يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

دراسة مورفولوجيا القلب مشخصين وغذائها في الماوس

22.5K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/55843

⸱

أكتوبر 26, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Université Côte d’Azur, CNRS, INSERM, iBV, 2Department of Pathology, CHU Nice, 3Institute for Molecular Health Sciences, ETH Zurich

في هذه المقالة

ملخص

كثيرا ما يستخدم الفحص مشخصين في الفئران. وقد وضعت أجهزة الموجات فوق الصوتية ذات الدقة العالية باهظة الثمن لهذا الغرض. ويصف هذا البروتوكول إجراء مشخصين بأسعار معقولة جنبا إلى جنب مع تحليل شكلي نسيجية لتحديد مورفولوجيا القلب.

الملخص

عدد متزايد من نماذج الماوس المعدلة وراثيا قد أصبحت متاحة في السنوات الأخيرة. وعلاوة على ذلك، العدد الدراسات الدوائية في الفئران مرتفع. توصيف المظهرية من هذه النماذج الماوس يتطلب أيضا دراسة وظيفة القلب ومورفولوجيا. تخطيط صدى القلب، والتصوير بالرنين المغناطيسي (التصوير بالرنين المغناطيسي) هي الأساليب المستخدمة شيوعاً لتوصيف وظيفة القلب ومورفولوجيا في الفئران. مشخصين والتصوير بالرنين المغناطيسي المعدات المتخصصة لاستخدامها في القوارض الصغيرة مكلفة وتتطلب مساحة مخصصة. ويصف هذا البروتوكول قياسات القلب في الفئران باستخدام نظام مشخصين سريرية مع تحقيق الأوعية الدموية بشرية 15 ميغاهيرتز. وتجري القياسات على تخديره من الفئران الكبار. ثلاثة على الأقل من تسلسل الصور وتسجل وتحليلها لكل الحيوانات في وضع M في عرض قصير-محور باراستيرنال. بعد ذلك، يتم إجراء الفحص النسيجي القلب، ويتم تحديد أقطار كارديوميوسيتي على الهيماتوكسيلين-agglutinin ويوزين-أو جنين القمح (WGA)-الملون مقاطع البارافين. وتبلغ كثافة السفينة مورفوميتريكالي العزم بعد إيمونوستينينج بيكم-1. البروتوكول قد تم تطبيقها بنجاح على الدراسات الدوائية ومختلفة الوراثية الحيوانية نماذج تحت ظروف خط الأساس، وكذلك بعد تجريبي احتشاء عضلة القلب بربط دائم (الشريان التاجي تنازلي الأمامي الأيسر الفتى). في تجربتنا، مشخصين التحقيق يقتصر على الحيوانات تخديره وعملياً في الفئران الكبار وزنها على الأقل 25 غراما.

المقدمة

وتتوفر مجموعة كبيرة ومتنوعة من نماذج الماوس المعدلة وراثيا، وعدد الدراسات الدوائية في الفئران عالية1،2. تخطيط صدى القلب، والتصوير بالرنين المغناطيسي هي النهج الشائع استخدامها لتوصيف وظيفة القلب ومورفولوجيا في هذه النماذج الماوس3المظهرية. وهدف البروتوكول المقدم تحليل وظيفة القلب ومورفولوجيا في الفئران الكبار. فهو يجمع بين مشخصين، النسيجي، وقياسات المناعي. فحص مشخصين يستخدم على نطاق واسع في الفئران4،5،،من67،،من89،10،11، 12. باشون et al. وحدد 11 205 الدراسات المنشورة في تداولو تعميم البحوثو المجلة الأمريكية الفسيولوجيا-القلب والدورة الدموية علم وظائف الأعضاءو أبحاث القلب والأوعية الدموية بين 2012 و 2015 أن ويستخدم فحص مشخصين في الحيوانات.

يتم استخدام تخطيط صدى القلب لتعريف تعمل القلب في الفئران المعدلة وراثيا5،6،،من1314،،من1516، 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22، فضلا عن تحليل وظيفة القلب في تضخم المزمنة الناجمة عن الحمل الزائد، واحتشاء عضلة القلب الاسكيمية، ونماذج اعتلال عضلة القلب في الفئران (استعرض في12). تسمح معدات تحسين تخطيط صدى القلب لهذا الإجراء القياسي البطين الأيسر (LV) الانقباضي والانبساطي الأبعاد وتصوير دوبلر الأنسجة، شعاعية التباين احتشاء عضلة القلب، وتقييم وظيفة LV الإقليمية ومحمية التاجي 12-ومن الناحية المثالية، ينبغي إجراء دراسة مشخصين في الفئران واعية لتجنب الآثار السلبية للتخدير في تقلص وظيفة، مراقبة المنعكس اللاإرادي، ومعدل القلب11. ومع ذلك، يقتصر هذا النهج بشرط لتدريب الحيوانات؛ صعوبات في الحفاظ على درجة حرارة الجسم ثابتة؛ التحف الحركة؛ الإجهاد؛ ترددات عالية جداً في القلب؛ والحاجة إلى مالا يقل عن اثنين من المحققين لإجراء التجربة، لا سيما إذا كان يجري التحقيق في عدد كبير من الحيوانات. من المثير للاهتمام، أفادت دراسة أجريت مؤخرا لا توجد فروقات في معلمات مشخصين في الحيوانات المدربة وغير المدربة19. ونحن أداء قياسات مشخصين في تخديره من الفئران. التخدير مختلف البروتوكولات ستناقش أدناه.

على الرغم من أن الدقة القياسية تخطيط صدى القلب (> 10 ميجاهرتز) هي كافية لتدبير LV الانقباضية وأبعاد االنقباضي ووظيفة القلب في الفئران الكبار، الطريقة محدودة في وصف الظواهر الهيكلية الكامنة وراء. وهكذا، أن نجمع بين القياسات في فيفو مع غذائها وتحاليل إيمونوهيستولوجيكال لقياس الكثافة القطر والسفينة كارديوميوسيتي، على سبيل المثال،. يمكن أيضا إجراء التحقيقات غذائها وإيمونوهيستولوجيكال الأخرى، مثل تحديد انتشار الأسلحة، ودراسة المبرمج، قياسات حجم احتشاء، تحديد التليف، والتعبير علامة محددة، على نفس النوع من معالجة الأنسجة ولكنها ليست موضوع هذا البروتوكول. ويوفر خليط في فيفو الفحص مشخصين بتحليلات النسيجي أفكاراً إضافية في التعديلات الهيكلية الكامنة. في خطوة إضافية، يمكن أن نكمل هذه القياسات مع التحقيقات الجزيئية وهيكلية فائقة. تحاليل نسيجية لا إكمال دراسة مشخصين بل أيضا أصبحت لا غنى عنها عندما حل ضربات القلب غير كافية. وهذا هو الحال خاصة في نماذج الفئران المعدلة وراثيا التي هي قاتلة الجنينية23،24.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

أجريت التجارب الموضحة هنا امتثالا للقوانين ذات الصلة المؤسسية والفرنسية رعاية الحيوان، والمبادئ التوجيهية، والسياسات. أقرتها لجنة الأخلاقيات الفرنسية (لجنة إينستيتوتيونيل د ' ل صب واﻷخﻻق ' مختبر دي الحيوان؛ وعدد مرشحي/2012-106).

1-تخطيط صدى القلب

  1. تحديد وزن الجسم من الماوس باستخدام توازن مختبر قياسية أثناء الضغط عليه خفيفا من ذيله لضمان تحديد المواقع المناسبة.
  2. تخدير الحيوان عن طريق الحقن داخل (القائمة) 50 مغ/كغ بينتوباربيتال ، من 25 إلى 26-
    ملاحظة: يمكن استخدام أي نوع آخر من التخدير إذا تم استخدام البروتوكول نفسه طوال فترة الدراسة. مزايا وعيوب ستناقش أدناه.
  3. ضع الماوس مرة أخرى في قفص والانتظار حتى أنها لا تستجيب، فإنه يظهر التنفس المطرد، وردود الفعل القدم الخلفية غائبة. لاختبار هذا، الضغط على أقدام قليلاً ومراقبة ما إذا كانت الساق لا تزال تتراجع.
  4. يحلق في الجانب الأيسر من الصدر والابط الأيسر استخدام آلة حلاقة القوارض تجارية-
    ملاحظة: يسمح استخدام آلة الحلاقة القوارض مكرسة للإزالة الكاملة للماوس غرامة الشعر لتجنب التدخل في قياس مشخصين. وينبغي تجنب كريمات إزالة الشعر التجارية أو الحلول، كما أنها هي عادة المعطر، التي سوف تخل بالحيوان بعد أن يوقظ. تجنب الحلاقة المفرط، كما أنه يزيد من فقدان الحرارة.
  5. وضع الحيوان النوم على وسادة دافئة تعيين إلى 40-42 درجة مئوية في موقف اليسار من جانب ضحلة، مع الرأس في 12 س ' على مدار الساعة والذيل في 6 س ' على مدار الساعة. إصلاح الذراع اليسرى والساق اليسرى، والذيل مع الشريط.
  6. تطبيق استعد قبل جل تخطيط صدى القلب على صدره حلق ورأس محول.
    7. ضع
  7. محول اليسار parasternal، توجيهها إلى الجانب الأيمن من العنق للحصول على نظرة طويلة-محور parasternal ثنائي الأبعاد (2D) على مستوى العضلات الحليمية. تشغيل محول 90° باتجاه عقارب الساعة للحصول على طريقة عرض المحور قصيرة على مستوى العضلات بابيلاري. استخدام إعداد الحد أدنى من عمق وتكبير لتكبير صورة الجودة ومعدل الإطارات. تعيين سرعة الاجتياح إلى أقصى حد- ويمكن استخدام
    1. للحصول على هذه الإعدادات وتكبير مختلفة وعمق إعداد خيارات، اعتماداً على الجهاز والبرامج. عرض سجل تسترشد في 2D M-وضع الصور في محور قصيرة- 27. الرجوع إلى الشكل 1 ألف و ب 27-
      ملاحظة: العناية لتجنب الضغط المفرط في الصدر، وهذا قد يسبب بطء القلب-
  8. سجل على الأقل 3 سلسلة من 3 حلقات سينمائية فاز القلب لكل الحيوانات.
    ملاحظة: للحصول على اتشوكارديوجراف البرمجيات المستخدمة في هذه الدراسة، اضغط " اكتساب/حفظ " الزر مرة واحدة فقط. هذه المنهجية محددة إلى اتشوكارديوجراف مع هذا البرنامج بالذات. يمكن استخدام حزم البرامج الأخرى مع مختلف الآلات.
  9. بعد جل نجاح التسجيلات، مسح قبالة تخطيط صدى القلب من القفص الصدري الماوس، ولوحة تدفئة، ومحول طاقة. قم بإزالة الشريط من أطرافه والذيل.
  10. اترك الماوس تحت الملاحظة على لوحة تدفئة، مغطاة بأنسجة لتجنب لا لزوم لها فقدان الحرارة والتعرض الخفيفة، حتى أنه يستيقظ المكياج.
  11. وضع الحيوان مرة أخرى في قفصة.
    12. وسجلت
  12. تحليل M-وضع الصور من عرض المحور قصيرة parasternal لتحديد الأبعاد (LV) البطين الأيسر ووظيفته. قياس سمك الجدار الأمامي LV في االنقباض واالنبساط (لفاوس ولفاود)، وفي LV الداخلية نهاية الانقباضي والانبساطي نهاية الأقطار (لفيدس ولفيد) وسمك الجدار الخلفي LV (لفبو) في االنقباض واستخدام االنبساط (لفبوس ولفبود) تحديد واجهة الأنسجة الدموية على الصور المخزنة.
    13. قياس الأبعاد االنبساطي الأبعاد االنبساطي LV الظاهر القصوى في الوقت
  13. والوقف أبعاد نهاية الانقباضية في وقت الرحلة الانقباضية الأمامي أكثر من الجدار الخلفي LV. على الاستفادة اللمس " تحليل " رمز ثم في " لفاود " رمز. الموقف قدمه ذات الورنيّة الإلكترونية المتعلقة بالعلاقة بين تجويف البطين الأيمن والجدار الأمامي LV في االنبساط.
  14. الموقف قدمه ذات الورنيّة الإلكترونية المتعلقة بالعلاقة بين الجدار الأمامي LV وتجويف LV للحصول على سمك الجدار الأمامي االنبساطي LV؛ والبرنامج ستتحول مباشرة إلى قياس نهاية الانبساطي داخلية LV.
  15. الموقف قدمه ذات الورنيّة على الواجهة بين تجويف LV و LV الجدار الخلفي للحصول على قطر LV نهاية الانبساطي الداخلية؛ والبرنامج يقوم بالتبديل إلى قياس سمك الجدار الخلفي LV.
    16. ضع
  16. قدمه ذات الورنيّة في الواجهة بين الجدار الخلفي LV وتامور للحصول على سمك الجدار الخلفي االنبساطي LV. لإبعاد الانقباضية LV، اضغط على الشاشة تعمل باللمس في " لفاوس " الرمز والموقف قدمه ذات الورنيّة الإلكترونية المتعلقة بالعلاقة بين تجويف البطين الأيمن والجدار الأمامي LV في االنقباض.
  17. الموقف قدمه ذات الورنيّة الإلكترونية المتعلقة بالعلاقة بين الجدار الأمامي LV وتجويف LV للحصول على سمك الجدار الأمامي الانقباضية LV. كرر هذه العملية كما هو موضح أعلاه لقطر نهاية الانقباضية داخلية LV وسمك الجدار الخلفي الانقباضية LV. استخدام الاتفاقية الرائدة التي اعتمدت "المجتمع الأمريكي من تخطيط صدى القلب" لتتبع حدود للوفلر وابيكارديال 13 ، 27-
    ملاحظة: معلمات الدالة الهوس LV سيتم تلقائياً حساب باستخدام القياسات السابقة. يعرف LV كسرى تقصير (خ) خ (%) = [(LVIDd-LVIDs)/لفيد] x 100. ويحسب كسر قذفي LV (الإنكليزية والفرنسية) مع تعديل الصيغة تيتشولز، حيث EF (%) = [(LVIDd3-LVIDs3)/لفيد 3] x 100 12. يشير إلى الرقم 1 أ وب.
  18. تخزين البيانات على أقراص مدمجة أو ذاكرة USB العصي وعمل نسخ احتياطية-
  19. الاستيراد، تحليل، وتصدير البيانات باستخدام البرنامج المناسب.
    ملاحظة: بعد القياسات خط الأساس، وهذه التجربة يمكن أن يكون مؤقتاً. إذا كان إجراء مقارنة مباشرة بين الحيوانات بالضربة القاضية والبرية من نوع ليتيرماتيس، المضي قدما في تحليلات النسيجي 6. للعرقية-ERT2؛ خطوط الماوس لوكس/لوكس، تواصل في اليوم التالي مع تاموكسيفين التعريفي بالحقن القائمة، ك وصف 5 ، 24. إذا كان حمل تجريبي احتشاء عضلة القلب بعملية ربط الشريان التاجي الأيسر 5 ، 28، يمكن إجراء الجراحة مباشرة بعد القياسات مشخصين، عند الفئران يتم تحت التخدير. خلاف ذلك، ينبغي الإبقاء على تأخير الحد أدنى من أسبوع واحد بين جولتين من التخدير الحد من معدل الفتك بعد العمليات الجراحية-

2. إعداد "عينات القلب" "التقييم النسيجي"

  1. التضحية الحيوانات بخلع عنق الرحم. قياس أوزانها الجسم. تطهير الصدر والبطن باستخدام مسحه كحول 70%.
    2. إجراء
  2. على شق عرضية في الجلد 1 سم القاصي على القص. استخدام الملقط حادة، إزالة الجلد من الصدر، تتحرك في اتجاه الرأس. إجراء القص طفيفة مع الملقط الجميلة وفتح الحجاب الحاجز عن طريق إدراج نهاية حادة مقص جيد-
  3. قص القفص الصدري على الجانبين موازية للقص. نقل القص في اتجاه الرأس. قم بتحديد موقع القلب في الصدر. عقد جذع القلب والأوعية الدموية مع الملقط الجميلة وقطع أدناه باستخدام مقص جيد-
  4. فتح الصدر والمكوس قلب كامل خارج الصدر وقياس وزن القلب وإقامة وزن القلب للجسم نسبة 4 ، ، من 5 6 ، 23 ، 29 ، 30 .
    5. °
  5. إصلاح القلب في 2 مل من محلول فورمالين 10% مخزنة محايدة في أنابيب 15 مل بين عشية وضحاها في 4 جيم
    تحذير: خطر! ويجب أن يتم العمل مع حلول الفورمالين في غطاء الأبخرة كيميائية؛ ارتداء قفازات ونظارات السلامة.
    ملاحظة: كما يختلف تكوين المخزن المؤقت للحلول الفورمالين مع مختلف الموردين، استخدام المورد نفسه طوال فترة الدراسة-
  6. في اليوم التالي، قطع القلوب في الطائرة عرضية، في الوسط، وتحويلها إلى أشرطة الكاسيت لتضمين البارافين، التي تتم في مختبر علم الأمراض باستخدام جهاز تضمين الآلي.
  7. أداء تمزيقها.
    1. كتل البارافين القسم في سمك 3 ميكرومتر باستخدام مبضع وتعويم لهم في ماء 40 درجة مئوية حمام يحتوي على ماء مقطر.
    2. نقل المقاطع على الشرائح. تسمح أن الشرائح الجافة بين عشية وضحاها في حاضنة 37 درجة مئوية وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى جاهزة للاستخدام-
      ملاحظة: البروتوكول يمكن أن يكون مؤقتاً هنا حتى المستخدم على استعداد لتلطيخ (الخطوة 3)-
  8. ديبارافينيزي وترطيب الأنسجة الشرائح.
    1. بوضع الشرائح في تلطيخ الجرار مع إدراج الزجاج في فرن 55 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة تذوب في البارافين.
      2. ديبارافينيزي الشرائح في اثنين من التغييرات من 200 مل زيلين نفط أو زيلين نفط بديل لمدة 5 دقائق في كل من
    2. -
      تنبيه: شديدة الاشتعال والسمية! العمل في غطاء الأبخرة كيميائية؛ ارتداء قفازات ونظارات السلامة.
    3. نقل الشرائح إلى 200 مل كحول 100%. إجراء تغييرات اثنين لمدة 3 دقائق ونقل مرة واحدة من خلال 200 مل كحول 95% للحد الأدنى 3
      تنبيه: الاشتعال! ابق بعيداً عن مصادر الاشتعال؛ لا التدخين.
    4. شطف مرتين في 200 مل من الفوسفات مخزنة المحلول الملحي (PBS) لمدة 5 دقائق وتابع مع الخطوة 3 أو 4 أو 5-

3. توضع وتلطيخ ويوزين

  1. شطف الشرائح مع الأجزاء في الماء المقطر.
  2. وصمة عار الأنوية مع الحل توضع للدقيقة 8
  3. شطف في إدارة مياه الحنفية للحد الأدنى 10
  4. وصمة عار مع الحل ثم للحد الأدنى 2
  5. ديهيدراتي ثلاث مرات لمدة 2 دقيقة في الإيثانول 100% (EtOH). مسح ثلاث مرات لمدة 2 دقيقة في زيلين نفط أو بديل زيلين نفط. جبل في وسط تصاعد المستندة إلى زيلين نفط.
    6. تصوير الشرائح
  6. وقياس قطر كارديوميوسيتي على مستوى النواة في أقسام طولية من حاجز إينتيرفينتريكولار. قياس الخلايا على الأقل 100 كل قسم وثلاثة أقسام للقلب-

4. تلوين وغ

  1. احتضان الشرائح التي تم الحصول عليها من الخطوة 2.7 مع تيتراميثيلرهوداميني (أو الأصباغ الفلورية الأخرى)-مترافق وغ (1: 100 في برنامج تلفزيوني) لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في غرفة رطبة.
  2. يغسل ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق-
  3. جبل مع الأسفار تصاعد الوسائط التي تحتوي على DAPI. مخزن في 4 درجات مئوية في الظلام قبل التحليل-
    تنبيه: ارتداء العين حماية وقفازات مقاومة للمواد الكيميائية متوافقة.
  4. صورة الشرائح.
    1. استخدام مجهر مزودة ببرنامج التحصين الموسع-الإضاءة الفلورية وتصفية مجموعات DAPI وتيتراميثيلرهوداميني (الرجوع إلى الجدول للمواد). تعيين الفتحة إلى الحد الأقصى، وسطوع للتعرض للسيارات-
      2. فصل
    2. الحصول على الصور في 400 x التكبير لقنوات الأحمر والأزرق. فتح الصور في إيماجيج. ضبط السطوع والتباين إذا لزم الأمر (صورة > ضبط > سطوع/تباين).
    3. تعيين كل صورة إلى 8-بت (صورة > نوع > 8 بت). تراكب الصور DAPI ووغ. استخدام القناة الزرقاء DAPI والقناة الحمراء وغ؛ تعيين قنوات الأخضر والرمادي بلا (صورة > لون > دمج القنوات) 31-
  5. تحديد أقطار كارديوميوسيتي على مستوى النواة في مقاطع عرضية من حاجز إينتيرفينتريكولار.
    1. تعريف حجم الصور في إيماجيج. ولهذا الغرض، تصوير كائن معروفة الحجم (مثلاً، دائرة هيموسيتوميتير في التكبير نفسه كأقسام القلب؛ الخطوة 4.4).
    2. استخدام أداة الخط المستقيم لرسم خط من البداية إلى النهاية لهيكل المعروفة (تحليل > تعيين مقياس).
      ملاحظة: سيتم عرض المسافة بالبكسل تلقائياً؛ وسيكون وحدة من طول المسافة المعروفة وإدخالها. المضي قدما مع القياسات كارديوميوسيتي على مستوى النواة-
    3. رسم خط مستقيم من الغشاء وغ الإيجابية من خلال نواة DAPI الإيجابية للموقع الآخر من غشاء الخلية وغ-إيجابية (تحليل > التدبير). في الإطار "نتائج"، تأكد من وجود قيم طول عدد هادفة المواضع العشرية (تحليل > تعيين قياسات > العشرية).
    4. قياس الخلايا على الأقل 100 كل قسم وثلاثة أقسام للقلب. تصدير النتائج إلى Excel (انقر على نتائج > ملف > حفظ ك >.csv) 6 ، 31-

5. بيكم-1 "إيمونوستينينج"

  1. أداء مستضد فضحه.
    1. مل 1,600 إضافة سترات الصوديوم العازلة (سترات الصوديوم 10 ملم، 0.05% 20 توين، pH 6.0) إلى طنجرة الضغط. وضع طنجرة ضغط على هوتبلت وتشغيله على طاقة كاملة. لا تقوم بتأمين غطاء طنجرة ضغط في هذه المرحلة؛ ببساطة ضعه في الأعلى-
      تنبيه: ساخنة!
    2. حالما يغلي المخزن المؤقت سترات الصوديوم، نقل الشرائح من الخطوة 2، 5 إلى طنجرة ضغط. تأمين غطاء طنجرة الضغط. بمجرد أن وصلت طنجرة الضغط الكامل، انتظر دقيقة 7. عندما انقضت دقيقة 7، إيقاف هوتبلت ومكان طنجرة ضغط في المصارف فارغة. تفعيل صمام الإفراج عن الضغط وتشغيل المياه الباردة على موقد. بمجرد أنه قد رفع الضغط، فتح الغطاء وتشغيل المياه الباردة في الطبخ لدقيقة 5 مكان الشرائح في 200 مل من برنامج تلفزيوني.
      ملاحظة: بدلاً من ذلك، فضحه مستضد ميكروويف يمكن استخدامها، على الرغم من أن يزداد خطر الانهاك.
  2. استخدام 0.3% فوق أكسيد الهيدروجين في الميثانول إلى كتلة نشاط البيروكسيديز الذاتية للحد الأدنى 5 شطف الشرائح لثلاث مرات لمدة 2 دقيقة كل في 200 مل من برنامج تلفزيوني.
    تنبيه: القابلة للاشتعال والسامة!
  3. احتضان الشرائح لمدة 15 دقيقة في المخفف العادي حظر المصل (5% مصل الماعز العادي في برنامج تلفزيوني) يحتوي أيضا على كتلة avidin (4 قطرات في 1 مل)-
  4. الاستفادة من السائل من الفروع واحتضانها لهم مع جسم بيكام-1 من الأرانب، وتضعف 01:50 في برنامج تلفزيوني المحتوية على مصل الماعز العادي 2.5% و 4 قطرات من كتلة البيوتين كل مل بعناية. احتضان الشرائح بين عشية وضحاها في دائرة رطبة في 4 ° C.
  5. يغسل ثلاث مرات لمدة 5 دقائق في كل الشرائح في 200 مل من برنامج تلفزيوني. احتضان الفروع مع بيوتينيلاتيد الماعز الأرنب المضادة مفتش جسم المخفف 1: 200 في برنامج تلفزيوني المحتوية على مصل الماعز العادي 2.5% ح 1 في درجة حرارة الغرفة. تغسل ثلاث مرات لمدة 5 دقائق في كل الشرائح في 200 مل من برنامج تلفزيوني.
  6. احتضان tالأقسام أنه مع وجود نظام البيروكسيديز avidin/البيوتين القائم لمدة 20 دقيقة (A كاشف وكاشف ب الحاجة إلى أن تكون مجتمعة 30 دقيقة مسبقة لاستخدام). تغسل ثلاث مرات لمدة 5 دقائق في كل الشرائح في 200 مل من برنامج تلفزيوني.
    7. حل
  7. 1 3,3 '-ديامينوبينزيديني (DAB) وفوق أكسيد الهيدروجين اليوريا 1 قرص في 5 مل الماء المقطر مزدوجة. احتضان الفروع مع الحل الدأب لحوالي 3 دقيقة، رصد التنمية اللون بعناية. وقف رد الفعل اللون بلطف الغسيل الشرائح في 200 مل من برنامج تلفزيوني.
    تنبيه: مسببة للسرطان؛ ارتداء القفازات المقاومة للمواد الكيميائية!
  8. كونتيرستين الأنوية لمدة 6 دقائق مع الهيماتوكسيلين. شطف في إدارة مياه الحنفية للحد الأدنى 2 ديهيدراتي ثلاث مرات لكل 2 دقيقة في 200 مل كحول 100%. قم بمسح كل 200 مل في زيلين نفط أو بديلاً زيلين نفط ثلاث مرات لمدة 2 دقيقة. جبل في وسط تصاعد المستندة إلى زيلين نفط.
  9. تصوير الشرائح (على الأقل عشرة حقول في التكبير 40 x من حاجز إينتيرفينتريكولار من كل قلب) وقياس كثافة منطقة بيكم-1 استخدام البرمجيات ImageJ متاحة بحرية 31. استخدام لون deconvolution 32 المساعد للبث الإذاعي الرقمي وتوضع وضبط تباين الصورة على نفس المستوى-
    ملاحظة: في حالة اللون البنى والأرجواني/الأزرق التداخل الطيفي الكبير، الذي قد يسبب صعوبات مع deconvolution اللون، واحد يمكن أن تحاول ماركات مختلفة توضع حل للحصول على تلطيخ النووية واضحة وأزرق فاتح. وبدلاً من ذلك، يمكن أن يقوم الفلورة أو العد اليدوي من الشعيرات الدموية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

في الشكل 1، تثبت تسجيلات مشخصين الممثل فائدة تخطيط صدى القلب لتحديد تعمل القلب في الفئران المعدلة وراثيا. يمكن بسهولة التعرف على الفرق بين ماوس مع وظيفة القلب العادي (الشكل 1A) وحيوان مع البطين الأيسر المتوسعة وانخفاض وظيفة LV (الشكل 1B). ويبين الشكل 2 مقارنة كارديوميوسيتي قياسات القطر في الحيوانات دون (الشكل 2A) ومع تضخم القلب (

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

وقد وضعت أساليب مختلفة لتقييم هيكل القلب ووظيفة في الفئران، بما في ذلك تخطيط صدى القلب وتعزيز التباين التصوير بالرنين المغناطيسي والصغرى الأشعة المقطعية والحيوانات الأليفة مسح. نظراً للفعالية من حيث التكلفة والبساطة، تخطيط صدى القلب هو الأسلوب الأكثر استخداماً للتحليل الوظيفي في الفئران11. بشكل عام، بسبب صغر حجم القلب وتواتر ارتفاع معدل ضربات القلب في الفئران، ومحولات الطاقة مع تردد > ينبغي أن تستخدم 10 ميجاهرتز، على الرغم من أن قد تم الإبلاغ عن قياسات ناجحة مع 8 أو 9 ميجاهرتز محولات الطاقة

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

العمل تدعمها "الحكومة الفرنسية" (الوكالة الوطنية للبحوث، والوكالة الوطنية للمعلومات) من خلال برنامج "الاستثمار من أجل المستقبل" سيجناليفي لابيكس (مرجع ANR-11-لابكس-0028-01) ومن المنح إلى ك. د. و من الرابطة صب sur la البحوث السرطان، مؤسسة دي فرانس، وخطة Inserm السرطان. د. ب ف أ-تلقي والزمالات من لوس أنجليس من أجل مؤسسة "بحوث ميديكال" ومن مدينة نيس، على التوالي. في اتشوكارديوجراف ومحول تم التكرم المقدمة من شركة فيليبس. ونحن نشكر بوردر ألف وديشتر س.، M. كوتاجار-بوسيرت، لاندوار أ، مارتريس أ، بيانكارديني أ وفاغنر م. س. لمساعداتها التقنية الماهرة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

تقنيات الحياة ، مجهر Philips ، مجموعة مرشحات مجموعة الترشيحات مجموعة الموضعي محطة تضمين البارافين Tissue-Tek VIP شفرات microtome ، شرائح الفحص ، زلات غطاء حاضنة VWR MARI4200005
قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
المترافقة رباعي ميثيل رودامين من جنين القمح (WGA) ، المجسات الجزيئيةW849
الماعز البيوتينيل المضاد للأرانب IgG الأجسام المضادةVectorlabsBA-1000
Avidin / BiotinBlocking Kit VectorlabsSP-2001
VECTASTAIN Elite ABC HRP Kit (بيروكسيداز ، قياسي) VectorlabsPK-6100
وسيط تركيب VECTASHIELD المضاد للبهتان مع DAPIVectorlabsH-1200
SIGMAFAST 3،3'-أقراص ديامينوبنزيدينSigmaD4168
محلول بيروكسيد الهيدروجينSigmaH1009
الأجسام المضادة ل Pecam-1 (CD31)Abcamab28364
جل نقل الموجات فوق الصوتية ، جل أكواسونيك 100باركر
مسبار الموجات فوق الصوتية الخطي ، مخطط صدى القلب L15-7ioPhilips Healthcare
الرعاية الصحيةIE33 xMATRIX
Leica DMi8Leica
DAPILeica11525304
الترشيحات TxRLeica11525310
كاميرا رقمية ، بقعة منزلق ملونة SPOT RT3 برنامج تصوير التصوير
, SPOT 5.2 البرامج المتقدمة والأساسيةالتصوير
التصوير الكمبيوترDell
Fine Scissorsأدوات العلومالدقيقة 14028-10
مقص كبيرأدوات العلومالدقيقة 14501-14
شفرات مشرطأدوات العلوم الدقيقة10023-00
أدوات العلوم الدقيقة من Graefe Falls11650-10
ماكينة حلاقة القوارضHarvard Apparatus34-0243
كاسيت لتضمين البارافينSakura4155F
محايد مخزن FormalinSakura8727
XyleneSakura8733
Paraffine TEK IIISakura4511
جهاز التضمين الآلي ،Sakura6032
Tissue-Tek TEC 5Sakura5229
المجهري Accu-Edge S35Sakura4685
Tissue-TekSakura9533
، Tissue-TekSakura9582
تركيب متوسط Tissue-TekSakura1408
صناديق الشرائحSakura3958
محلول اليوزينSakura8703
محلول الهيماتوكسيلينSakura8711
microtome ، RM2125RTLeica720-1880 (VWR)
حمام مائي ، Leica HI1210Leica720-0113 (VWR)
الإيثانولVWRACRO444220050
أنابيب 15 ملVWR734-0451
طبق زجاجي ملطخVWRبرطمانات تلطيخ MARI4220004
VWR
الموثق9010-0012
أقراص DAB وبيروكسيد الهيدروجين اليوريا ، أقراص SIGMAFAST 3،3 & Prime ؛ أقراص ديامينوبنزيدينSigmaD4293
PBS (10X) 70011044الترمو-فيشر العلمي

المراجع

  1. Ormandy, E. H., Dale, J., Griffin, G. Genetic engineering of animals: ethical issues, including welfare concerns. Can Vet J. 52 (5), 544-550 (2011).
  2. Karl, T., Pabst, R., von Hörsten, S. Behavioral phenotyping of mice in pharmacological and toxicological research. Exp Toxicol Pathol. 55 (1), 69-83 (2003).
  3. Phoon, C. K., Turnbull, D. H. Cardiovascular Imaging in Mice. Curr Protoc Mouse Biol. 6 (1), 15-38 (2016).
  4. Wagner, N., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor beta stimulation induces rapid cardiac growth and angiogenesis via direct activation of calcineurin. Cardiovasc Res. 83 (1), 61-71 (2009).
  5. Wagner, K. D., Vukolic, A., Baudouy, D., Michiels, J. F., Wagner, N. Inducible Conditional Vascular-Specific Overexpression of Peroxisome Proliferator-Activated Receptor Beta/Delta Leads to Rapid Cardiac Hypertrophy. PPAR Res. 2016, 7631085(2016).
  6. Ghanbarian, H., et al. Dnmt2/Trdmt1 as Mediator of RNA Polymerase II Transcriptional Activity in Cardiac Growth. PLoS One. 11 (6), e0156953(2016).
  7. Meguro, T., et al. Cyclosporine attenuates pressure-overload hypertrophy in mice while enhancing susceptibility to decompensation and heart failure. Circ Res. 84 (6), 735-740 (1999).
  8. de Araújo, C. C., et al. Regular and moderate aerobic training before allergic asthma induction reduces lung inflammation and remodeling. Scand J Med Sci Sports. 26 (11), 1360-1372 (2016).
  9. Benavides-Vallve, C., et al. New strategies for echocardiographic evaluation of left ventricular function in a mouse model of long-term myocardial infarction. PLoS One. 7 (7), e41691(2012).
  10. Colazzo, F., et al. Murine left atrium and left atrial appendage structure and function: echocardiographic and morphologic evaluation. PLoS One. 10 (4), e0125541(2015).
  11. Pachon, R. E., Scharf, B. A., Vatner, D. E., Vatner, S. F. Best anesthetics for assessing left ventricular systolic function by echocardiography in mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 308 (12), H1525-H1529 (2015).
  12. Gao, S., Ho, D., Vatner, D. E., Vatner, S. F. Echocardiography in Mice. Curr Protoc Mouse Biol. 1, 71-83 (2011).
  13. Mor-Avi, V., et al. Current and evolving echocardiographic techniques for the quantitative evaluation of cardiac mechanics: ASE/EAE consensus statement on methodology and indications endorsed by the Japanese Society of Echocardiography. J Am Soc Echocardiogr. 24 (3), 277-313 (2011).
  14. Collins, K. A., Korcarz, C. E., Lang, R. M. Use of echocardiography for the phenotypic assessment of genetically altered mice. Physiol Genomics. 13 (3), 227-239 (2003).
  15. Rottman, J. N., Ni, G., Brown, M. Echocardiographic evaluation of ventricular function in mice. Echocardiography. 24 (1), 83-89 (2007).
  16. Hart, C. Y., Burnett, J. C., Redfield, M. M. Effects of avertin versus xylazine-ketamine anesthesia on cardiac function in normal mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 281 (5), H1938-H1945 (2001).
  17. Moran, C. M., Thomson, A. J., Rog-Zielinska, E., Gray, G. A. High-resolution echocardiography in the assessment of cardiac physiology and disease in preclinical models. Exp Physiol. 98 (3), 629-644 (2013).
  18. Fayssoil, A., Tournoux, F. Analyzing left ventricular function in mice with Doppler echocardiography. Heart Fail Rev. 18 (4), 511-516 (2013).
  19. Schoensiegel, F., et al. High throughput echocardiography in conscious mice: training and primary screens. Ultraschall Med. 32, Suppl 1. S124-S129 (2011).
  20. Yariswamy, M., et al. Cardiac-restricted Overexpression of TRAF3 Interacting Protein 2 (TRAF3IP2) Results in Spontaneous Development of Myocardial Hypertrophy, Fibrosis, and Dysfunction. J Biol Chem. 291 (37), 19425-19436 (2016).
  21. Jara, A., et al. Cardiac-Specific Disruption of GH Receptor Alters Glucose Homeostasis While Maintaining Normal Cardiac Performance in Adult Male Mice. Endocrinology. 157 (5), 1929-1941 (2016).
  22. Kerr, B. A., et al. Stability and function of adult vasculature is sustained by Akt/Jagged1 signalling axis in endothelium. Nat Commun. 7, 10960(2016).
  23. Wagner, N., et al. Coronary vessel development requires activation of the TrkB neurotrophin receptor by the Wilms' tumor transcription factor Wt1. Genes Dev. 19 (21), 2631-2642 (2005).
  24. Wagner, K. D., et al. The Wilms' tumour suppressor Wt1 is a major regulator of tumour angiogenesis and progression. Nat Commun. 5, 5852(2014).
  25. Yang, X. P., et al. Echocardiographic assessment of cardiac function in conscious and anesthetized mice. Am J Physiol. 277 (5 Pt 2), H1967-H1974 (1999).
  26. Rottman, J. N., et al. Temporal changes in ventricular function assessed echocardiographically in conscious and anesthetized mice. J Am Soc Echocardiogr. 16 (11), 1150-1157 (2003).
  27. Quiñones, M. A., et al. Recommendations for quantification of Doppler echocardiography: a report from the Doppler Quantification Task Force of the Nomenclature and Standards Committee of the American Society of Echocardiography. J Am Soc Echocardiogr. 15 (2), 167-184 (2002).
  28. van Laake, L. W., et al. Monitoring of cell therapy and assessment of cardiac function using magnetic resonance imaging in a mouse model of myocardial infarction. Nat Protoc. 2 (10), 2551-2567 (2007).
  29. Wagner, K. D., et al. The Wilms' tumor suppressor Wt1 is expressed in the coronary vasculature after myocardial infarction. FASEB J. 16 (9), 1117-1119 (2002).
  30. Wagner, K. D., et al. RNA induction and inheritance of epigenetic cardiac hypertrophy in the mouse. Dev Cell. 14 (6), 962-969 (2008).
  31. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  32. Ruifrok, A. C., Johnston, D. A. Quantification of histochemical staining by color deconvolution. Anal Quant Cytol Histol. 23 (4), 291-299 (2001).
  33. Lazzeroni, D., Rimoldi, O., Camici, P. G. From Left Ventricular Hypertrophy to Dysfunction and Failure. Circ J. 80 (3), 555-564 (2016).
  34. Ismail, J. A., et al. Immunohistologic labeling of murine endothelium. Cardiovasc Pathol. 12 (2), 82-90 (2003).
  35. Benton, R. L., Maddie, M. A., Minnillo, D. R., Hagg, T., Whittemore, S. R. Griffonia simplicifolia isolectin B4 identifies a specific subpopulation of angiogenic blood vessels following contusive spinal cord injury in the adult mouse. J Comp Neurol. 507 (1), 1031-1052 (2008).
  36. Ayoub, A. E., Salm, A. K. Increased morphological diversity of microglia in the activated hypothalamic supraoptic nucleus. J Neurosci. 23 (21), 7759-7766 (2003).
  37. Maddox, D. E., Shibata, S., Goldstein, I. J. Stimulated macrophages express a new glycoprotein receptor reactive with Griffonia simplicifolia I-B4 isolectin. Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (1), 166-170 (1982).
  38. dela Paz, N. G., D'Amore, P. A. Arterial versus venous endothelial cells. Cell Tissue Res. 335 (1), 5-16 (2009).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

M Pecam 1
دراسة مورفولوجيا القلب مشخصين وغذائها في الماوس
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.