الزخرفة البروتينات النشطة بيولوجيا أو الببتيدات على استخدام الكيمياء الضوئية للتطبيقات البيولوجية المائية

Summary

في هذا الأسلوب، ونحن نستخدم فوتوبوليميريزيشن وتقنيات الكيمياء انقر لإنشاء أنماط البروتين أو الببتيد على السطح من البولي إيثيلين غليكول (شماعة) الهلاميات المائية، توفير معطلة إشارات النشطة بيولوجيا لدراسة الاستجابات الخلوية في المختبر .

Abstract

وهناك العديد من المحفزات البيولوجية التي يمكن أن تؤثر على التمييز بين السلوك والخلايا الجذعية خلية. خلية عامة الثقافة نهج الاعتماد على العوامل القابلة للذوبان داخل وسيلة للتحكم في سلوك الخلية. ومع ذلك، لا يمكن تقليد الإضافات القابلة للذوبان بعض إشارات زخارف، مثل ربط مصفوفة عوامل النمو، مما يشير إلى خلية خلية، والرموز البيوكيميائية المكانية، التي تعد شائعة التأثيرات على الخلايا. وعلاوة على ذلك، الخصائص الفيزيائية للمصفوفة، مثل صلابة الركازة، دوراً هاما في مصير الخلية، الذي هو عدم التلاعب بسهولة باستخدام الخلية التقليدية استزراع الممارسات. في هذا الأسلوب، يصف لنا بروتوكولا مباشرة لتوفير البروتينات النشطة بيولوجيا منقوشة في الهلاميات المائية الاصطناعية البولي إثيلين غليكول (الربط) باستخدام الكيمياء الضوئية. يسمح هذا البرنامج لمراقبة مستقلة الركازة صلابة والإشارات البيوكيميائية المكانية. يمكن تحقيق هذه الهلاميات المائية طائفة كبيرة من قيم صلابة فسيولوجيا ذات الصلة. بالإضافة إلى ذلك، أسطح هذه الهلاميات المائية يمكن أن تكون فوتوباتيرنيد مع الببتيدات النشطة بيولوجيا أو البروتينات عبر شرق ثيول انقر الكيمياء ردود الفعل. لقد تم تحسين هذه الأساليب الاحتفاظ بوظيفة البروتين بعد التثبيت السطحي. هذا هو بروتوكول تنوعاً التي يمكن تطبيقها على أي بروتين أو ببتيد من اهتمام لإنشاء مجموعة متنوعة من أنماط. وأخيراً، يمكن رصد خلايا المصنف على أسطح هذه الهلاميات المائية النشطة بيولوجيا مع مرور الوقت كما أنها تستجيب لإشارات محددة مكانياً.

Introduction

وهناك العديد من المنبهات التي تؤثر على سلوك الخلية. وبصفة عامة، تقنيات تثقيف الخلية النموذجية تعتمد على العوامل القابلة للذوبان الحصول على ردود الخلوية؛ ومع ذلك، هناك قيود على هذا النهج. هذه الأساليب غير قادر على دقة عرض جميع زخارف الإشارات شيوعاً وجدت المجراة في. وتشمل هذه الآليات مما يشير إلى المنحاة عوامل النمو، مما يشير إلى خلية خلية، والإشارات البيوكيميائية محددة مكانياً. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تلعب دوراً مهما في التمييز بين السلوك والخلايا الجذعية خلية صلابة الركيزة وهو عدم التلاعب بسهولة باستخدام المشتركة خلية تثقيف الممارسات^1،2. النهج مادة بيولوجية توفر منصة جديدة البدء في استكشاف آليات هذه ا....

Protocol

1-"إعداد مواد" لتوليف Hydrogel

1. تحضير حلول الأسهم بيجدا والليثيوم فينيل-2,4,6-تريميثيلبينزويلفوسفيناتي (LAP) فيبرونيكتين تحت ظروف معقمة واستنادا إلى العمليات الحسابية (الجدول 1A).
   1. تزن وتذوب المركبات في المحلول الملحي مخزنة الفوسفات (PBS). بشكل عام، الحفاظ على بيجدا العامل تركيزات الحل بين 50 و 200 مغ/مل (5-20% وزن/حجم). "الماصة؛" الحل بيجدا من خلال عامل تصفية حقنه 0.22 ميكرومتر للتعقيم.
      ملاحظة: تبقى الحلول بيجدا مغطاة بإحباط التفاف لحمايتهم من الضوء. إعداد حل بيجدا (مستحسن) لكل تجربة جديدة-
   مسحوق
   2. إعادة فيبرونيكتين البروتين استناداً إلى الشركة المصنعة ' التوصية s. الحفاظ على الحل فيبرونيكتين الأسهم في 1 ملغ/مل،....

Results

بروتوكول لإنشاء أنماط النشطة بيولوجيا على سطح الوتد الهلاميات المائية يتضح في الشكل 1. ووضع جدول لحساب حجم وتركيز لكل حل الأسهم (الجدول 1 ألف). يتم تعديل البروتينات تكون معطلة على السطح المائية مع 2-إيمينوثيولاني (الشكل 1ب). رد الفعل هذا يتم استخدام وحدات التخزين من الجدول 1 باء. الحل المائية السلائف مستعدة مع 10% وزن/حجم بيجدا مع اللفة (الشكل 1

Discussion

هذا البروتوكول يوفر طريقة لإنشاء أنماط البروتينات النشطة بيولوجيا للتطبيقات البيولوجية. وهناك عدة التعديلات التي يمكن إجراؤها على التكيف مع هذا البروتوكول لتجارب مختلفة. أولاً، سوف تختلف متطلبات مرفق الخليوي لأنواع مختلفة من الخلايا. إذا كان من الملاحظ في البداية مرفق خلية الفقيرة إلى المواد الهلامية، ينصح زيادة تركيز البروتين ECM داخل الحل السلائف. يمكن أن تستخدم بروتينات ECM الأخرى بدلاً من فيبرونيكتين، بما في ذلك أنواع مختلفة من الكولاجين، لامينين، أو مزيج منها. لكل نوع من الخلايا الجديدة، ينبغي أن يكون الأمثل مرفق خل.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
يمكن أيضا تصنيع PEG-diacrylate (PEGDA)	Laysan Bio	ACRL-PEG-ACRL-3400	أو شراؤها من خلال بائعين آخرين. يمكن استخدام أوزان جزيئية مختلفة.
ليثيوم فينيل -2،4،6-ثلاثي ميثيل بنزويل فوسفينات (LAP)			يتم تصنيعه في المختبر
فيبرونيكتين	كورنينج	356008	يمكن استخدام بروتينات أخرى مرفقة للخلايا ، مثل اللامينين ، المحلول
الملحي المخزن بالفوسفات (PBS)	Sigma	D8537-500ML
	Photomask FineLine Imaging	n / a	مطبوعات مخصصة على صفائح شفافة بدقة DPI عالية.
مقاطع الموثق مختلف	البائعين
مصدر ضوء الأشعة فوق البنفسجية المضغوط (365 نانومتر) يمكن	استخدام مصادر		ضوء الأشعة فوق البنفسجية الأخرى ، ومعايرة الطاقة مطلوبة.
2-إيمينوثيولان (بيرس تراوت كاشف)	Thermo Sci.	26101
إلمان s الكاشف: DTNB ؛ 5،5-dithio-bis (2-حمض النيتروبنزويك) Thermo	Sci.	22582
الخلايا البطانية للوريد السري البشري (HUVECs)	لونزا		بين 6-10
EGM-2 Media	Lonza	CC31-56 و CC-3162	EGM-2 بدون عوامل النمو في التجارب. تم استخدام وسائط EGM-2 الكاملة لصيانة الخلية
0.25٪ Trypsin EDTA	Life Tech	25200-056
Trypsin Neutralizer	Life Tech	R-002-100
أجهزة طرد مركزي	مختلفة للبائعين مقياس
الدم	Hausser Sci. خط ساطع
حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA)	سيجما ألدريتش	E6758
0.22 ومايكرو ؛ م مرشح	خلية علاج	229743
1 مل حقنة
زجاجية مجهر شرائح	فيشر علمي.	12-550C
فواصل	بلاستيكية بائعين مختلفين		سمك 0.5 مم
70٪ إيثانول	BICCA	2546.70-1
درع حيوي	بيولوجي	19-150-0010
كاشف برادفورد   ؛	BIO-RAD
- Sephadex G-25	GE Healthcare	95016-754
Microspin Columns	Thermo Sci.	PI69725
AR-G2 أدوات إعادة التسخين	TA