Method Article

تحريض التمايز الخلوي والتصوير خلية واحدة من فيبرايو بارايموليتيكوس السباح و سوارمر الخلايا

DOI:

10.3791/55842

⸱

May 15th, 2017

 ,  , 
1Department of Ecophysiology, Max Planck Institute for Terrestrial Microbiology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذا البروتوكول يتيح المجهر خلية واحدة من فيبريو باربرايموليتيكوس السباح متميزة متميزة وخلايا أسوأ. وتنتج هذه الطريقة مجموعة من الخلايا الداعمة المتاحة بسهولة لتحليل خلية واحدة ويغطي إعداد الثقافات الخلية، تحريض التمايز سوبيرمر، وإعداد العينات، وتحليل الصور.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

القدرة على دراسة توطين الخلايا من البروتينات ضروري لفهم العديد من العمليات الخلوية. في المقابل، وهذا يتطلب القدرة على الحصول على خلايا واحدة للمجهر مضان، والتي يمكن أن تكون صعبة بشكل خاص عندما خلايا التصوير التي توجد داخل المجتمعات البكتيرية. على سبيل المثال، المسببة للأمراض البشرية فيبريو باراهايموليتيكوس موجود كخلايا السباح القصيرة على شكل قضيب في الظروف السائلة التي على سطح الاتصال التفريق في سوبوبولاتيون من خلايا أسد ممدود للغاية المتخصصة للنمو على الأسطح الصلبة. تقدم هذه الورقة طريقة لأداء تحليل خلية واحدة مضان المجهري من V. بارايموليتيكوس في دولتي التفاضلية. هذا البروتوكول استنساخا جدا يستحث التمايز من V. بارايموليتيكوس في الخلية الدافع حياة دورة ويسهل انتشارها على الأسطح الصلبة. تنتج هذه الطريقة مشاعل الخلايا المتمايزة الأيسر تمتد من tوقال انه حافة مستعمرة سرب. ومن الجدير بالذكر، في طرف جدا من سرب مشاعل، توجد خلايا أسوأ في طبقة واحدة من الخلايا، والذي يسمح لنقلها السهل إلى شريحة المجهر والتصوير المجهري مضان اللاحقة من خلايا واحدة. بالإضافة إلى ذلك، يتم عرض سير العمل لتحليل الصور للتمثيل الديمغرافي للمجتمعات البكتيرية. وكدليل على المبدأ، يتم وصف تحليل توطين الخلايا من الكيميائي يشير صفائف في السباح والخلايا الداعمة من V. بارايموليتيكوس.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البكتيريا باستمرار تجربة التغييرات على البيئة الخارجية، وقد وضعت العديد من التقنيات لتغيير وتكييف سلوكهم وفقا لذلك. واحدة من هذه الآلية تنطوي على التمايز إلى أنواع الخلايا المتميزة التي تكمل بشكل أفضل البيئة المتغيرة. التمايز غالبا ما ينطوي على تغييرات كبيرة في تنظيم دورة الخلية، مورفولوجيا الخلية، والتنظيم الزماني الزماني للخلايا. أحد الكائنات الحية التي يمكن أن تخضع للتمايز هو فيبرايو بارايموليتيكوس . V. بارايموليتيكوس ينتمي إلى فيبريوناسي ، الذي هو عائلة من بروتيوباكتيريا التي تسكن عادة المياه العذبة أو المالحة. يتم توزيع فيبريوناسي على نطاق واسع في البيئة وتشمل العديد من الأنواع التي تسبب التهابات المسالك المعوية في البشر، بما في ذلك أيضا ضمة الكوليرا. باراهايموليتيكوس هو كائن حيوي و قادر على التفريق في نوعين مختلفين من الخلايا كرد فعل لاستيعاب التغيرات فيالوسط الخارجي. في البيئات المائية، فإنه موجود كخلايا السباح القصيرة على شكل قضيب مع ساق القطبية واحدة المتمركزة في القطب الخلية القديمة. عند الاتصال السطح، يتم تشغيل التمايز في خلية سرب. سوارمر تمايز الخلايا ينطوي على اثنين من التغييرات الرئيسية: سربار خلية التشكل من خلال تثبيط انقسام الخلايا، وتحريض نظام سوط الثاني. ويؤدي ذلك إلى تكوين خلية أسماك ذات شكل قضيب بيريتريشوس وممدود للغاية، والتي يمكن أن تستمر إما في نمط حياة القطيع، حيث تؤدي أحداث الانقسام إلى خلايا أسلاف أسلاف، أو تفرق في الخلف إلى خلايا السباح.

وقد تم الإبلاغ عن عدة عوامل لتحفيز أو التأثير على التمايز أسوأ. ويبدو أن الحافز الأساسي يقودها ميكانوسنسينغ حيث V. بارايموليتيكوس يستخدم العلم القطبي كمستشعر اللمس الذي يكشف عن تثبيط دوران على اتصال السطح، ولكن هناك عدة عوامل أخرى تشارك كماحسنا 1 . في المختبر، دوران الساق القطبية يمكن أن يتم تثبيطها بشكل مصطنع بإضافة فيناميل، الذي يحجب دوران الصفيحة التي تحركها الصوديوم، مما يؤدي إلى تمايز الأسوار 2 . وعلاوة على ذلك، في دراسة سابقة، فيبريو ألجينوليتيكوس كان يحرض على سرب على وسائل الاعلام الصلبة عندما تم نشر الخلايا على وسط النمو في طبق بتري مختومة بشريط بلاستيكي واضح. ومنعت ورقة المرشح المشبعة بالقلويات من الاحتشاد في ظل هذه الظروف، مما يوحي بأن واحدا أو أكثر من الأحماض المتطايرة قد يكون ضالعا في تحريض الاحتكاك. وبالتالي، فإن ختم طبق بتري مع الشريط البلاستيك المرجح للسماح لتراكم الأحماض المتطايرة، التي شكلت من قبل منتجات ثانوية من التمثيل الغذائي الخلوي، داخل مساحة الرأس من لوحة. وقد تحقق نفس التأثير عندما أضيف H2 O 2 إلى وسط النمو في أطباق بيتري غير مختومة من أجل إنتاج الأحماض المتطايرة بشكل مصطنع عن طريق هدروليسينغ المكونات الإعلامية 3 ، 4 ، 5 . ومع ذلك، لا تزال هوية هذه الأحماض المتطايرة غير معروفة. وعلاوة على ذلك، فقد تبين أن توافر الفائض من الكالسيوم 6 والحد من الحديد 7 على حد سواء تعزيز التمايز أسوأ وانتشار على الأسطح الصلبة. يمكن تجويع الخلايا للحديد بإضافة مركب 2،2'-بيبيريديل إلى وسط النمو، والذي ثبت أنه يؤثر على تمايز الأسوار 8 . يتم الآن تنفيذ العوامل المعروفة لتنظيم التمايز في تصميم بروتوكول الذي يحفز على نحو متكاثر V. التمايز بارايموليتيكوس في الخلايا الأبقار وانتشارها على السطوح أجار الصلبة.

V. بارايموليتيكوس التمايز ينطوي على تغييرات كبيرة في تنظيم انقسام الخلايا، مورفولوجيا الخلوية، وتحديد المواقع من الآلات الجزيئية مثل فلاجيلأ و الكيميائي الأجهزة - العمليات التي تتطلب كل توطين محددة من البروتينات وفقا لدورة الخلية. وبالتالي، فإن القدرة على دراسة توطين الخلايا من هذه البروتينات أمر ضروري لفهم العمليات الخلوية المذكورة أعلاه. من أجل إجراء مثل هذه الدراسات مضان المجهري على خلايا واحدة مطلوب. هذا يمكن أن يكون تحديا بشكل خاص عندما خلايا التصوير الموجودة داخل السكان البكتيرية الكثيفة، كما هو الحال بالنسبة للخلايا أسوأ. كانت هناك محاولات للحث على التمايز أسوأ في وسائل الإعلام السائل، والتي يمكن أن تولد خلايا واحدة للدراسات المجهري. وعلى الرغم من أن على مستوى النسخي هذه الخلايا قد تسببت جزئيا برنامج تمايز أسراب، فإنها لا تخضع لنفس التغييرات المورفولوجية متميزة كما خلايا سربار متباينة تماما نمت على المتوسطة الصلبة 8 . تقدم هذه الورقة بروتوكول قوي وقابلة للتكرار من طريقة للحث على سربار مليرة لبنانية التمايز على سطح أجار. بروتوكول ينتج السكان من الخلايا التي يسهل الوصول إليها بسهولة أكثر سربار متاحة بسهولة للمجهر الخلية واحدة والتحليل اللاحق. وعلاوة على ذلك، بروتوكول تمكن دراسات التعريب من البروتينات فلورزنتلي المسمى في كل من السباح وأنواع الخلايا أسوأ (أقسام 1، 2، 3، 4). بالإضافة إلى ذلك، يصف البروتوكول سير العمل اللاحقة على كيفية معالجة وتحليل البيانات التي تم إنشاؤها من التجارب المجهري مضان، والذي يسمح للتحليل الديموغرافي للمجتمعات البكتيرية (القسم 5).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد الكهربائية المختصة V. بارايموليتيكوس الخلايا و إليكتروبوراتيون من الحمض النووي البلازميد في خلايا السباح

ملاحظة: القسم التالي من بروتوكول يسمح لإعداد الخلايا الكهربائية المختصة وما يليه من إليكتروبوراتيون من الحمض النووي البلازميد في خلايا السباح. هذه الخطوة مهمة إذا تم التعبير عن بروتينات الفلورسنت خارجيا من البلازميد.

  1. متتالية V. خلايا بارايموليتيكوس من الأسهم -80 درجة مئوية الجلسرين على لوحة أجار لب الطازجة التي تحتوي على 100 ميكروغرام / مل أمبيسيلين واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
  2. في اليوم التالي، تطعيم 200 مل من المتوسطة لب مع مستعمرة واحدة من V. بارايموليتيكوس واحتضان ذلك في 37 درجة مئوية تحت ظروف تهز حتى يتم الوصول إلى أود 600 من 1.0. وعادة ما يستغرق 5-6 ساعة من الحضانة لخلية الخلية للوصول إلى الكثافة البصرية المطلوبة.
  3. نقل على الفور الخلايا على الجليد والرفاهأورم جميع الخطوات الأخرى على الجليد وفي 4 درجة مئوية مبردة مسبقا أجهزة الطرد المركزي.
  4. حصاد الخلايا في 4 درجات مئوية لمدة 10 دقيقة في 2000 × ز.
  5. تجاهل طاف عن طريق الصبغة وإعادة تعليق بيليه الخلية في 25 مل من الجليد الباردة 273 ملي حل السكروز (الرقم الهيدروجيني 7.4، مخزنة مع كوه).
  6. حصاد الخلايا مرة أخرى في 4 درجات مئوية لمدة 10 دقيقة في 2000 x ز. كرر مرتين إضافيتين.
  7. إعادة تعليق بيليه خلية غسلها في 400 ميكرولتر من الجليد الباردة 273 ملي حل السكروز. وفي وقت لاحق، إضافة الجلسرين إلى تركيز النهائي من 15٪ المجلد / المجلد. الخلايا الآن جاهزة لل إليكتروبوراتيون، ولكن يمكن أيضا أن تكون مجمدة في أليكوتس من 70 ميكرولتر في -80 درجة مئوية لاستخدامها لاحقا.
  8. ل إليكتروبوراتيون، مزيج قسامة 70 ميكرولتر من الخلايا الكهربائية المختصة مع 100-1000 نانوغرام من الحمض النووي البلازميد ونقل الخليط إلى كوفيت إليكتروبوراتيون الجليد الباردة (0.2 سم الفجوة القطب). أداء إليكتروبوراتيون مع الإعدادات التالية: 25 μF، 2400 V و 200 Ω.
  9. تعليقالخلايا في كوفيت إليكتروبوراتيون في 600 ميكرولتر من مرق لب، ونقل إلى أنبوب 2 مل واحتضان بينما يهز عند 37 درجة مئوية لمدة 3 ساعات.
  10. تدور باستمرار الخلايا في 2000 x ج لمدة 5 دقائق وإعادة تعليق بيليه في 100 ميكرولتر من مرق لب. نشر تعليق خلية على لوحات أجار لب انتقائية تحتوي على المضادات الحيوية الضرورية واحتضان عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  11. في اليوم التالي، والتحقق من لوحات لتشكيل مستعمرة. المستعمرات التي تنمو تحمل الجينات المقاومة للمضادات الحيوية الصحيحة المشفرة على البلازميد ويمكن الآن أن تستخدم لمزيد من التجارب.

2. التعريفي من سربار تمايز الخلايا

ملاحظة: الخطوات التالية تصف كيفية تحفيز التمايز من V. بارايموليتيكوس في حياتها سرب الخلية دورة، وكيفية تحفيز الانتشار على الأسطح الصلبة.

  1. تعليق 4 غرام من تسريب القلب (هاي) أجار في 100 مل د 2 O من أجل إعداد لوحات سربينغ.
  2. تغلي بعناية الحل أجار هاي في الميكروويف ويهز زجاجة من وقت لآخر حتى يذوب المسحوق. الأوتوكلاف في 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
  3. بعد التعقيم، يبرد أجار هاي إلى 60-65 درجة مئوية. إضافة 2،2'-بيبيريديل إلى تركيز النهائي من 50 ميكرومتر (حل المخزون من 50 ملي في الإيثانول 100٪). إضافة كاكل 2 إلى تركيز النهائي من 4 ملم (حل المخزون من 4 M في د 2 O). إذا لزم الأمر، إضافة المضادات الحيوية في الحل للحفاظ على البلازميدات.
    ملاحظة: إذا التخطيط لاستخدام البلازميد محرض، إضافة عامل محفز لتركيز النهائي.
    تنبيه: 2،2'-بيبيريديل: سمية حادة (عن طريق الفم، الجلد، الاستنشاق). استخدم القفازات ونظارات السلامة عند التعامل مع هذه المادة الكيميائية.
  4. صب 30 - 35 مل من حل آجار هاي النهائي في جولة 150 مم طبق بتري والسماح لل أجار ترسيخ.
  5. الحق قبل اكتشاف ثقافة الخلية، وتجفيف لوحة أجار عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة على الأقل (أو حتى أي بقايا سائلة ديسا ديساباريد، ولكن لم يعد) يصل الحق مع غطاء مفتوح.
    ملاحظة: مرات التجفيف تعتمد إلى حد كبير على حاضنة المستخدمة والألواح المجففة بشكل كبير لن تسمح سرب من V. بارايموليتيكوس . (هذه الخطوة مهمة جدا!) يجب أن تستخدم لوحات جديدة ويجب ألا يكون أكبر من 2 - 3 ح. سوف تكون لوحات قديمة جافة جدا لتحفيز سرب.
  6. تطعيم كمية صغيرة من الخلايا من حافة مستعمرة واحدة إلى 5 مل من مرق لب. احتضان الثقافة تهتز عند 37 درجة مئوية حتى يتم التوصل أود 600 = 0.8، وعادة ما يستغرق حوالي 2-3 ساعات. بعد ذلك، والخلايا هي على استعداد ليتم رصدها على مرحبا سوارمينغ لوحات أجار.
  7. بقعة 1 ميكرولتر من ثقافة الخلية في وسط أجار مرحبا لوحة تحرق ( الشكل 1A ).
  8. السماح بقعة الجافة ( الشكل 1B ).
  9. ختم لوحة مع الشريط البلاستيك واضحة والتأكد من أنه يتم إرفاق بقوة، وإلا فإنه قد فصل خلال حضانة بين عشية وضحاها ( الشكل 1C ).
    ملاحظة: هومن المهم جدا أن الختم هو الكمال. تجنب تشكيل فقاعات الهواء والطيات إلى الشريط عند تطبيقه.
  10. احتضان لوحة في 24 درجة مئوية خلال الليل. وهذا سوف يؤدي إلى تشكيل V. بارايموليتيكوس سرب مستعمرة مع سرب مشاعل تمتد من محيط مستوطنة سرب ( الشكل 2 ).

3. إعداد V. بارايموليتيكوس خلايا سوارمر للالمضان المجهري

ملاحظة: يصف البروتوكول التالي كيفية إعداد الشرائح الاغاروز المجهري وطباعة لاحقة من مشاعل تحتشد على لوحة أغاروس للحصول على خلايا سربار واحد للمجهر.

  1. لإعداد أغاروس الشرائح للمجهر، إضافة 1 غرام من الاغاروز إلى 100 مل من برنامج تلفزيوني فول / فول 20٪ و 10٪ فول / فول لب حل مرق. تغلي بعناية الحل في الميكروويف لتحل الاغاروز والسماح لها يبرد إلى 65-70 درجة مئوية في حين خلط مع النمام المغناطيسي.
  2. وضع أسشريحة المجهر الهزيل على قسم مستوى تماما من مقعد العمل. تغطية كلا طرفي الشريحة مع طبقتين من الغرض العام مختبر الشريط العلامات، وتحديد الشريحة إلى مقعد العمل. المسافة بين قطعتين من الشريط يجب أن يكون حوالي 3 سم.
    ملاحظة: طبقتين من الشريط إنشاء ارتفاع صغير جدا، والتي سوف تحدد ارتفاع لوحة أغاروس. من المهم أن مساحة العمل هو مستوى للتأكد من الخلايا ستكون في نفس الطائرة لتحليل المجهري.
  3. الماصة ~ 250 ميكرولتر من حل الاغاروز أعدت مسبقا على سطح الزجاج غير المغطاة.
  4. الآن ضع شريحة المجهر الثاني في نفس التوجه كما القاع واحد على القمة واضغط قليلا عليه، بحيث الأغاروز المتبقية يمكن أن تتدفق إلى الجانبين.
  5. السماح للأغاروز تصلب 1-2 دقيقة ثم سحب ببطء الشريحة الزجاجية أعلى من أسفل واحد في حركة أفقية.
  6. باستخدام مشرط، وقطع أي أغاروس المتبقية التي تعلق علىالجانبين من شريحة المجهر وإزالة ببطء الشريط من نهايات الشريحة المجهر.
    ملاحظة: الشريحة أغاروس جاهزة الآن، وينبغي أن تستخدم في أقرب وقت ممكن لأنها سوف تبدأ ببطء لتجف.
  7. لإجراء المجهري على الخلايا الداعم، وقطع من ~ 3 مم × 10 مم قطعة من آجار يحتشد من معظم حافة الخارجي من مستعمرة يحتشد ( الشكل 1D ). من المهم جدا عدم كسر الشريط ختم لوحة سرب حتى على الفور قبل نقل الخلايا أسوأ إلى شريحة المجهر. مرة واحدة يتم إزالة الشريط، وحشد V. خلايا بارايموليتيكوس الشروع في التمايز في خلايا السباح.
    ملاحظة: تأكد من توجيه التخفيضات من الخارج من حافة مستعمرة سرب إلى داخل المستعمرة ( الشكل 1D ). بهذه الطريقة يمكنك منع "التلوث السباح" في حافة المستعمرة سربينغ.
  8. نقل قطعة من آجار يحتشد على شريحة أغاروس المجهر مع الخلايا التي تواجه الاغاروز سنوياد ( الشكل 1E ). هذا يبسط الخلايا تحتشد على لوحة الاغاروز.
  9. بعد انتظار ~ 30 ثانية، وإزالة قطعة أجار بعناية من لوحة أغاروس ( الشكل 1F ).
  10. وضع ساترة الزجاج على لوحة الاغاروز حيث تم طباعة الخلايا. الخلايا الآن جاهزة للمجهر.
    ملاحظة: من المهم أن الخلايا صورة سوبيرمر على الفور، منذ خلايا أسوأ بدء ببطء التمايز إلى دولة السباح.

4. إعداد V. بارايموليتيكوس السباح خلية الثقافات لالمضان المجهري

ملاحظة: يصف هذا القسم من بروتوكول كيفية إعداد ثقافة V. بارايموليتيكوس لأداء المجهر مضان على السباح خلية من نوع.

  1. تطعيم كمية صغيرة من الخلايا من حافة مستعمرة واحدة إلى 5 مل من مرق لب. احتضان الثقافة تهتز عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة أو حتى يصبح نمو الخلايا طفيف مرئية.
  2. فيهذه المرحلة، إذا لزم الأمر، إضافة عامل محفز للتعبير عن البروتينات ذات الاهتمام. في هذا المثال، تم إضافة L-أرابينوس إلى تركيز النهائي من 0.2٪ (ث / فول) من أجل تحفيز التعبير عن يف-تشيو 9 .
  3. احتضان الثقافة تهز لمدة 2 ساعة إضافية عند 37 درجة مئوية.
  4. اتبع الخطوات 3.1-3.7 لإعداد الشرائح المجهرية الاغاروز.
  5. بقعة 1 ميكرولتر من ثقافة الخلية في وسط لوحة الاغاروز والسماح للاحتضان بقعة حتى يجف.
  6. وضع ساترة الزجاج على لوحة أغاروس حيث تم رصد الخلايا. الخلايا هي الآن على استعداد لتكون تصويرها تحت المجهر مضان.

5. تحليل الصورة

هذا الجزء من بروتوكول يصف سير العمل لتحليل الصور، وخاصة كيفية استخراج بيانات مضان من خلايا واحدة للتحليل الديموغرافي.

  1. قبل البدء في تحليل الصورة تأكد من أن يتم حفظ جميع الصور المجهري في تنسيق تيف 16bit.
  2. تحميل ديك (أو النقيض من المرحلة) والصور المقابلة قناة الفلورسنت في البرنامج.
  3. أنشئ صورة تراكب لكلا القناتين عن طريق تحديد "صور العرض / التراكب". قم بتعيين عدد الصور ("# صور:") إلى اثنين، وحدد صورة ديك في القناة الأولى والصورة الفلورية في القناة الثانية.
  4. حدد أداة "متعدد الخطوط" من شريط الأدوات وقم بتمييز الخلايا من عمود إلى آخر عبر منتصف الخلية. من أجل الحصول على قائمة بجميع خطوط ولدت (الأجسام الخط) فتح "قياس / قياس المنطقة". تكوين قياسات المنطقة لعرض فقط تسمية المنطقة، والمسافة، ومتوسط ​​شدة.
  5. معايرة حجم بكسل تحت "قياس / معايرة المسافات" إلى حجم بكسل التي هي محددة لإعداد المجهر الخاص بك وانقر على "تطبيق لجميع الصور المفتوحة".
  6. نقل جميع المناطق (الأجسام الخط) إلى صورة قناة الفلورسنت. تحت "المناطق / ترانسفإر "حدد الصورة المصدر (صورة التراكب) والصورة المقصودة (صورة قناة الفلورسنت) .حدد" جميع المناطق "ثم اضغط على" موافق ".
    ملاحظة: لتكون قادرة على إعادة إنتاج في وقت لاحق خطوط الدقيق (كائنات الخط والمناطق وعائد الاستثمار)، وفتح "المناطق / حفظ المناطق" وحفظ المناطق.
  7. تصدير جميع القياسات المنطقة في جدول بيانات عن طريق فتح "قياس / قياس المنطقة" والضغط على "فتح السجل". تأكد من فتح البيانات وتصديرها. مرة واحدة يتم فتح جدول البيانات في الخلفية، وأخيرا تصدير البيانات عن طريق الضغط على "F9: بيانات السجل".
  8. لتحديد موقف بؤر الفلورسنت على طول الخلية، وفتح "قياس / لينسكان". تعيين "العرض لينسكان" إلى قيمة بحيث يتم تغطية العرض الكامل للخلية من قبل المنطقة التي قمت بإنشائها مسبقا. انقر بزر الماوس الأيمن في الرسم البياني للمسح الضوئي وحدد "عرض بيانات الرسم البياني". عن طريق النقر بزر الماوس الأيمن وسحب الماوس كورسير على طول خط المسح الضوئي إلىنقطة الفائدة، فإن "بيانات الرسم البياني" نافذة عرض بكسل / المسافة المقابلة بين النقطتين. حدد الصف الأزرق المميز ثم انسخ المحتوى.
    ملاحظة: يمكن تسجيل ملف تعريف كثافة خط المسح بأكمله إلى جدول بيانات عن طريق الضغط على "بيانات السجل" في نافذة "لينسكان". ويمكن الآن استخدام البيانات المستخرجة للتصور في الرسوم البيانية أو مزيد من التحليل الإحصائي. يمكن تصور أنماط التعريب على دورة الخلية بسهولة في التمثيل الديموغرافي لطول الخلية وكثافة الفلورسنت على طول الجسم الخلية. ويمكن الحصول على هذه الإقرارات باستخدام نفس عائد الاستثمار المحدد سابقا. سوف تعطي الخطوات التالية مثالا على كيفية إنشاء الخصائص الديمغرافية مماثلة لتلك التي تظهر في الشكلين 3C و 4 C.
    1. في فيجي / إيماجيج تحميل علامات المنطقة (.rgn) التي تم إنشاؤها مسبقا في البرنامج (الخطوة 5.6) باستخدام "ميتامورف ند و روي ملفات المستورد"،. بدلا من ذلك، مناطق الفائدة (روي) من الخلايا التي سيتم تحليلها يمكن إنشاؤها مباشرة في فيجي / إيماجيج باستخدام أداة البناء في "خط مجزأة".
    2. افتح "أنليز / تولس / روي ماناجر" ووضع علامة على كل إدخالات القائمة النشطة ".
    3. بعد ذلك، انقر فوق "أكثر / متعددة مؤامرة" ثم حدد "قائمة" في نافذة "متعددة المؤامرة" الجديدة. انقر على إدخال جدول، ثم حدد "نسخ الكل". وفي وقت لاحق، الصق في جدول بيانات جديد.
      ملاحظة: تأكد من أن البيانات من أطول خلية (اثنين من الأعمدة X و Y المقابلة مع أكبر عدد من الصفوف) هي آخر واحد إلى اليمين في جدول البيانات.
    4. احفظ جدول البيانات ك "كسف (محدد بفواصل) (* .csv)".
    5. تحميل البرامج النصية R من هنا "https://github.com/ta-cameron/Cell-Profiles" 10. البرامج النصية فرز الخلايا عن طريق طول وتطبيع ملامح كثافة الفلورسنت من جميع الخلايا كمتوسط ​​فلوريسنس كل خليةه.
    6. تشغيل البرنامج النصي بأكمله "ملفات تعريف الخلية function.R" في R [الإصدار 3.0.1؛ 11 ].
    7. قم بتحرير البرنامج النصي "example plots.R" في السطر 30 بحيث يشير مسار الملف إلى المجلد حيث يتم حفظ ملف كسف الذي تم إنشاؤه مسبقا. بالإضافة إلى ذلك، قم بتغيير اسم الملف "profile.csv" في السطر 31 إلى اسم الملف المختار لملف .csv الذي تم إنشاؤه في الخطوة 5.9.4. بعد ذلك، قم بتشغيل "مثال plots.R" واتبع الوثائق من "https://github.com/ta-cameron/Cell-Profiles" وكذلك التعليقات من ملف البرنامج النصي لتوليد التحليل الديموغرافي.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحريض التمايز وتوليد المستعمرات

الشكل 1 يوفر مخططا من الخطوات الهامة التي ينطوي عليها إنتاج مستعمرات سرب من V. بارايموليتيكوس ( الشكل 1A-C ). وقد رصدت ثقافة السباح على سرب أجار وحضنت في 24 درجة مئوية، مما أدى التمايز أسراب وانتشار على سطح أجار الصلبة. ويرد ممثل ستيريو صورة المجهر من مستعمر...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذه الورقة تقارير طريقة التصوير المجهري للخلايا بارايموليتيكوس V. بارايموليتيكوس ، تليها التحليلات المصب تهدف إلى حل وتحديد توطين تحت الخلوية وغيرها من الميزات من البروتينات فلورزنتلي المسمى درس. على الرغم من وجود العديد من الأدوات لمعالجة الصور المجهرية وتحليل 14 و 15 و 16 و 17 و 18 ، وتحليل V. بارايموليتي...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لم يعلن عن تضارب المصالح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذا العمل جمعية ماكس بلانك.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
< مكونات الوسائط > قوية < / قوية >
رطل متوسطRothX968.3
Difco Agar ، حبيباتBD214510لتحضير LB أجار مع LB متوسط
Difco Heart Infusion AgarBD244400لتحضير ألواح احتشاد HI
agar Agarose NEEO ، جودة فائقةRoth2267.3لإعداد وسادات الاغاروز
المجهرية <قوية>الاسم< / قوي><قوي>الشركة< / قوي><قوي>رقم الكتالوجتعليقات
Additives
L-arabinoseRoth5118.3تستخدم للحث على مشتقات pBAD
2،2'-Bipyridylسيجما ألدريتشD216305-25Gلتحضير ألواح احتشاد HI أجار ثنائي
هيدرات كلوريد الكالسيومروث5239.1لتحضير ألواح احتشاد HI أجار ملح
الصوديوم أمبيسلينروثK029.3
كلورامفينيكولروث3886.3
PBS العازلة-وصفة قياسية للمحلول الملحي
D (+) السكروزروث4621.1لتحضير الخلايا ذات الكفاءة الكهربائية
GlycerolRoth3783.5لإعداد الخلايا ذات الكفاءة الكهربائية
<قوية>الاسم< / قوي><قوي>الشركة رقم الكتالوجتعليقات
Hardware
طبق بتري 150 مم × 20 مم مع كاميراتSarstedt82.1184.500لتحضير ألواح احتشاد HI agar
kelvitron t (B 6420)Heraeus-تستخدم لتجفيف ألواح احتشاد HI أجار
Gene Pulser Xcell نظام ميكروبيBioRad1652662تستخدم في كهرباء الحمض النووي البلازميد
< قوي > الاسم < / قوي >< قوي >الشركة< / strong >< strong> Catalog Number < / strong >< strong > Comments < / strong >
Software < / strong >
MetaMorph Offline (الإصدار 7.7.5.0) الأجهزةالجزيئية-المستخدمة لتحليل الصور المجهرية
ExcelMicrosoft-تستخدم لتحليل بيانات الفحص المجهري
المخفض بالفوسفات

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. McCarter, L., Hilmen, M., Silverman, M. Flagellar dynamometer controls swarmer cell differentiation of V. parahaemolyticus. Cell. 54 (3), 345-351 (1988).
  2. Kawagishi, I., Imagawa, M., Imae, Y., McCarter, L., Homma, M. The sodium-driven polar flagellar motor of marine Vibrio as the mechanosensor that regulates lateral flagellar expression. Mol. Microbiol. 20 (4), 693-699 (1996).
  3. Ulitzur, S. Induction of swarming in Vibrio parahaemolyticus. Arch. Microbiol. 101 (4), 357-363 (1974).
  4. Ulitzur, S. Effect of temperature, salts, pH, and other factors on the development of peritrichous flagella in Vibrio alginolyticus. Arch. Microbiol. 104 (3), 285-288 (1975).
  5. Ulitzur, S. The mechanism of swarming of Vibrio alginolyticus. Arch. Microbiol. 104 (1), 67-71 (1975).
  6. Gode-Potratz, C. J., Chodur, D. M., McCarter, L. L. Calcium and iron regulate swarming and type III secretion in Vibrio parahaemolyticus. J. Bacteriol. 192 (22), 6025-6038 (2010).
  7. McCarter, L., Silverman, M. Iron regulation of swarmer cell differentiation of Vibrio parahaemolyticus. J. Bacteriol. 171 (2), 731-736 (1989).
  8. Gode-Potratz, C. J., Kustusch, R. J., Breheny, P. J., Weiss, D. S., McCarter, L. L. Surface sensing in Vibrio parahaemolyticus triggers a programme of gene expression that promotes colonization and virulence. Mol. Microbiol. 79 (1), 240-263 (2011).
  9. Heering, J., Ringgaard, S. Differential Localization of Chemotactic Signaling Arrays during the Lifecycle of Vibrio parahaemolyticus. Front Microbiol. 7 (November), 1-12 (2016).
  10. Cameron, T. A., Anderson-Furgeson, J., Zupan, J. R., Zik, J. J., Zambryski, P. C. Peptidoglycan synthesis machinery in Agrobacterium tumefaciens during unipolar growth and cell division. mBio. 5 (3), (2014).
  11. Development Core Team, R. F. F. S. C. R: A Language and Environment for Statistical Computing. R Foundation for Statistical Computing. 1, 2673(2008).
  12. Ringgaard, S., et al. ParP prevents dissociation of CheA from chemotactic signaling arrays and tethers them to a polar anchor. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (2), E255-E264 (2014).
  13. Ringgaard, S., Schirner, K., Davis, B. M., Waldor, M. K. A family of ParA-like ATPases promotes cell pole maturation by facilitating polar localization of chemotaxis proteins. Genes Dev. 25, 1544-1555 (2011).
  14. Vischer, N. O. E., et al. Cell age dependent concentration of Escherichia coli divisome proteins analyzed with ImageJ and ObjectJ. Front Microbiol. 6 (JUN), (2015).
  15. Schneider, C. a, Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  16. Sliusarenko, O., Heinritz, J., Emonet, T., Jacobs-Wagner, C. High-throughput, subpixel precision analysis of bacterial morphogenesis and intracellular spatio-temporal dynamics. Mol. Microbiol. 80 (3), 612-627 (2011).
  17. Ducret, A., Quardokus, E. M., Brun, Y. V. MicrobeJ, a tool for high throughput bacterial cell detection and quantitative analysis. Nat. Microbiol. 1, 16077(2016).
  18. Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), R100(2006).
  19. Morales-Soto, N., et al. Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays. J. Vis. Exp. (98), e52338(2015).
  20. Paintdakhi, A., et al. Oufti: An integrated software package for high-accuracy, high-throughput quantitative microscopy analysis. Mol. Microbiol. 99 (4), 767-777 (2016).
  21. de Jong, I. G., Beilharz, K., Kuipers, O. P., Veening, J. -W. Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy. J. Vis. Exp. (53), e1-e6 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Vibrio parahaemolyticusCellular DifferentiationSwarmer CellsSingle Cell ImagingFluorescence MicroscopySwarm Colony FormationAgarose Slide PreparationChemotaxis Protein LocalizationBacterial MorphogenesisDemographic Analysis

Related Articles