من الفئة الثانية مع تدفق | |||
| رقائقيحاضنة زراعة الخلايا ، مع 5٪ CO2< / sub> | |||
| الطرد المركزي ، مع دوار دلو متأرجح للأنابيب المخروطية سعة 15 مل قارئ | |||
| الألواح اللانهائي F200 | |||
| مع أهداف | |||
| مقياس الطيف الضوئي | |||
| خزانات كاشف معقمة للتوزيع | |||
| منشفة |
المراجع
- Malakoff, D. Following the scent of avian olfaction. Science. 286 (5440), 704-705 (1999).
- Zippel, H. P. The ecology of vertebrate olfaction: D.M. Stoddart. Chapman and Hall, Andover, Great Britain, 1980. £15.00, 234 pp. ISBN 0-412-21820-8. Behav Processes. 7 (2), 198-199 (1982).
- Dryer, L., Berghard, A.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
