مقالة منهجية

ميكروفلويديك تدفق التدفق الخلوي بواسطة غير المتماثلة الكشف الوقت تمتد المجهر الضوئي (أتوم)

DOI:

10.3791/55840

⸱

يونيو 28, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Electrical and Electronic Engineering, The University of Hong Kong, 2Department of Mechanical Engineering, The University of Hong Kong

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول تنفيذ غير المتماثلة الكشف عن الوقت المجهر نظام المجهر الضوئي لتصوير خلية واحدة في تدفق فائق السرعة ميكروفلويديك وتطبيقاتها في التصوير التدفق الخلوي.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد كان التوسع في عدد المعلمات القابلة للقياس، والذي يسمح لتحليل البيانات متعددة الأبعاد وبالتالي النتائج الإحصائية أعلى الثقة، والاتجاه الرئيسي في التطور المتقدم للتدفق الخلوي. ومن الجدير بالذكر أن إضافة قدرات التصوير عالية الدقة يسمح للتحليل المورفولوجي المعقدة للهياكل الخلوية / الفرعية الخلوية. هذا غير ممكن مع مقياس التدفق الخلوي القياسي. ومع ذلك، فإنه من المهم للنهوض معرفتنا الوظائف الخلوية ويمكن أن تستفيد البحوث علوم الحياة والتشخيص السريري، والرصد البيئي. دمج قدرات التصوير في التدفق الخلوي يضعف إنتاجية الفحص، ويرجع ذلك أساسا إلى القيود على السرعة والحساسية في تقنيات الكاميرا. للتغلب على هذه السرعة أو تحديا الإنتاجية التي تواجه التصوير الخلوي التدفق الخلوي مع الحفاظ على جودة الصورة، وقد أثبتت عدم المتماثلة الكشف عن امتداد المجهر الضوئي (أتوم) لتمكين عالية التباين، صورة خلية واحدةمع دقة فرعية الخلوية، في إنتاجية التصوير تصل إلى 100،000 الخلايا / ثانية. واستنادا إلى مفهوم التصوير للتصوير التقليدي الممتد عبر الزمن، والذي يعتمد على ترميز الصور البصري واسترجاعها من خلال استخدام نبضات ليزر عريضة النطاق فائقة السرعة، فإن أتوم تزيد من أداء التصوير من خلال تعزيز تباين الصورة للخلايا غير الملوثة / غير الملوثة. ويتحقق ذلك عن طريق النفاذ إلى معلومات تدرج الطور للخلايا، التي يتم تشفيرها طيفيا في نبضات ذات نطاق عريض واحد. وبالتالي، أتوم مفيد بشكل خاص في القياسات الإنتاجية العالية من التشكل وحيدة الخلية والملمس - معلومات تدل على أنواع الخلايا، والوظائف، وحتى وظائف. في نهاية المطاف، وهذا يمكن أن تصبح قوية التدفق التدفق الخلوي منصة للفينوتيبينغ الفيزيائية الحيوية من الخلايا، واستكمال الحالية للدولة من بين الفن مقايسة الخلوية البيوكيميائية القائم على علامة. يصف هذا العمل بروتوكول لإنشاء الوحدات الرئيسية لنظام أتوم (من الواجهة البصرية إلى البيانات pروسيسينغ والتصور الخلفية)، فضلا عن سير العمل من التدفق التدفق الخلوي على أساس أتوم، وذلك باستخدام الخلايا البشرية والطحالب الصغيرة على سبيل المثال.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التصوير البصري يقدم أداة قوية والفحص القائم على الخلية ل (تقريبا) غير الغازية تصور التوزيع المكاني المفصل للعديد من المكونات الخلوية / تحت الخلوية، وبالتالي كشف العديد من التوقيعات المورفولوجية والبيوفيزيائية، والحيوية الجزيئية للخلايا. ومع ذلك، فإن هذه القدرة على استخراج معلومات عالية المحتوى من خلايا واحدة قد تعرضت للخطر عموما عندما كان عدد كبير من السكان وغير متجانسة من الخلايا يجب التحقيق. ويمثل هذا مفاضلة مشتركة في المقايسات القائمة على الخلية بين الإنتاجية القياس والمحتوى. ومن الأمثلة البارزة على ذلك أن إضافة القدرة على التصوير لتدفق الخلوي أدى إلى انخفاض حجم الانتاجية من قبل ما لا يقل عن 1-2 أوامر من حجم بالمقارنة مع أن التقليدية غير التصوير التدفق الخلوي. على الرغم من أنه يمكن أن توفر معقدة التحليل الخلايا واحدة المورفولوجية التي لا يمكن مع أجهزة قياس التدفق الخلوي القياسية 1 ، التصوير الخلوي التدفق الخلوي يفتقر عموما الإنتاجية الكافية لمعرفتباين التغاير الخلوي مع الثقة الإحصائية العالية. وهذا ضروري للاكتشافات الجديدة في علم الأحياء وللفهم التسبب في الأمراض. ويكمن التحدي التقني الرئيسي في الحد الأقصى للسرعة المتأصل الذي تفرضه استراتيجيات التصوير البصري المشتركة: مسح شعاع الليزر (على سبيل المثال، بواسطة مرايا غلفانومترية) و / أو أجهزة استشعار الصور (على سبيل المثال، الجهاز المقترن بالشحن (كسد) أكسيد أشباه الموصلات (كموس)). إن سرعة المسح الضوئي بالليزر مقيدة جوهريا بفعل الجمود الميكانيكي لمرايا المسح الضوئي، في حين أن معدل إطار كسد أو كموس محدود بالمقايضة الأساسية بين سرعة التصوير والحساسية ( أي أن زيادة معدل الإطار يؤدي إلى انخفاض حساسية الكشف عن الإشارة ، والعكس بالعكس).

واستنادا إلى كل البصرية، فائق السرعة آلية ترميز الصورة، وقد ثبت البصرية التصوير تمتد تمتد كمنصة جذابة لانتاج عالية تدفق تدفق الخلايامتر، دون الحاجة إلى أجهزة الاستشعار الصورة التقليدية أو المسح الضوئي الميكانيكي ليزر 2 ، 3 . ويمكن الاطلاع على الوصف التفصيلي لمبدأ العمل من الوقت تمتد التصوير في المراجع 4 ، 5 ، 6 ، 7 . وباختصار، تتكون من خطوتين لرسم الخرائط القابلة للتبديل: (1) التشفير الطيفي (رسم خرائط الطول الموجي)، حيث يتم تعيين إحداثيات مكانية للعينة المصورة إلى أطوال موجية مختلفة عبر طيف الحزمة النبضية النابضة 8 ، 9 ، و (إي) تحول فورييه التشتت (رسم الخرائط الطول الموجي) 9 ، حيث يتم تحويل مكونات الطول الموجي من نبضات الليزر الفردية (امتدت) عن طريق تشتت سرعة المجموعة (غفد) إلى الموجي (موجة الطول اجتاحت) الموجي ( الشكل 1 ). مهمسمة من سمات التصوير الوقت تمتد هو التضخيم البصري، الذي يلعب دورا حاسما في مكافحة فقدان حساسية بسبب فوتوديتكتيون فائق الوضوح وفقدان غفد، وبالتالي تعزيز نسبة إشارة إلى الضوضاء الصورة (شنر) دون أن تكون ملوثة ضوضاء فوتوديتكتور 9 . وبما أن كل نبضة ليزر تشفر خطا مسحيا للعينة المصورة، وهي متعامدة لتدفق أحادي الاتجاه للخلايا، فإن معدل مسح الخط الفعال يحدده معدل تكرار الليزر، الذي يتجاوز عادة مهز 10. هذه العملية فائق السرعة تمكن خالية من الضبابية، التقاط صورة خلية واحدة في الإنتاجية من 10،000-100،000 خلية / ثانية ( أي 10-100 مرات أعلى من التصوير الخلوي التدفق الخلوي التقليدي). ونتيجة لذلك، يمكن أن التصوير التصوير على نطاق زمني العثور على تطبيقات فريدة من نوعها في الإنتاجية العالية، خلية واحدة، والفحص القائم على الصورة، وخاصة عندما تكون هناك حاجة لتحديد عدم التجانس غير معروف أو خلايا نادرة / شاذة ضمن عدد كبير من السكان (الآلاف إلى الملايين من سل لس)، مثل نادرة فحص الخلايا السرطانية 10 أو الصغرى الطحالب تصنيف 11 .

ويعتمد التصوير الممتد زمنيا في الغالب على التقاط صورة مشرقة (بف)، يتم من خلالها تباين الصورة من خلال تشتت الضوء وامتصاصه من الخلايا 2 ، 3 ، 9 ، 10 ، 11 . هذه القدرات خالية من التسمية، خلية واحدة التصوير يمكن أن تتجاوز الآثار الضارة المرتبطة تسميات الفلورسنت، مثل السمية الخلوية و فوتوبلاشينغ، وبعد تقديم معلومات قيمة لتحليل خلية واحدة على أساس الخلوية وشبه الخلوية الملمس والتشكل. وقد أثبتت هذه المعلمات خالية من التسمية لتكون فعالة لتصنيف صورة عميقة من الخلايا، وخصوصا عندما يكون عدد السكان خلية هائلة متاح 11 ،"كريف"> 12. ومع ذلك، في كثير من المناسبات، يفشل التصوير بف لتوفير تباين كاف للكشف عن مورفولوجيا مفصلة من الخلايا الشفافة خالية من التسمية. وقد وضعت طرائق مختلفة خالية من التسمية، وعلى النقيض من المرحلة، وتمتد الوقت لتعزيز التصوير النقيض من معدلات الإطار فائق السرعة 13 ، 14 ، 15 . ومن بين هذه التقنيات، تم تطوير المجهر الضوئي الذي يمتد زمنيا غير متناظرة (أتوم) للكشف عن التباين التفاضلي (التباين التفاضلي - التباين - ديك) على أساس مفهوم مشابه لتصوير سليرن، مجانا، وارتفاع التباين التصوير من خلايا واحدة في سرعة ميكروفلويديك فائقة (تصل إلى 10 م / ث) 16 . ويمكن توليد هذا التأثير بسهولة من خلال الكشف المائل أو الإضاءة عن طريق عرقلة مسار الحزمة المشفرة بالصورة جزئيا أو إمالة الشعاع قبل الكشف الضوئي. ميزة أخرى من أتوم هو أالقدرة على الحصول في وقت واحد على اثنين من التناقضات التدرج المرحلة على طول التوجهات المعاكسة. ويؤدي الطرح الكثيف والجمع بين صورتين متعاكستين عكس التباين التفاضلي لمرحلة التدرج والتباين الامتصاصي، على التوالي، من نفس خط المسح الضوئي. يقدم هذا العمل بروتوكول مفصل يصف تنفيذ أتوم، بما في ذلك إنشاء الإعداد البصري، وإعداد العينة، والحصول على البيانات والتصور. على وجه التحديد، هذا العمل يدل على عملية أتوم مع التصوير خلية واحدة من خلايا الدم البشرية، والخلايا السرطانية، والعوالق النباتية (الطحالب الدقيقة). وهذا يسلط الضوء على تطبيق أتوم لتصوير التدفق الخلوي، وليس فقط في الساحة الطبية الحيوية، ولكن أيضا في البحوث البحرية والوقود الحيوي 17 ، 18 .

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد العينة

  1. إعداد العينات (الخلايا الملتصقة؛ خلايا مسف-7)
    1. إخراج طبق ثقافة الخلية من الحاضنة واستنزاف وسط الثقافة.
    2. شطف الخلايا على طبق مع 1X الفوسفات مخزنة المالحة (بس) لإزالة المتوسطة الثقافة المفرطة.
    3. إضافة 3 مل من محلول التربسين 0.25٪ إلى طبق الثقافة (قطر 100 ملم) ووضعها في 37 درجة مئوية، 5٪ كو 2 حاضنة لمدة 4 دقائق.
      ملاحظة: التربسين يذوب بروتين لاصق من الخلايا بحيث أنها سوف فصل من طبق الثقافة.
    4. تحقق لمعرفة ما إذا كانت جميع الخلايا منفصلة من طبق الثقافة باستخدام المجهر الضوئي (الهدف 10X). إن لم يكن، يهز بلطف طبق ثقافة الخلية.
    5. إضافة 4 مل من وسط الثقافة القياسية (وضعت مع 89٪ دولبيكو تعديل النسر المتوسطة (دمم)، 10٪ مصل بقري الجنين (فبس)، و 1٪ البنسلين الستربتومايسين (بس) لوقف عمل التربسين.
    6. تي رانسفر الخليط كله (خلايا في محلول التربسين ووسط الثقافة) إلى أنبوب الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 200 × ز.
    7. إزالة جميع السوائل وإعادة تعليق الخلايا في 1 مل من برنامج تلفزيوني 1X (قيمة الرقم الهيدروجيني: 7.4، قبل ساخنة إلى 37 درجة مئوية).
  2. إعداد العينات (المستزرعة الدقيقة الطحالب)
    1. نقل الطحالب الدقيقة المستزرعة والوسط الثقافي (على سبيل المثال، مياه البحر، أجار، أو المياه العذبة) إلى أنابيب جديدة للزراعة الزجاجية (~ 15 مل) في نسبة حجم (الطحالب الصغيرة إلى الوسط الثقافي) من 1: 5 لإنشاء وهو مركز جديد للثقافة الفرعية.
    2. وضع أنابيب ثقافة الزجاج في غرفة واقية من الغبار تحت إضاءة مستمرة من قبل الإضاءة الاصطناعية من المصابيح الفلورية وفقا لدورة خفيفة / داكنة (لد) (عادة لد 16: 8) لمدة 72 - 120 ساعة قبل التجربة.
    3. نقل العينات شبه مثقف إلى أنبوب الطرد المركزي وتخلط جيدا.

2. أتوم إعداد النظام

gether.within الصفحات = "1"> figure-protocol-1
الشكل 1: تخطيطي لنظام أتوم. يتم استخدام الليزر النبضي ذات النطاق العريض لتوصيل نبضات فائقة السرعة إلى ( أ ) وحدة ذات امتداد زمني و ( ب ) وحدة مكبر للصوت بصرية. وحدة الوقت تمتد يولد قطار من الموجي الزمانية، كل منها هو نسخة طبق الأصل من الطيف الموجي من مصدر الليزر، ( أي، الطول الموجي إلى الوقت رسم الخرائط). وتستخدم وحدة مكبر للصوت لنبض تمتد (التشتت) تعويض الخسارة. وتكون النبضة الممتدة عندئذ ( ج ) مشتتة مكانيا بواسطة مشبك حيود وتشكل إضاءة دش طيفية 1D يتم فيها نقل مكونات الطول الموجي الفردي بواسطة زوج عدسة مرحل وتركزها العدسة الهدف على مواضع مختلفة على الخلية المتدفقة داخل ( d) ) رقاقة ميكروفلويديك. وهذه هي عملية التشفير الطيفي. الفإن الضوء المشفر الطيفي سوف يمر مرة أخرى الخلية من خلال عدسة موضوعية أخرى ومرآة، والعودة إلى صريف الحيود وإعادة التركيب باعتبارها شعاع نابض مكانيا غير مهذب. هذه الحزمة النبضية المشفرة بالصورة هي بعد ذلك ( ه ) مقسمة إلى مسيرين، بحيث يتم الحجب جزئيا للحزم ب ( و ) حافة السكين، ولكن من الاتجاهات المعاكسة، قبل أن يقترن بالألياف. ويمثل هذان الحزمان النقيضين المتناظرين لتدرج الطور للصورة النهائية. وبالنسبة للكشف المتزامن لكل من تناقض الإشارة، يخضع أحد الإشارات ( ز ) لخط تأخير الوقت، بحيث يتم إرسال الإشارات المتعددة (معشق) في الوقت المناسب. ويستخدم فوتوديتكتور عالية السرعة والذبذبات في الوقت الحقيقي للحصول على البيانات. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. الوقت ست وحدة ريتش
    1. استخدام مصدر فيبتو ثانية (فس) أو بيكو ثانية (بس) نابض ليزر مع الطول الموجي مركز الموصى بها في نطاق الأشعة تحت الحمراء القريبة (نير)، 800-1،500 نانومتر.
      مالحظة: ميكن أن يتراوح عرض النبضة املطلوب املطلوب من 100 فرعي فس إىل عدد قليل من بس. ويمكن الاطلاع على المتطلبات التفصيلية لمصادر الليزر النبضي في المراجع 4 و 5. ويبرز الجدول 1 المقاييس الهامة.
      1. تأكد من أن مصدر الليزر لديه معدل تكرار عالية، والتي ينبغي أن تكون في نظام ميغاهرتز (على سبيل المثال، عشرات ميغاهيرتز) لضمان التصوير فائق السرعة في أتوم. أيضا، تعيين ذروة انتاج الطاقة الليزر أقل بكثير من عتبة قوة الضرر تجويف الألياف، ما يقرب من 1 كيلوواط.
      2. ضمان حسن اطلاق النار إلى طلقة والاستقرار الطيفي لمصدر الليزر نابض.
        ملاحظة: ينبغي الاحتفاظ بالتسامح النموذجي في تقلبات السعة الطيفية في حدود 1.2٪ 19 ، 20 ،سس = "كريف"> 21، كما حققها الليزر وضع الليزر مقفل في هذا الإعداد.
        ملاحظة: ومن المتوقع أن يكون 10-100 نانومتر، عرض النطاق الترددي البصري لمصدر الليزر، وهو أمر ضروري لضمان مجال التصوير كافية للعرض (فوف) في التصوير خلية واحدة 21 .
    2. من خلال موازاة الألياف، زوجين شعاع الليزر نابض إلى وضع واحد الألياف البصرية تشتت، والتي يتم امتدت البقول عن طريق تشتت سرعة المجموعة (غفد) ( الشكل 1A ).
      ملاحظة: هذه هي العملية التي يتم بعدها تعيين طيف كل نبضة على شكل نسق موجة موجية طولها الموجة ( أي رسم طول الموجة إلى الوقت).
      ملاحظة: يجب أن يكون إجمالي غفد المطلوب كافيا لضمان عدم تأثر دقة صورة أتوم بشكل عام بعملية رسم الطول الموجي إلى الوقت (انظر المناقشة). عادة، في مجموعة الجرد الوطني، يجب أن يكون غفد أبعد بكثير 0.1 نانومتر / نانومتر. على سبيل المثال، الألياف أحادية النمط المستخدمة في ثيs الحالي يوفر غفد الإجمالي من 0.38 نانومتر / نانومتر حول طول الموجة من 1،060 نانومتر (إجمالي طول الألياف من 10 كم).
  2. وحدة ترميز الطيف
    1. إنشاء نظام المجهر الضوئي لأداء التصوير المشفرة الطيفية من الخلايا التي تتدفق على طول قناة ميكروفلويديك، كما هو موضح في الشكل 1 .
      ملاحظة: المكونات الرئيسية لهذا المجهر الضوئي تشمل: (1) حيود صريف، تلسكوبية تتابع وحدة العدسة (RL1 و RL2 في الشكل 1 )، واثنين من العدسات الموضوعية (Obj1 و Obj2 في الشكل 1 ).
      1. أولا، تضيء شعاع ممدود ومتوازاة على صريف حيود (انتقال من نوع صريف يعمل في هذا الإعداد) لتوليد دش الطيفي ( الشكل 1C ).
        مالحظة: ميكن تعظيم قدرة الحزمة املنتشرة) أي كفاءة االنعراج (عن طريق ضبط tأغلق التوجه صريف إلى التكوين ليترو.
      2. تكوين العدسات التتابع (RL1 و RL2) في نظام التصوير 4-f ( أي وضع صريف الانعراج على المستوى البؤري RL1 وفصل RL1 و RL2 عن طريق مساوية لمجموع أطوالهم البؤرية.الحمام الطيفي ثم يتم تصويرها على ظهر الطائرة البؤرية للعدسة الهدف Obj1).
      3. بعناية محاذاة دش الطيفي لملء الفتحة الخلفية من Obj1، بحيث يمكن أن يكون متوقعا دش الطيفي وتركز على صورة مستوي المجهر.
        ملاحظة: هنا، نا للعدسة الهدف (Obj1 في الشكل 1 ) هو 0.75.
      4. وضع عدسة موضوعية أخرى (Obj2 في الشكل 1 ) مع نا مماثلة ومرآة الطائرة في الفتحة الخلفية من هذه العدسة الهدف (Obj2)، بحيث شعاع دش الطيفي يمكن محاذاة لتمرير مزدوج الطائرة صورة والعودة إلى حيود صريف.
      5. يعدلوالزوج من العدسات الموضوعية (Obj1 و Obj2) بحيث تتداخل طائراتهم التنسيق مع بعضها البعض. تحقق لمعرفة ما إذا كان دش الطيفي يمر مزدوجة طائرة الصورة في نفس الموقع ويعود إلى صريف التالية نفس المسار. إذا لم يكن كذلك، إجراء مزيد من المحاذاة وضبط النظام البصري.
        مالحظة: يجب أن يمر الضوء الذي تم إرجاعه عبر فاصل شعاع إضافي، بحيث يمكن نقل الضوء إلى وحدة كشف غير متماثلة.
      6. ضبط كسب مكبر للصوت البصرية على مستوى مناسب، بحيث يمكن الكشف عن إشارة الناتجة من قبل فوتوديتكتور مع شنر جيدة، والتي هي عادة في> 10 ديسيبل.
      7. مكان وضبط موقف رقاقة ميكروفلويديك على منصة العينة والتأكد من أن دش الطيفي، وبالتالي منطقة التصوير، يتم وضعها عبر قناة ميكروفلويديك ( الشكل 1D ).
        ملاحظة: يضيء دش الطيفي بشكل متعامد إلى اتجاه تدفق فلويديكش داخل مرقاقة إيكروفليديك، بحيث أن الحركة المتدفقة ينفذ تلقائيا ثنائي الأبعاد (2D) بمسح.
  3. وحدة الكشف غير المتماثلة
    1. وضع إضافية شعاع الفاصل لفصل شعاع مشفرة تصوير إلى اثنين ( الشكل 1E ).
      ملاحظة: يتم حظر كل نسخة متماثلة للحزمة جزئيا بواسطة حافة سكين.
    2. قياس وتسجيل الطاقة الضوئية للشعاع قبل كتلة شعاع. ثم، وضع يدويا حواف سكين (التي شنت على مرحلة الترجمة الخطية) بحيث أنها تقف تقريبا نصف شعاع (عن طريق التفتيش البصري). بعد ذلك، استخدم عداد الطاقة الضوئية لمراقبة قوة الشعاع مع ضبط دقيق لحافة السكين عن طريق ترجمتها عبر الحزمة.
      ملاحظة: يقترح أن الوضع الأمثل هو حيث يتم تخفيض الطاقة بنسبة ~ 50٪ من القيمة الأصلية ( أي، حالة أونبلوكد). هذا هو الشرط الذي يوفر أفضل مزيج من إشارة الصورةقوة وتعزيز صورة النقيض من ذلك.
    3. كرر الخطوة 2.3.2 لنسخة متماثلة شعاع آخر. ويلاحظ أن اتجاه كتلة الحزمة الجزئية لحزمة واحدة ينبغي أن يكون عكسيا بالنسبة إلى الحزمة الأخرى ( الشكل 1f ).
    4. زوجين اثنين من عوارض محظورة جزئيا في اثنين من الأسلحة منفصلة، ​​وضع واحد الألياف من خلال موازين الألياف اثنين.
      ملاحظة: واحد من الأسلحة لديه طول إضافي من الألياف، بمثابة خط التأخير القائم على الألياف، لإدخال تأخير الوقت فيما يتعلق طبق الاصل الآخر (بدون تأخير الخط) ( الشكل 1G ). يتم توجيه كلاهما إلى الألياف واحد من قبل مقرنة الألياف قبل الكشف الضوئي. وينبغي أن يكون التأخير الزمني طويلا بما فيه الكفاية بحيث يفصل بين نسختين متماثلتين وقصيرة بما فيه الكفاية لتجنب التداخل الزمني مع شكل الموجة التالي ( أي أن النسختين المتماثلتين دائما مشتبكة زمنيا ومضاعفة زمنيا في ألياف واحدة قبل الكشف ( الشكل 2 أ )).
    5. قبعةتور ورقمنة الإشارات البصرية الكشف مع الذبذبات في الوقت الحقيقي. لاحظ أن عرض النطاق الترددي وبالتالي معدل أخذ العينات من الذبذبات يجب أن يكون مرتفعا بما فيه الكفاية لضمان أنها لا تؤثر على دقة الصورة النهائية (انظر المناقشة).
      ملاحظة: هنا، مع غفد من 0،38 نانومتر / نانومتر، مطلوب عرض النطاق الترددي الاستحواذ الخلفية ومعدل أخذ العينات من> 20 غز و> 40 غسا / ثانية، على التوالي.

3. الإجراءات التجريبية

  1. تحميل العينة
    1. أداء العد الخلايا تحت المجهر مرحلة النقيض التقليدية في عدادة الكريات القياسية.
    2. ضبط كثافة الخلية عن طريق تمييع مع برنامج تلفزيوني 1X (مع مياه الينابيع للطحالب الصغيرة) وتخلط جيدا مع ماصة.
      ملاحظة: التركيز المقترح هو من 10 5 إلى 10 6 خلايا / مل.
    3. جبل رقاقة ميكروفلويديك على منصة عينة من نظام التصوير الضوئي.
      ملاحظة: ميكروفلويديكرقاقة مصنوعة في المقام الأول من بوليديميثيلزيلوكسان (بدمس) ويتم ملفقة باستخدام طريقة طبق الأصل القياسية صب. تم تصميم قناة ميكروفلويديك مع قناة منحنية غير المتماثلة لتوليد تدفق بالقصور الذاتي مع التركيز تأثير، بحيث يمكن للخلايا تتدفق في ملف واحد في قسم التصوير (مع بعد 80 ميكرون × 80 ميكرون (ارتفاع العرض x)) بسرعة عالية .
    4. نقل محلول الخلية المعدلة الكثافة إلى حقنة 10 مل.
    5. ربط الحقنة إلى مدخل رقاقة ميكروفلويديك وأنبوب الطرد المركزي إلى مخرج رقاقة ميكروفلويديك لجمع التخلص منها.
    6. جبل حقنة على مضخة حقنة وتعيين معدل تدفق مناسب لإعطاء الإنتاجية المرغوبة وتجنب فرض قوة القص المفرطة بين الخلايا والقناة.
      ملاحظة: يجب أن تكون السرعة الخطية للعينات ضمن 0.5 و 10 م / ث. لاحظ أنه قبل تسجيل الصورة الفعلية، غالبا ما يكون من الضروري زيادة ضبط النظام، من حيث تعظيمقوة إشارة الصورة وتحسين الصورة مع التركيز من خلال تكرار الخطوات 2.2.1.4-2.2.1.6.

4. الحصول على البيانات

  1. تعيين عدد مناسب من نقاط البيانات ليتم حفظها لكل تجربة. عدد نقاط البيانات التي سيتم حفظها يعتمد على حجم ومعدل تدفق العينات.
    ملاحظة: عادة، يتم تعيين إلى 8-16 مليون نقطة عينة تحت معدل أخذ العينات من 80 غسا / ثانية.
  2. الحصول على وحفظ البيانات في وضع دفعة باستخدام الذبذبات.

5. الخلفية تجهيز

figure-protocol-2
الشكل 2: إعادة بناء أتوم صور من تتبع الوقت المسح خط. ولإعادة بناء صور أتوم مع تباين الامتصاص والتباين التفاضلي (المعزز) لتدرج الطور، تستخرج مجموعتان من النبضات الممتدة زمنيا (انظر النبضات الأرجوانية والأخضر) من( أ ) تتبع شكل الموجة الزمانية المتعدد الإرسال، ثم يتم تقسيمها رقميا ومكدسة لتشكيل ( ب ) صورتين ثنائيتين تظهران النقيضين المتعاكسين لمرحلة التدرج. لاحظ أن هناك حاجة إلى عملية القص لتشكيل ( ج ) الصور خالية من التشويه عن طريق تعويض عن التحول مؤشر فرعي بسبب خطأ جولة في تقدير معدل تكرار الليزر. من خلال طرح ( د ) خط الخام المسح الضوئي من المغلف شدة الطيفية لمصدر الليزر، يمكن إزالة خلفية الصور. ( ز ) يمكن الحصول على صورة تباين الامتصاص من خلال تجميع شدة البكسل لكل بكسل للصور ( ه ) و ( و )، في حين أن ( h ) يمكن الحصول على صورة التباين التفاضلي للمرحلة الطورية من طرح الصور (ه ) و (و). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبرمن هذا الرقم.

  1. نقل البيانات من الذبذبات إلى أجهزة الكمبيوتر لإعادة البناء صورة حاليا.
    ملاحظة: هنا، يتم تخزين البيانات في القرص الصلب المحمولة ونقلها يدويا بين الذبذبات وأجهزة الكمبيوتر معالجة. قدرة القرص الصلب يجب أن يكون أكثر من 500 غيغابايت لكل تجربة.
    1. استخدام روتين إعادة بناء الصورة الرئيسية إلى كومة رقميا خط المسح الضوئي لتشكيل صورة 2D ( الشكل 2 ).
      ملاحظة: البرنامج المخصص (في ماتلاب) ثم ينتج اثنين من الصور الكشف غير المتماثلة عن طريق فصل مجموعتين من البيانات ذات الوقت المتعدد الإرسال (الأرجواني والأخضر الموجي في الشكل 2 ).
      1. الحصول على صورة التباين التفاضلي مرحلة التدرج بطرح شدة اثنين من الصور الكشف غير المتماثلة. يمكن الحصول على صورة التباين الامتصاص عن طريق إضافة اثنين من الصور الكشف غير المتماثلة. انظر الصور المحددة من مسف-7 والطحالب الصغيرة فيالشكل 3 . لاحظ أن ملامح الخلفية من الصور الفردية يجب أولا أن يتم القضاء عليها، وينبغي تطبيع شداتها، قبل جمع الصور وعمليات الطرح.
    2. توليد مكتبة من المعلمات المستمدة من الصور، مثل حجم الخلية، التعميم، وكثافة الامتصاص، وما إلى ذلك لمزيد من التحليل.
  2. إدخال مكتبة البيانات في منصة التصور البيانات ( الشكل 4 ).
    1. تحميل مكتبة من المعلمات والصور التي أعيد بناؤها المقابلة لمنصة واجهة التصور.
    2. تعيين المحاور لتكون المعلمات من الفائدة.
      ملاحظة: المعلمات هي مشكلة محددة ويتم تعريفها من قبل المستخدم. وهي مشتقة من الصور أتوم من قبل برنامج ماتلاب. هنا، كثافة الامتصاص البصرية للخلية، ومنطقة الخلية، وحجم الخلية، وتعميم الخلية المتاحة للاختيار. حدد مجموعة البيانات التي سيتم عرضها، بحيث يمكن تصور كل صورة الخلية كنقطة بيانات مختلفة على مؤامرة مبعثر.
    3. حرك مؤشر الماوس إلى كل نقطة، بحيث تظهر الصورة المقابلة والمعلمات الأخرى في نافذة فرعية عائمة.
      ملاحظة: يمكن تغيير المحاور بين المقاييس الخطية واللوغاريتمية بطريقة تفاعلية.
    4. إجراء مزيد من التحليل لأي مجموعة فرعية من مجموعة البيانات عن طريق التباعد يدويا على مؤامرة مبعثر.
      ملاحظة: الرسم البياني في كل معلمة من مجموعة فرعية مسور يمكن رسمها ضد تلك المكتبة بأكملها. يتم عرض الرسوم البيانية المنفصلة في نافذة فرعية عائمة أخرى.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذا العمل يوضح اثنين من مظاهرات التصوير خلية واحدة من قبل أتوم: واحد مع خلايا الثدييات (الإنسان المحيطية خلايا الدم وحيدات النوى s (بمك) وخلايا سرطان الثدي (مسف-7)) وآخر مع العوالق النباتية s (سينديسموس و كلاميدوموناس). وقد كانت الدافع وراء التجربة الأولى الاهتمام المتزايد في الخزعة السائلة للكشف عن وتعداد وتوصيف الخلايا السرطانية المتداولة في الدم 23 . القدرة على قياس كتس نشرها من مواقع الو...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هناك العديد من التفاصيل الفنية التي تتطلب اهتماما خاصا أثناء إعداد نظام أتوم. أولا، من الضروري أن نلاحظ أن الإضاءة غير المتماثلة / المائلة الطيفية مشفرة يمكن أن تدخل مكونات التدرج المرحلة المتبقية ( أي تأثير التظليل) في التباين الامتصاص والتأثير على تعزيز التباين المرحلة التدرج في أتوم. ولذلك، ينبغي تقليل هذا التأثير من الإضاءة المائلة. وثانيا، ينبغي التشديد على أن مخطط تعدد الإرسال الزمني أو تشذير الوقت الذي يعمل على نسختين متماثلين لا ينتج عنه أي حل وسط كبير على سرعة ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر السيد ب. يونغ لإعداد مسف-7 بالنسبة لنا. وقد حظي هذا العمل بدعم جزئي من المنح المقدمة من مجلس منح البحوث لمنطقة هونغ كونغ الإدارية الخاصة في الصين (مشروع رقم 17259316 و 17207715 و 17207714 و 17205215 و هكو 720112E) وبرنامج دعم الابتكار والتكنولوجيا إيتس / 090/14 )، وصندوق تنمية الجامعة من جامعة هونج كونج.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أهداف فسيولوجيا الفلوريت من نيكون 40Xنيكون MRF07420الموضوعية (Obj2)
الفلوريت لخطة أوليمبوس ، 0.75 NA ، 0.51 مم WD ، 40XOlympusRMS40X-PFعدسة موضوعية (Obj1)
N-BK7 عدسات بلانو محدبةThorlabsLA1145-Cلترحيل الدش الطيفي
FC / APC حزمة موازاة الأليافThorlabsF220APC-1064لإخراج وجمع نبضات الليزر
Pellicle beamsplitterThorlabsBP145B3لصنع نسخة طبق الأصل من
الشعاع مرآة فضية محميةThorlabsPF10-03-P01لعكس الضوء
800-1650nm 12 جيجا هرتز أحادي الوضع مقترن بالتيار المستمر NIR جهاز استقبال ضوئينيوبورت1544-Bلتحويل الضوء إلى إشارة
كهربائية راسم الذبذبات عالي الأداء InfiniiumAgilentDSOX91604Aلحفظ الإشارات الكهربائية المحولة بالضوء
HI1060 الألياف الضوئيةCorningHI1060الألياف الضوئية لتمديد الوقت
YTTERBIUM DOPED FIBER AMPLIFIERKEOPSYSKPS-STD-BT-YFA-37-BO-SM-111-FA-FAمكبر للصوت البصري في الخط
صريفWasatch Photonics020305-6صريف
حقنة / سحب مضخاتهارفارد جهازPHD 2000مضخة حقنة لتحميل العينات في قنوات الموائع الدقيقة
عدسة هدف

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lau, A. K. S., Wong, T. T. W., Shum, H. C., Wong, K. K. Y., Tsia, K. K. Imaging Flow Cytometry: Methods and Protocols. Barteneva, N. S., Vorobjev, I. A. , Springer New York. New York, NY. 23-45 (2016).
  2. Goda, K., Tsia, K. K., Jalali, B. Serial time-encoded amplified imaging for real-time observation of fast dynamic phenomena. Nature. 458 (7242), 1145-1149 (2009).
  3. Goda, K., Jalali, B. Dispersive Fourier transformation for fast continuous single-shot measurements. Nat Photon. 7 (2), 102-112 (2013).
  4. Lau, A. K., Shum, H. C., Wong, K. K., Tsia, K. K. Optofluidic time-stretch imaging - an emerging tool for high-throughput imaging flow cytometry. Lab Chip. 16 (10), 1743-1756 (2016).
  5. Lau, A. K. S., Tang, A. H. L., Xu, J., Wong, X. W., Y, K. K., Tsia, K. K. Optical Time Stretch for High-Speed and High-Throughput Imaging - From Single-Cell to Tissue-Wide Scales. IEEE J. Sel. Top. in Quant. Electron. 22 (4), (2016).
  6. Lei, C., Guo, B., Cheng, Z., Goda, K. Optical time-stretch imaging: Principles and applications. Appl Phys Rev. 3 (1), 011102(2016).
  7. Lei, C., Guo, B., Cheng, Z., Goda, K. Optical time-stretch imaging: Principles and applications. Applied Physics Reviews. 3 (011102), (2016).
  8. Goda, K., et al. High-throughput single-microparticle imaging flow analyzer. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (29), 11630-11635 (2012).
  9. Goda, K., Solli, D. R., Tsia, K. K., Jalali, B. Theory of amplified dispersive Fourier transformation. Physical Review A. 80 (4), 043821(2009).
  10. Goda, K., et al. High-throughput single-microparticle imaging flow analyzer. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (29), 11630-11635 (2012).
  11. Lai, Q. T. K., et al. High-throughput time-stretch imaging flow cytometry for multi-class classification of phytoplankton. Opt. Express. 24 (25), 28170-28184 (2016).
  12. Chen, C. L., et al. Deep Learning in Label-free Cell Classification. Sci Rep. 6, 21471(2016).
  13. Fard, A. M., et al. Nomarski serial time-encoded amplified microscopy for high-speed contrast-enhanced imaging of transparent media. Biomed Opt Express. 2 (12), 3387-3392 (2011).
  14. Lau, A. K., et al. Interferometric time-stretch microscopy for ultrafast quantitative cellular and tissue imaging at 1 mum. J Biomed Opt. 19 (7), 76001(2014).
  15. Mahjoubfar, A., Chen, C., Niazi, K. R., Rabizadeh, S., Jalali, B. Label-free high-throughput cell screening in flow. Biomed Opt Express. 4 (9), 1618-1625 (2013).
  16. Wong, T. T., et al. Asymmetric-detection time-stretch optical microscopy (ATOM) for ultrafast high-contrast cellular imaging in flow. Sci Rep. 4, 3656(2014).
  17. Mata, T. M., Martins, A. A., Caetano, N. S. Microalgae for biodiesel production and other applications: A review. Renew Sustainable Energy Rev. 14 (1), 217-232 (2010).
  18. Irigoien, X., Huisman, J., Harris, R. P. Global biodiversity patterns of marine phytoplankton and zooplankton. Nature. 429 (6994), 863-867 (2004).
  19. Wei, X., et al. Coherent Laser Source for High Frame-Rate Optical Time-Stretch Microscopy at 1.0 µm. IEEE J. Sel. Top. Quantum Electron. 20 (5), 384-389 (2014).
  20. Wei, X., et al. Breathing laser as an inertia-free swept source for high-quality ultrafast optical bioimaging. Opt. Lett. 39 (23), 6593-6596 (2014).
  21. Xu, Y., Wei, X., Ren, Z., Wong, K. K. Y., Tsia, K. K. Ultrafast measurements of optical spectral coherence by single-shot time-stretch interferometry. Sci Rep. 6, 27937(2016).
  22. Tsia, K. K., Goda, K., Capewell, D., Jalali, B. Performance of serial time-encoded amplified microscope. Opt. Express. 18 (10), 10016-10028 (2010).
  23. Alix-Panabières, C., Pantel, K. Challenges in circulating tumour cell research. Nat Rev Cancer. 14 (9), 623-631 (2014).
  24. Kling, J. Beyond counting tumor cells. Nat Biotech. 30 (7), 578-580 (2012).
  25. Hodgkinson, C. L., et al. Tumorigenicity and genetic profiling of circulating tumor cells in small-cell lung cancer. Nat Med. 20 (8), 897-903 (2014).
  26. Ozkumur, E., et al. Inertial focusing for tumor antigen-dependent and -independent sorting of rare circulating tumor cells. Sci Transl Med. 5 (179), (2013).
  27. Hou, H. W., et al. Isolation and retrieval of circulating tumor cells using centrifugal forces. Scientific Reports. 3, 1259(2013).
  28. Karabacak, N. M., et al. marker-free isolation of circulating tumor cells from blood samples. Nat. Protocols. 9 (3), 694-710 (2014).
  29. Krebs, M. G., et al. Molecular analysis of circulating tumour cells-biology and biomarkers. Nat Rev Clin Oncol. 11 (3), 129-144 (2014).
  30. Wu, J., et al. Ultrafast Laser-Scanning Time-Stretch Imaging at Visible Wavelengths. Light Sci Appl. , (2016).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Asymmetric detection Time stretch Optical MicroscopyMicrofluidic Imaging Flow CytometryLabel free High contrast ImagingSingle cell ImagingUltra fast Image CaptureSubcellular Resolution AnalysisTime stretch ImagingOptical Frontend SetupData Processing VisualizationBiophysical Phenotyping Cells

مقالات ذات صلة