مقالة منهجية

طريقة عزل رواية الصف سريرية للكلى البشرية ارتشاح الخلايا اللحمية

8.6K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/55841

⸱

أغسطس 7, 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Internal Medicine, Leiden University Medical Centre

في هذه المقالة

ملخص

نقدم هنا طريقة العزلة والثقافة رواية الصف سريرية للكلى "ارتشاح الخلايا اللحمية" (كبسكس) استناداً إلى نضح الجهاز كله مع إنزيمات الجهاز الهضمي، وتخصيب اليورانيوم في NG2-الخلية. بهذه الطريقة، من الممكن الحصول على إعداد كافية من الخلايا للعلاج.

الملخص

الخلايا الوسيطة Stromal (MSCs) هي التماثل الساكن ومحصنة ضد مودولاتوري خلايا الأنسجة التي أظهرت آثار مفيدة في أمراض الكلي وزرع الأعضاء. مشاركة "ارتشاح الخلايا اللحمية" (PSCs) الخصائص مع نخاع العظام MSCs (bmMSCs). ومع ذلك، أيضا لديهم، على الأرجح نظراً لطابعة محلية، والخصائص الخاصة بالانسجة وتلعب دوراً في التوازن الأنسجة المحلية. قد يؤدي هذا التحديد الأنسجة في إصلاح الأنسجة محددة، وأيضا داخل الكلي البشرية. أظهرنا سابقا أن PSCs الكلي البشرية (كبسكس) قد عززت الكلي الظهارية الجرح الشفاء حين بمسكس لم تكن هذه الإمكانية. وعلاوة على ذلك، يمكن تحسين كبسكس إصابة الكلي في الجسم الحي. ولذلك، كبسكس تشكل مصدرا لاهتمام للعلاج بالخلايا، خاصة بالنسبة لأمراض الكلي وزراعة الكلي. هنا نعرض تفصيلاً طريقة العزلة والثقافة كبسكس من الصف زرع الكلي البشرية استناداً إلى نضح الجهاز الجامع للإنزيمات الهضمية عبر الشريان الكلوي وإثراء لعلامة ارتشاح في NG2. وبهذه الطريقة، يمكن الحصول كميات كبيرة الخلية التي تصلح للعلاج.

المقدمة

الخلايا الوسيطة Stromal (MSCs) هي الخلايا المناعية مودولاتوري التي كانت أصلاً المعزولة من نخاع العظام. أنها تتميز المغزل بها تتشكل مورفولوجيا، القدرة على التفريق في الدهون والعظام والغضاريف والتقيد البلاستيك. أعرب MSCs عن علامات stromal CD73، CD90، CD105 حين يجري سلبية بالنسبة لعلامات CD31 و CD451،،من23. MSCs مرشح واعدة لخلية العلاج نظراً للتماثل الساكن الأنسجة وقدرات إيمونومودولاتوري. وتجري حاليا دراسة بمسكس في التجارب السريرية للعديد من الأمراض، بما في ذلك أمراض الكلي وزراعة الكلي كما استعرضت في أماكن أخرى4.

سابقا قد اتضح أن ارتشاح الخلايا من عدة أجهزة صلبة مختلفة، بما في ذلك الأنسجة الدهنية، والمشيمة، والهيكل العظمى والعضلات مشاركة الخصائص مع MSCs9. ومع ذلك، يحمل هذه الخلايا أيضا المهام الخاصة بالانسجة التي يمكن أن تسفر عن إصلاح أورجانوتيبيك10. على سبيل المثال، الخلايا البشرية ارتشاح احتشاء عضلة القلب، وتحفز استجابات الأوعية بعد نقص ومتباينة في cardiomyocytes، بينما ارتشاح الخلايا المعزولة من الأنسجة الأخرى لم تظهر هذه الإمكانات11.

يمكن أيضا أن الخلايا اللحمية ارتشاح معزولة من الماوس12،،من1314 والكلى البشرية15،16. ونحن على نطاق واسع يتسم كبسكس ومقارنة هذه إلى بمسكس. وجدنا أن كبسكس، شبيه بمسكس، تتمتع بقدرات كآبته، ويمكن أن تدعم تشكيل ضفيرة الأوعية الدموية. ومع ذلك، هناك الأنسجة توجد بعض الاختلافات بين أنواع الخلايا، كما أظهر توقيع تعبير النسخي أورجانوتيبيك، بما في ذلك عوامل النسخ نيفروجينيك HoxD10 و HoxD11 كبسكس. لم تطرأ التحول أرومية بعد التحفيز مع TGF-β كبسكس، وعلى النقيض من بمسكس، ولم يتمكنوا من التفريق في adipocytes. وعلاوة على ذلك، تسارع كبسكس سلامة الظهارية في جرح الظهارية أنبوبي كلوي مقايسة الصفر، ظاهرة التي لم يلاحظ مع بمسكس. هذا الجرح تعزيز إصلاح تمت بوساطة من خلال الإفراج عن عامل النمو تتمثل. وعلاوة على ذلك، تحسنت كبسكس إصابة الكلي في طراز ماوس كلوي حاد إصابة15. ولذلك، يبدو أن لديها قدرات متفوقة الكلوي إصلاح كبسكس وهي مصدر جديدة مثيرة لاهتمام لعلاج الخلايا في أمراض الكلي.

ولكي تكون قادراً على استخدام كبسكس لأغراض العلاج الخليوي، ينبغي أن تكون معزولة كبسكس بطريقة الصف سريرية مع الإنزيمات السريرية الصف والبروتوكولات. وعلاوة على ذلك، أن تكون قادرة على علاج العديد من المرضى مع كبسكس من المانحين 1، إعداد كافية من الخلايا ينبغي الحصول على. هنا نعرض بالتفصيل، إجراءات عزل الصف السريرية كبسكس من الصف كله زرع الكلي، مما أسفر عن إعداد كافية من الخلايا التي سيتم استخدامها للعلاج السريري.

البروتوكول

وافقت اللجنة الأخلاقية الطبية المحلية والمجلس الاستشاري الأخلاقي للاتحاد الأوروبي (STELLAR) على البحث وجمع الكلى ذات الدرجة الزرع البشري التي يتم التخلص منها بشكل أساسي لأسباب جراحية. تم منح الموافقة البحثية لجميع الكلى.

< p class = "jove_title" >1. الاستعدادات لزراعة الخلايا

  1. تحضير بركة من الصفائح الدموية.
    1. قم بتخزين الصفائح الدموية التي انتهت صلاحيتها لمدة تقل عن 2 د في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام (لمدة أقصاها 1 سنة).
      ملاحظة: تم الحصول على الصفائح الدموية في الأصل من بائع تجاري. وتم الحصول على فائض من المواد التي وزعها بنك الدم المحلي.
    2. قم بإذابة الصفائح الدموية لما لا يقل عن 5 متبرعين (يفضل 10) O / N عند 4 درجات مئوية.
    3. قم بتجميع الصفائح الدموية في زجاجة معقمة كبيرة ، وانقلها إلى أنابيب الطرد المركزي المخروطية الشكل وقم بالدوران لأسفل لمدة 10 دقائق عند 1,960 × جم عند 4 درجات مئوية
      ملاحظة: يعتمد حجم الصفائح الدموية على عدد المتبرعين وكمية المواد الفائضة في المستشفى لكل متبرع.
    4. ماصة المادة الطافية إلى أكياس الدم (50 مل / كيس) من خلال برميل حقنة سعة 50 مل. يحفظ في درجة حرارة -80 درجة مئوية.
  2. تحضير وسط زراعة الخلايا.
      قم
    1. بإذابة كيس واحد من الصفائح الدموية في حمام مائي عند 37 درجة مئوية.
    2. أضف 1 لتر (أي زجاجتان) من الحد الأدنى من المتوسط الأساسي - تعديل ألفا (alphaMEM) ، و 5 مل 200 ملي من الجلوتامين ، و 20 مل من البنسلين (5,000 وحدة / مل) / ستربتومايسين (5,000 ميكروغرام / مل) (قلم / بكتيريا) إلى الكيس.
    3. احتضان لمدة 3 ساعات عند 37 درجة مئوية.
    4. رج الكيس لإزالة الجلس عن طريق النقر برفق على الكيس عندما يكون الكيس مستقرا على سطح مستو.
    5. قم بتصفية وسط محللات الصفائح الدموية بنسبة 5٪ عن طريق سحب المحللات عبر مرشح نظام نقل الدم باستخدام حقنة معقمة سعة 50 مل.
    6. ينقل الوسط في أنابيب سعة 50 مل ويخزن في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
      ملاحظة: يتم اختبار كل دفعة جديدة من محللات الصفائح الدموية في زراعة الخلايا ومقارنتها بالدفعة السابقة عن طريق زراعة الخلايا ذات الأهمية (bmMSCs أو kPSCs) إلى التقاء في كلتا الدفعتين. في أعداد الخلايا وقابليتها للحياة ، يجب ألا تختلف kPSCs أو bmMCs المزروعة في الدفعة الجديدة بأكثر من 10٪ ، ويجب ألا يختلف التعبير عن علامة CD73 و CD90 و CD105 و CD31 و CD34 و CD45 كما تم تحليلها بواسطة قياس التدفق الخلوي. يتم وصف طرق زراعة الخلايا في القسم 6 من البروتوكول (زراعة kPSC).
< p class = "jove_title" >2. الاستعدادات لحصاد الخلايا

  1. تحضير الحلول.
    1. قم بإعداد الوسط العادي عن طريق إضافة 10 مل من القلم / البكتيريا إلى 500 مل (زجاجة واحدة) من الحد الأدنى من الوسط الأساسي الأدنى (DMEM) -F12 من Dulbecco.
    2. تحضير وسط الغسيل بإضافة 50 مل من المصل البشري العادي (NHS) و 10 مل من القلم / البكتيريا العقدية إلى زجاجة واحدة من DMEM-F12.
    3. قم بإعداد المخزن المؤقت لمخزون الإنزيم عن طريق إضافة 2.9 مل 1 م 4- (2-هيدروكسي إيثيل) -1-بيبرازين إيثان سلفونيك حمض (HEPES) ، 1.2 مل NaHCO3 2.5٪ [وزن / حجم] و 160 ميكرولتر CaCl2 (1 م) إلى 160 مل محلول جامعة ويسكونسن.
    4. قم بإعداد محلول الكولاجيناز عن طريق إضافة 20 مل ببطء من مخزن مخزون الإنزيم إلى زجاجة الكولاجيناز بدرجة GMP التي تحتوي على >2,000 U / زجاجة كولاجيناز. تذوب عند 4 درجات مئوية لمدة 40 دقيقة تقريبا. رج العبوة برفق عدة مرات خلال فترة الذوبان.
    5. قم بإعداد وسط التجميد بإضافة 5 مل من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) إلى 45 مل NHS.
  2. تحضير صينية التروية (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 1أ).
    1. نظف كابينة التدفق وقم بتغطيتها بالستائر الجراحية. قم بتسخين حمام مائي إلى حوالي 40-45 درجة مئوية لتسخين صينية التروية إلى 37 درجة مئوية. ارتد العباءات الجراحية والقفازات الجراحية.
    2. قم بتوصيل صينية التروية المعقمة بالحمام المائي لتسخين صينية التروية بالماء الدافئ. تأكد من عدم وجود هواء في صينية التروية من خلال البدء بصينية التروية في الوضع الرأسي. إذا لزم الأمر ، أضف المزيد من الماء إلى الحمام المائي لمنع ضخ الهواء في صينية التروية.
    3. ضع أنبوب LS25 في المضخة. اترك طرفي الأنبوب المعقمين في خزانة التدفق. ضع ملقط Kocher على أحد طرفي الأنبوب واتركه يرتاح في قاع صينية التروية. ضع شاشا معقما فوق الأنبوب لمنع الانسداد. قم بتوصيل موصل Luer في طرف الأنبوب الآخر.
    4. أضف ما يقرب من 100 مل من الوسط العادي في صينية التروية وابدأ في شطف الأنبوب بسرعة مضخة تبلغ 100 مل / دقيقة.
< p class = "jove_title" >3. عزل خلايا الكلى

  1. تحضير الكلى.
    1. أخرجي الكلية من الأكياس المعقمة المزدوجة وضعيها على صينية التروية المعقمة (<فئة قوية = "xfig">الشكل 1ب). قم بإزالة الأنسجة الدهنية حول الكلى وكبسولة الكلى بالمقص والتمزق اللطيف (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 1ج) وتحديد الشريان الكلوي على رقعة الأبهر كما هو موضح في <فئة قوية = "xfig" >الشكل 1د.
    2. قم بتسلية الشريان الكلوي باستخدام مسمار الملحق، وقم بإصلاحه باستخدام تمزق معقم للعنف، وقم بتوصيله بنهاية أنبوب المضخة بموصل Luer أثناء تشغيل المضخة. إذا لم تكن الأنابيب ممتلئة بالكامل ، فقم أولا بإضافة المزيد من الوسائط إلى الدرج وأنابيب التدفق عن طريق بدء تشغيل المضخة (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 1E - F). اغسل الكلى بوسط عادي عبر المضخة بتدفق 100 مل / دقيقة.
  2. علاج الكولاجيناز وعزل خلايا الكلى.
    1. أضف الكولاجيناز (20 مل ، >2,000 U) و DNase (2.5 مل ، 1 مجم / مل) إلى صينية التروية (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 1ز). اقلب الكلى من وقت لآخر برفق باليد. انتظر حتى تصبح الكلية طرية ويصبح سائل التروية أقل شفافية (حوالي 30-40 دقيقة).
    2. قم بتدليك الكلية برفق (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 1H) حتى يتم الحصول على تعليق الخلية (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 1I). إزالة المواد غير المهضومة والارتفاع في الشريان الكلوي.
  3. غسل وجمع خلايا الكلى.
    1. أضف 50 مل من NHS إلى تعليق الخلية. قم بتصريف تعليق الخلية من صينية التروية عن طريق وضع المضخة في تدفق منخفض ووضع الأنبوب المتصل أولا بالكلية فوق أنابيب 50 مل (<فئة قوية = "xfig">الشكل 1ي).
    2. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 7 دقائق عند 4 درجات مئوية وإزالة المادة الطافية. اغسل الكريات بوسط غسيل يحتوي على 10٪ NHS ومرة أخرى جهاز طرد مركزي على 300 × جم لمدة 7 دقائق. كرر الغسيل مرة أخرى. قم بقياس حجم كريات الخلية وأضف حجما متساويا من وسط زراعة الخلايا.
    3. إما أن تحافظ على الخلايا بالتبريد من هنا عن طريق إضافة وسط التجميد 1: 1 إلى تعليق الخلية وتخزينها في قوارير مبردة وفقا للبروتوكولات القياسية ، أو الاستمرار في زراعة الخلايا (القسم 4).
      ملاحظة: يحتوي تعليق الخلية على كتل خلوية ويتطلب خطوات إضافية للحصول على خلايا مفردة ، مما يؤدي إلى زيادة موت الخلايا. لذلك ، يتم الاحتفاظ بالخلايا في حالة تعليق ولا يتم احتسابها في هذه المرحلة.
فئة

4. ثقافة خلايا الكلى الخام

  1. أضف ما يقرب من 1 مل من تعليق الخلية إلى 24 مل من محللات الصفائح الدموية alphaMEM 5٪ (وسط زراعة الخلية) في قارورة ثقافة خلية T175 (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 1K) والثقافة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2. قم بإزالة الوسط وحطام الخلية بعد 2 د من الخلايا الملتصقة وقم بتحديث الوسط ب 25 مل من وسط زراعة الخلايا.
  2. قم بتحديث وسط المزرعة مرتين في الأسبوع عن طريق إزالة نصف الوسط (12.5 مل) وإضافة وسط طازج (12.5 مل) باستخدام تقنيات معقمة.
  3. الثقافة حتى التقاء (عادة 5-7 د) (<فئة قوية = "xfig">الشكل 1لتر). قم بإزالة الوسط ، واغسله مرتين باستخدام PBS وقم بتربسين الخلايا عن طريق إضافة 5 مل من التربسين إلى كل قارورة T175 لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
< p class = "jove_title" >5. تخصيب الخلايا ل NG2 عن طريق فصل الخلايا المغناطيسية (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 1م)

  1. قم بإعداد المخزن المؤقت لفصل الخلايا وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
  2. أعد تعليق kPSCs التربسينية في المخزن المؤقت لفصل الخلايا سعة 10 مل. جهاز الطرد المركزي عند 490 × جم لمدة 5 دقائق ، تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في مخزن مؤقت لفصل الخلايا 300 ميكرولتر.
  3. أضف 100 ميكرولتر من حجب FcR من الريجين / 5 × 107 خلايا ، وأضف 100 ميكرولتر من حبيبات مضادة للورم الميلانيني (NG2) لكل 5 × 107 خلايا ، واحتضانها لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية. افصل الكسر الموجب NG2 وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. أضف 10 مل من خلايا الطرد المركزي المتوسطة لمدة 5 دقائق عند 490 × جم.
  4. عد الخلايا باستخدام غرفة عد Bürker وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. بذر الخلايا في قارورة مزرعة (حوالي 4 × 103 خلايا / سم2) واحتضنها.
    ملاحظة: قم بزرع الخلايا بالتركيزات التالية: <250.000 في قارورة T25 ، و 250.000 - 500.000 في قارورة T75 ، و 700.000 - 800.000 في قارورة T175. بعد تخصيب الخلية المغناطيسية ، يتم عزل جزء موجب من حوالي 1 - 2٪. ومع ذلك ، نظرا لأن هذه الخطوة هي تخصيب الخلايا وليس فرز الخلايا ، فستكون أنواع الخلايا الأخرى موجودة في الثقافة (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 1N). بعد عدة مقاطع (عادة حوالي 4 - 5) ، يوجد فقط مجموعة متجانسة من kPSC (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 1ص).

6. ثقافة kPSCs

  1. قم بتحديث الوسط مرتين في الأسبوع عن طريق إزالة نصف الوسط واستبداله بوسط ثقافة مذاب حديثا (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 1N).
    ملاحظة: تميل kPSCs إلى أن تكون أكثر قابلية للتطبيق والتكاثر عندما يتم تحديث نصف الوسيط فقط.
  2. مرور kPSCs.
    ملاحظة: قم بتمرير kPSCs إما عند التقاء 90 - 100٪ ، أو عند ظهور هياكل ثلاثية الأبعاد (انظر <فئة قوية = "xfig" >الشكل 1O) ، أو عندما لا يكون هناك نمو للخلايا لأكثر من أسبوع. قد يحدث الأخيران بشكل خاص في الممرات المبكرة بعد تخصيب الخلايا. في هذه الحالة ، بعد المرور ، ستبدأ الخلايا عادة في النمو مرة أخرى في ثقافة أحادية الطبقة (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 1P).
    1. قم بإزالة الوسيط من الخلايا المتقاربة بنسبة 90 - 100٪ (احتفظ بالوسيط لاستخدامه لاحقا). اغسل القارورة مرتين باستخدام PBS (1 مل في T25 ، 5 مل في T75 ، 10 مل في T175). أضف التربسين (0.5 مل في T25 ، 2 مل في T75 ، 5 مل في T175) واحتضنه لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية. أضف الوسط القديم إلى القارورة وأعد تعليقه برفق.
    2. انقله إلى أنبوب سعة 15 أو 50 مل (حسب الحجم) وجهاز الطرد المركزي عند 490 × جم لمدة 5 دقائق. عد الخلايا واللوحة القابلة للحياة <250.000 في T25 ، أو 250.000 - 500.000 في T75 ، أو 700.000 - 800.000 في T175 (حوالي 4 × 103 خلايا / سم2).
  3. اختبر kPSCs عند الممر 5 أو 6 (على سبيل المثال ، مقايسة الخدش ، القسم 7).
    ملاحظة: قم بتمييز الخلايا المنتشرة عن طريق قياس التدفق الخلوي باستخدام البروتوكولات القياسية. يجب أن يكون التعبير عن العلامة ل NG2 و PDGFR-β و CD146 و CD73 و CD90 و CD105 و HLA-ABC موجبا ويجب أن يكون CD31 و CD34 و CD45 و HLA-DR سالبا. اختبار الميكوبلازما والبكتيريا والفطريات في وسط الاستزراع وفقا للبروتوكولات القياسية لمختبر علم الأحياء الدقيقة السريري. اختبر kPSCs وظيفيا في مقايسة خدش الجرح الظهاري في الكلى. عادة ما يتم إجراء التجارب مع مجموعات kPSC متجانسة معقمة ومؤكدة لقياس التدفق الخلوي مع قدرة التئام الجروح بين الممر 6-8.
  4. قم بالحفاظ على kPSCs بالتبريد عن طريق إضافة 0.5 مل من وسط الحفظ بالتبريد إلى 0.5 مل من معلق الخلية (2 مليون خلية لكل مل من وسط الاستزراع) باستخدام البروتوكولات القياسية.
    ملاحظة: بعد الذوبان ، قم بزرع kPSCs بكثافة أعلى (106 خلايا في T175).

7. الاختبار الوظيفي ل kPSCs: فحص خدش الجرح الظهاري الكلوي

  1. استزراع kPSCs في صفيحة 6 آبار بكثافة 200,000 خلية / بئر في وسط استزراع 2 مل. بعد 48 [ه] من ثقافة عند 37 [ك], 5٪ [ك]2, يجمع الطاف. هذا هو الوسيط المكيف.
  2. بذر HK-2 (الخلايا الظهارية الأنبوبية القريبة) < فئة sup = "xref" >17 في 2 مل من وسط الخلية الظهارية الأنبوبية القريبة (PTEC) الذي يتكون من نسبة 1: 1 من DMEM-F12 مكملا بالأنسولين (5 مجم / مل) ، ترانسفيرين (5 مجم / مل) ، السيلينيوم (5 نانوغرام / مل) ، الهيدروكورتيزون (36 نانوغرام / مل) ، ثلاثي يودوثيرينين (40 بيكوغرام / مل) ، عامل نمو البشرة (10 نانوغرام / مل) والقلم / البكتيريا العقدية ، بكثافة 500,000 خلية لكل بئر في صفيحة زراعة خلايا مكونة من 6 آبار.
  3. استزراع لمدة 48 ساعة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2. قم بإزالة وسط زراعة الخلايا في HK-2s وقم بإنشاء جرح خدش في الطبقة الأحادية من HK-2s عن طريق عمل خدش بطرف نقطة ماصة صفراء من أعلى إلى أسفل البئر. اغسل HK-2s باستخدام PBS وأضف الوسط المكيف ل kPSCs أو وسيط التحكم. ضع علامة على الجزء السفلي من اللوحة على المنطقة المراد تصويرها.
    ملاحظة: يجب أن تكون HK-2s متقاربة. صور منطقتين لكل بئر.
  4. قم بتصوير الخدش في 4 و 8 و 12 و 24 ساعة في نفس الموضع المحدد باستخدام مجهر المجال الساطع المقلوب.
  5. قم بقياس منطقة الخدش في الصورة J باستخدام أداة تحديد المضلع لتحديد النسبة المئوية للإغلاق.

النتائج

ويرد في الشكل 1طريقة العزل كبسكس الصف السريرية. خلايا الكلي الخام معزولة عن زرع الأعضاء البشرية الصف الكليتين نضح كولاجيناز. هو مثقف تعليق الخلية الناتجة حتى روافد في ليساتيس الصفائح الدموية 5%. ثم الكسر الخلية اللحمية ارتشاح يتم عزل استناداً إلى التعبير في NG2.

كبسكس بلاستيكية ملتصقة على شكل المغزل الخلايا (الشكل 2ألف) وهي إيجابية لعلامات علامات stromal CD73، CD90، CD105، وارتشاح NG2، بدجفر-ب و CD146، بينما السلبية ل CD31، CD34، CD45 وهلا-الدكتور (الشكل 2ب). عادة، يمكن التوصل إلى عدد سكان متجانسة من كبسكس في ممر 4 وتصل كبسكس إلى الشيخوخة حول مرور 9-10 (الشكل 2-ج). ولذلك فإننا ننصح بالقيام بتجارب بين سن 5-8.

لتقييم القدرة الوظيفية كبسكس معزولة، نحن إجراء في المختبر الكلي الظهارية الجرح الصفر مقايسة على كل دفعة جديدة من كبسكس، كما أظهرنا سابقا أن المتوسط مكيفة من كبسكس يمكن أن يسرع في التئام الظهارية في هذا التحليل الصفر15. المتوسط كبسك مكيفة باستزراع كبسكس عن 48 ساعة في الفاميم 5% ليساتيس الصفائح الدموية وجمع المادة طافية. المقبل، هي استزراع الخلايا الظهارية (هونج كونج-2) أنبوب الدانية مخلدة الكلي البشرية17 حتى روافد وثم يتم إجراء جرح الصفر. ثم أما المتوسطة مكيفة من متوسطة كبسكس أو عنصر تحكم إضافة إلى الآبار وتقاس سرعة التئام الجروح. عندما تتم إضافة وسيلة مكيفة كبسكس، يغلق الجرح أسرع بشكل ملحوظ (الشكل 2د).

figure-results-1
الشكل 1 : كبسكس "السريرية الصف العزل أسلوب الإنسان". زرع الكلي الصف مقني و perfused مع كولاجيناز عبر الشريان الكلوي (أ-ز) وتعليق الخلية الناتجة يتم غسلها وأما cryopreserved أو وضع في الثقافة (ح-ك). بعد إلى الخلايا كونفلوينسي (L)، أداء NG2 تخصيب خلية (M). الخلايا هي تريبسينيزيد عندما يكونون في متموجة، أما توقفت عن آخذة في التكاثر أو عند ظهور هياكل ثلاثية الأبعاد (N-P). معايير الإفراج عن كبسكس بالعقم وعلامة التعبير والقدرة على تعزيز الظهارية أنبوبي التئام الجروح (Q). السهم: شريان كلوي. شريط المقياس = 200 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

figure-results-2
الشكل 2: كبسكس "توصيف للبشرية". ) كبسكس خلايا ملتصقة على شكل عمود الدوران، والبلاستيك. كبسكس ب) إيجابية بالنسبة لعلامات mesenchymal CD73، CD90، CD105، وعلامات ارتشاح NG2، بدجفر-β و CD146، بينما السلبية CD31 و CD34 و CD45. كبسكس التعبير عن الطبقة MHC أنا (هلا-ABC) ولكن ليس من الدرجة الثانية (هلا-د). ج) خصائص النمو من ثلاث جهات مانحة مختلفة كبسك من التدفق الخلوي وأكد متجانسة السكان إيجابية NG2 (في سن 4). كبسكس تصل إلى الشيخوخة حول مرور 9-10. كبسكس د) قادرين على تعزيز إصلاح الكلي الظهارية في مقايسة الصفر جرح. صور الممثل التحكم المتوسطة والمتوسطة كبسك مكيفة في t = 0، 4، 8 وتظهر ح 12. مقياس بار في A) = 200 مليميكرون، د) = 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

المناقشة

ارتشاح خلايا تم عزلها من كثير من البشرية الصلبة الأجهزة المختلفة، بما في ذلك البنكرياس والدهون والغضاريف والكلى9،،من1516. ومع ذلك، معظم الأساليب، تستند إلى عينات صغيرة من الأنسجة، والتي يتم تشريح وبعدها تعامل مع إنزيمات الجهاز الهضمي. وعلاوة على ذلك، وهذا عادة ما لا يتم مع منتجات الصف السريرية. وهذا يجعل من هذه الاستراتيجيات أقل ملاءمة للترجمة السريرية المباشرة يلزم فيها كميات كبيرة من خلايا الصف السريرية.

هنا نعرض طريقة عزل رواية كبسكس البشرية للأجهزة كلها تستند إلى التروية مع الإنزيمات السريرية الصف والمواد. البروتوكول مقتبس من البروتوكول العزلة السريرية جزر لانجرهانز حاليا في استخدام التطبيق السريري في المركز لدينا18.

هذا هو الأسلوب الصف السريرية الأولى التي يمكن أن يتحقق فيها كميات كبيرة من كبسكس. التغير في العائد خلية هو إلى حد كبير من المانحين التابعة. ومع ذلك، عندما يتم استقراء العائد الخلية نحصل حاليا من جزء صغير من تعليق خلية النفط الخام من ثلاث جهات مانحة مختلفة، من الناحية النظرية، يمكن تحقيق متوسط إنتاج 2.7 × 1012 كبسكس كل الجهات المانحة. كما ماجستير العلاج يتكون عادة من دفعات الخلية 2 مع 1-2 × 106 خلايا للكيلوجرام، الجسم الوزن4، تكفي هذه الأرقام الخلية allogenic علاج العديد من المرضى.

واحد خطوة حاسمة في إجراءات العزل هي مدة الهضم كولاجيناز. عند فترة الهضم قصيرة جداً، سوف تظل كتل كبيرة من الأنسجة، التي ستكون أصعب للثقافة. عند فترة نضح طويل جداً، يمكن ملاحظة موت الخلية زيادة. ولذلك، حالما يبدأ الكلي لتصبح لينة والسوائل أقل شفافية، الكلي ينبغي أن يكون تدليك بلطف ومعاملة كولاجيناز يجب أن تتوقف.

خطوة حاسمة أخرى هي ثقافة الخلايا بعد تخصيب خلية في NG2. في بعض الأحيان بعد تخصيب خلية في NG2، لا تبدأ ارتشاح الخلايا تتكاثر أو تبدأ في النمو في هياكل ثلاثية الأبعاد. عندما تريبسينيزيد الخلايا وريسيديد، في هذه الحالة، سوف عادة ما تبدأ الخلايا تنمو في ثقافة أحادي الطبقة.

واستخدمت كبداية المواد، زرع الأعضاء البشرية الصف الكلي تجاهل أساسا لأسباب جراحية. هذه هي الأجهزة الفنية دون التليف الرئيسية. أننا نعترف بأن هذا قد يكون قيداً كهذا نادر نسبيا، ومن الصعب الحصول على مصدر الجهاز. اكسبلانتيد الكلي قد يكون مصدر آخر؛ بيد اعتماداً على السبب اكسبلانتيشن الكلي، هذه الكلي قد تحتوي على أكثر من التليف وميوفيبروبلاستس وهكذا، ولذلك ينبغي الحرص منذ ميوفيبروبلاستس قد تكون معزولة ومثقف بدلاً من ارتشاح الخلايا.

كما معزولة كبسكس مع هذا المعرض بروتوكول خصائص organo تيبيك مع الكلي الظهارية الجرح الشفاء قدرات15، العلاج بالخلايا مع كبسكس في أمراض الكلي وزرع الأعضاء سيكون تطبيق مستقبل مثيرة لاهتمام. ولهذا الغرض، هناك عدة استراتيجيات لتسليم المنتج/خلية. الاستراتيجية الأولى ضخ الرابع من كبسكس، كما تستخدم حاليا في الدراسات السريرية بممسك. تطبيق آخر للاهتمام هو استخدام كبسكس أو عوامل كبسك تفرز في نضح الجهاز قبل الزرع. بهذه الطريقة، يمكن تحسين نوعية الكلي اكسبلانتيد مما قد يؤدي إلى وظيفة الكلي تحسن بعد زرع الأعضاء. لكلتا الاستراتيجيتين، كبسكس، مصدر خلية جديدة مثيرة لاهتمام لمواصلة استكشاف للأغراض السريرية.

الإفصاحات

D.G.L.، M.A.E.، و T.J.R. المرتبطة بتطبيق براءات الاختراع فيما يتعلق بهذا البحث. ليس لها علاقة بالكشف عن المؤلفين الآخرين.

شكر وتقدير

هذا البحث تلقت تمويلاً من "الاتحاد الأوروبي البرنامج الإطاري السابع" (FP7-2007-2013) في إطار المنحة رقم اتفاقية 305436 ممتاز.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أكياس باكسترFenwalR4R-7004
الصفائحصلاحية المواد الفائضة في مستشفى Sanquin
محللةحسب الطلب
زجاجات معقمة يمكن التخلص منها Corning09-761-11
500 مل أنابيب الطرد المركزيPP Corning431123
a-MEM متوسطلونزاBE12-169F
جلوتاماكسثيرمو فيشر35050038
القلم / البكتيريا   ؛15070063Invitrogen
Codan455609
DMEM-F12Life Technologies11320-074
مصل بشري عادي (NHS)Sanquin
Hepes 1 MLonzaBE-17-737E
NaHCO3< / sub> 7.5٪LonzaBE17-613E
CaCl< فرعي>2< / فرعي> 1 مسيجما ألدريتش10043-52-4
جسر UWإلى الحياة32911
هيبارينليو فارما
كولاجيناز NB1 GMP الصفSERVA17455.03
DMSOSigma AldrichD2650-100ml
ستائر جراحية3M NederlandDH999969404
مضخة الترويةMetrohmX007528300
رأس المضخةMetrohmX077202600
الترويةحسب الطلب
أنابيب LS25 masterflex MasterflexMasterflexHV-96410-25
ملحق سبايكGambro DASCO6038020
pulmozymeقوارير
25 قارورة ثقافة 690175 سم2< / sup>greiner
75 سم sup2< / sup>greiner658170
قارورة مزرعة 175 سم 2< / sup>greiner661160
Trypsinsigmat4174
ألبومين مصل البقر (BSA)SigmaA2153
EDTASigma-AldrichE5134-500g
FcR كاشف حجبmiltenyi130-059-901
حبات مضادة للورم الميلانيني (NG2)miltenyi130-090-452
مصفاة خلية 70 & مايكرو ؛ مكورنينج352350
أعمدة LSMiltenyi130-042-401
مغناطيس MACSmiltenyi130-090-976
CD34 FITCBD & nbsp ؛555821
CD45 APCBD 555485
CD146 PEBD 550315
NG2 APCR& دFAB2585A
CD90 PEBD 555596
HLA ABC APCBD 555555
CD105 FITCAncell326-040
HLA DR APCBD 559866
CD56 PEBD 555516
CD73 PEBD 550257
CD31 FITCBD 555445
CD133 PEmiltenyi130-090-853
PDGF-r R & Dmab 1263
ماوس IgG1 FITCBD 345815
الماوس IgG1 PEBD 345816
الماوس IgG1 APCBD & nbsp ؛345818
IgG2b PEBD 555743
الماعز المضاد للفأر PEDakoR0480
أزيد الصوديومMerck822335
DMEM Ham' s F12Gibco31331-028
ITS (الأنسولين ، الترانسفيرين ، السيلينيوم)SigmaI1884
الهيدروكورتيزونSigmaH0135
ثلاثي يودوثيرينينSigmaT5516
عامل نمو البشرة (EGF)سيجماE9644
PTEC الكلى البشري الخالد (HK2)بإذن من M. Ryan ، كلية دبلن الجامعية
الدموية البشرية انتهت لأقل من 2 د يتم استخدامها الصفائح الدموية نظام نقل الدم علبة مصنوعة ثقافة روش

المراجع

  1. Friedenstein, A. J., et al. Precursors for fibroblasts in different populations of hematopoietic cells as detected by the in vitro colony assay method. Exp Hematol. 2 (2), 83-92 (1974).
  2. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  3. Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284 (5411), 143-147 (1999).
  4. Leuning, D. G., Reinders, M. E., de Fijter, J. W., Rabelink, T. J. Clinical translation of multipotent mesenchymal stromal cells in transplantation. Semin Nephrol. 34 (4), 351-364 (2014).
  5. Reinders, M. E., et al. Autologous bone marrow-derived mesenchymal stromal cells for the treatment of allograft rejection after renal transplantation: results of a phase I study. Stem Cells Transl Med. 2 (2), 107-111 (2013).
  6. Perico, N., et al. Autologous mesenchymal stromal cells and kidney transplantation: a pilot study of safety and clinical feasibility. Clin J Am Soc Nephrol. 6 (2), 412-422 (2011).
  7. Perico, N., et al. Mesenchymal stromal cells and kidney transplantation: pretransplant infusion protects from graft dysfunction while fostering immunoregulation. Transpl Int. 26 (9), 867-878 (2013).
  8. Tan, J., et al. Induction therapy with autologous mesenchymal stem cells in living-related kidney transplants: a randomized controlled trial. JAMA. 307 (11), 1169-1177 (2012).
  9. Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).
  10. Sacchetti, B., et al. No Identical "Mesenchymal Stem Cells" at Different Times and Sites: Human Committed Progenitors of Distinct Origin and Differentiation Potential Are Incorporated as Adventitial Cells in Microvessels. Stem Cell Reports. 6 (6), 897-913 (2016).
  11. Chen, W. C., et al. Human myocardial pericytes: multipotent mesodermal precursors exhibiting cardiac specificity. Stem Cells. 33 (2), 557-573 (2015).
  12. Dekel, B., et al. Isolation and characterization of nontubular sca-1+lin- multipotent stem/progenitor cells from adult mouse kidney. J Am Soc Nephrol. 17 (12), 3300-3314 (2006).
  13. Li, J., et al. Collecting duct-derived cells display mesenchymal stem cell properties and retain selective in vitro and in vivo epithelial capacity. J Am Soc Nephrol. 26 (1), 81-94 (2015).
  14. Pelekanos, R. A., et al. Comprehensive transcriptome and immunophenotype analysis of renal and cardiac MSC-like populations supports strong congruence with bone marrow MSC despite maintenance of distinct identities. Stem Cell Res. 8 (1), 58-73 (2012).
  15. Leuning, D. G., et al. Clinical-Grade Isolated Human Kidney Perivascular Stromal Cells as an Organotypic Cell Source for Kidney Regenerative Medicine. Stem Cells Transl Med. , (2016).
  16. Bruno, S., et al. Isolation and characterization of resident mesenchymal stem cells in human glomeruli. Stem Cells Dev. 18 (6), 867-880 (2009).
  17. Ryan, M. J., et al. HK-2: an immortalized proximal tubule epithelial cell line from normal adult human kidney. Kidney Int. 45 (1), 48-57 (1994).
  18. Nijhoff, M. F., et al. Glycemic Stability Through Islet-After-Kidney Transplantation Using an Alemtuzumab-Based Induction Regimen and Long-Term Triple-Maintenance Immunosuppression. Am J Transplant. , (2015).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

NG2

مقالات ذات صلة