Method Article

الزخرفة البروتينات النشطة بيولوجيا أو الببتيدات على استخدام الكيمياء الضوئية للتطبيقات البيولوجية المائية

DOI:

10.3791/55873

⸱

September 15th, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Rensselaer Polytechnic Institute, 2Center for Biotechnology and Interdisciplinary Studies, Rensselaer Polytechnic Institute, 3Department of Bioengineering, Northeastern University, 4Department of Bioengineering, University of Texas at Arlington

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذا الأسلوب، ونحن نستخدم فوتوبوليميريزيشن وتقنيات الكيمياء انقر لإنشاء أنماط البروتين أو الببتيد على السطح من البولي إيثيلين غليكول (شماعة) الهلاميات المائية، توفير معطلة إشارات النشطة بيولوجيا لدراسة الاستجابات الخلوية في المختبر .

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وهناك العديد من المحفزات البيولوجية التي يمكن أن تؤثر على التمييز بين السلوك والخلايا الجذعية خلية. خلية عامة الثقافة نهج الاعتماد على العوامل القابلة للذوبان داخل وسيلة للتحكم في سلوك الخلية. ومع ذلك، لا يمكن تقليد الإضافات القابلة للذوبان بعض إشارات زخارف، مثل ربط مصفوفة عوامل النمو، مما يشير إلى خلية خلية، والرموز البيوكيميائية المكانية، التي تعد شائعة التأثيرات على الخلايا. وعلاوة على ذلك، الخصائص الفيزيائية للمصفوفة، مثل صلابة الركازة، دوراً هاما في مصير الخلية، الذي هو عدم التلاعب بسهولة باستخدام الخلية التقليدية استزراع الممارسات. في هذا الأسلوب، يصف لنا بروتوكولا مباشرة لتوفير البروتينات النشطة بيولوجيا منقوشة في الهلاميات المائية الاصطناعية البولي إثيلين غليكول (الربط) باستخدام الكيمياء الضوئية. يسمح هذا البرنامج لمراقبة مستقلة الركازة صلابة والإشارات البيوكيميائية المكانية. يمكن تحقيق هذه الهلاميات المائية طائفة كبيرة من قيم صلابة فسيولوجيا ذات الصلة. بالإضافة إلى ذلك، أسطح هذه الهلاميات المائية يمكن أن تكون فوتوباتيرنيد مع الببتيدات النشطة بيولوجيا أو البروتينات عبر شرق ثيول انقر الكيمياء ردود الفعل. لقد تم تحسين هذه الأساليب الاحتفاظ بوظيفة البروتين بعد التثبيت السطحي. هذا هو بروتوكول تنوعاً التي يمكن تطبيقها على أي بروتين أو ببتيد من اهتمام لإنشاء مجموعة متنوعة من أنماط. وأخيراً، يمكن رصد خلايا المصنف على أسطح هذه الهلاميات المائية النشطة بيولوجيا مع مرور الوقت كما أنها تستجيب لإشارات محددة مكانياً.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وهناك العديد من المنبهات التي تؤثر على سلوك الخلية. وبصفة عامة، تقنيات تثقيف الخلية النموذجية تعتمد على العوامل القابلة للذوبان الحصول على ردود الخلوية؛ ومع ذلك، هناك قيود على هذا النهج. هذه الأساليب غير قادر على دقة عرض جميع زخارف الإشارات شيوعاً وجدت المجراة في. وتشمل هذه الآليات مما يشير إلى المنحاة عوامل النمو، مما يشير إلى خلية خلية، والإشارات البيوكيميائية محددة مكانياً. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تلعب دوراً مهما في التمييز بين السلوك والخلايا الجذعية خلية صلابة الركيزة وهو عدم التلاعب بسهولة باستخدام المشتركة خلية تثقيف الممارسات1،2. النهج مادة بيولوجية توفر منصة جديدة البدء في استكشاف آليات هذه الإشارات. على وجه الخصوص، هي الهلاميات المائية المرشحين ممتازة لضبط الركازة صلابة3،4، شل البروتينات والببتيدات5،6، وخلق أنماط محددة مكانياً7، 8.

الهلاميات المائية تستخدم عادة السقالات في هندسة الأنسجة بسبب تلك القواسم المشتركة الفيزيائية والكيميائية الحيوية مع9،المصفوفة خارج الخلية (ECM)10. البوليميرات الطبيعية هي الخيارات الشائعة للسقالات، كما أنها متوافق حيويا وتوجد في العديد من أنسجة الجسم. الحد من استخدام البوليميرات الطبيعية كركائز أنها تفتقر إلى مويتيس الكيميائية بسهولة التلاعب بها بيوكونجوجيشن. من ناحية أخرى، الهلاميات المائية الاصطناعية، على هذا النحو، ربط، منصات ممتازة لكيمياء المستهدفة11،12. بالإضافة إلى ذلك، عدم الحصول على رد خلوية شماعة الهلاميات المائية ولذلك تستخدم كالعمود الفقري خاملة لإنشاء السقالات النشطة بيولوجيا.

لإنشاء الهلاميات المائية النشطة بيولوجيا، انقر فوتوبوليميريزيشن وشرق ثيول الكيمياء يعملون من ردود الفعل. وتتطلب هذه فوتوريكشنز فوتوينيتياتور ومصدر ضوء الأشعة فوق البنفسجية. عندما يتم عرض فوتوينيتياتورس للأشعة فوق البنفسجية، كسر السندات بشكل الجذور. الجذور أطروحات اللازمة للشروع في رد فعل ولكن يمكن أن يؤثر سلبا على بروتين بيواكتيفيتي12،13. ولذلك، من الأهمية بمكان لتحسين فوتوينيتياتور ومرات التعرض للأشعة فوق البنفسجية للحفاظ على بيواكتيفيتي البروتين.

في هذا الأسلوب، يتم توليفها الهلاميات المائية عن طريق أكريلاتي-أكريلاتي سلسلة فوتوبوليميريزيشن النمو. مونومرات شماعة-دياكريلاتي (بيجدا) تتفاعل مع بعضها البعض لتشكيل البوليمر تشعبت الشبكات المسؤولة عن هيكل المائية. سوف تحكم تركيز بيجدا مونومرات داخل الحل السلائف جل صلابة الركازة. سبب الصغيرة المساحة المائية المسام، وبروتينات ECM مثل فيبرونيكتين يمكن إدراجها بسهولة داخل المائية غرض مرفق خلية. أخيرا، يمكن أن تكون هذه الهلاميات المائية السطحية منقوشة مع الببتيدات النشطة بيولوجيا أو البروتينات عن طريق ثيول-شرق انقر فوق الكيمياء ردود الفعل. هنا، سترد الممتص ثيوريا مجاناً داخل المنظومة المائية مع ثيولس الحرة الموجودة على بروتين أو ببتيد عند تعريضه للأشعة فوق البنفسجية. بعد هي معطلة بالبروتينات أو الببتيدات على سطح المائية، يمكن تخزين المائية عند 4 درجة مئوية لعدة أسابيع دون أن تفقد بيواكتيفيتي. وهذا يوفر راحة ومرونة التخطيط التجريبية، وإمكانية التعاون بين مختبرات. عموما، هذا النظام الأساسي يسمح للنشاط الحيوي والمكانية البيوكيميائية السيطرة، مستقلة عن بعضها البعض، لإتاحة الفرصة للتأثير على سلوك الخلوية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1-"إعداد مواد" لتوليف Hydrogel

  1. تحضير حلول الأسهم بيجدا والليثيوم فينيل-2,4,6-تريميثيلبينزويلفوسفيناتي (LAP) فيبرونيكتين تحت ظروف معقمة واستنادا إلى العمليات الحسابية (الجدول 1A).
    1. تزن وتذوب المركبات في المحلول الملحي مخزنة الفوسفات (PBS). بشكل عام، الحفاظ على بيجدا العامل تركيزات الحل بين 50 و 200 مغ/مل (5-20% وزن/حجم). "الماصة؛" الحل بيجدا من خلال عامل تصفية حقنه 0.22 ميكرومتر للتعقيم.
      ملاحظة: تبقى الحلول بيجدا مغطاة بإحباط التفاف لحمايتهم من الضوء. إعداد حل بيجدا (مستحسن) لكل تجربة جديدة-
      2. مسحوق
    2. إعادة فيبرونيكتين البروتين استناداً إلى الشركة المصنعة ' التوصية s. الحفاظ على الحل فيبرونيكتين الأسهم في 1 ملغ/مل، اليكووت إلى 60 إلى 100 ميليلتر مختبرين، وتخزينها في-20 درجة مئوية حتى الاستخدام. تذويب مختبرين في 4 درجات مئوية لعدة ساعات أو بين عشية وضحاها قبل استخدامها. إذا لم يتم توفير مخزون البروتين فعلا في ظروف معقمة، استخدم عامل تصفية حقنه 0.22 ميكرومتر للتعقيم.
      ملاحظة: يتم استخدام فيبرونيكتين لمرفق خلية. يمكن أن يكون محل أخرى بروتينات ECM.
    3. تزن باللفة لحل الأسهم وحله في برنامج تلفزيوني؛ وتركز أسهم نموذجي 25 ملغ/مل. Sonicate إذا كان هناك أي مشكلة مع حل. تمرير الحل من خلال عامل تصفية 0.22 ميكرومتر للتعقيم. تغطية اللفة مع التفاف إحباط وإبقائه عند 4 درجة مئوية لتصل إلى عدة أشهر.
      ملاحظة: اللفة هو فوتوينيتياتور تستخدم في الكيمياء الضوئية-
  2. إعداد قوالب الشرائح الزجاجية عقيمة لتشكيل هيدروجيل. ورقة
    1. اﻷوتوكﻻف بوليستر؛ واحد مطلوب لكل جل العفن. نقع شريحتين من الزجاج والفواصل البلاستيكية الثلاثة (0.5 مم) لكل العفن جل في الإيثانول 70% على الأقل من 2 ح، ولكن عموما تسمح لهم بنقع بين عشية وضحاها. ينقع خمس مقاطع الموثق لكل العفن جل في الإيثانول 70% قبل 10 دقيقة لاستخدام-
    2. وضع الشرائح الزجاجية، والفواصل، ومقاطع الموثق في ورقة يعقم صغيرة في هود ثقافة الخلية السماح لهم بالهواء الجاف لعدة ساعات-
    3. تحضير قوالب المائية عن طريق وضع الفواصل البلاستيكية حول حافة شريحة الزجاج. مكان الشريحة الزجاجية الثانية في الأعلى. تأمين الفواصل محكم بجوار بعضها البعض مع مقاطع الموثق، اثنان على كل جانب طويل وواحد في الأعلى-
      ملاحظة: إذا كان هذا لا تجمع بشكل صحيح، حل جل سوف يتسرب.
    4. تعقيم سطح القالب مع خلية ثقافة هود ضوء قبل 30 دقيقة استخدام الأشعة فوق البنفسجية. في منتصف الطريق من خلال، الوجه العفن لفضح كل الأسطح.

2. تعديل البروتينات مع "ثيول الحر"

  1. إعداد حلول الأسهم باستخدام حسابات من جدول البيانات لتحويل أمين ثيول على بروتينات (الجدول 1A). ضبط برنامج تلفزيوني على درجة الحموضة 8
    1. لجعل رد فعل المخزن المؤقت، وإضافة 5 مم يدتا. ماصة رد فعل المخزن المؤقت عامل تصفية حقنه 0.22 ميكرومتر للتعقيم.
      ملاحظة: يدتا الهامة، كما أنه يحمي ثيولس من تشكيل ثنائي كبريتيد السندات. جماعات ثيول يجب أن تظل في شكلها مخفضة لرد فعل يحدث.
    2. تزن من 2-إيمينوثيولاني (تراوت ' s الكاشف) وحل ذلك في رد فعل المخزن المؤقت لتركيز حل أسهم 2 مغ/مل (14 مم). تمرير الحل من خلال عامل تصفية حقنه 0.22 ميكرومتر للتعقيم. تخزين حل الأسهم عند 4 درجة مئوية لتصل إلى عدة أشهر.
      ملاحظة: 2-إيمينوثيولاني هو الجزيء الذي يتفاعل مع الأمينات الحرة المعرضة للمذيبات في البروتينات وتحويلها إلى ثيولس الحرة-
    3. تشكيل البروتين في رد فعل المخزن المؤقت بتركيز بين 0.1 و 1 ملغ/مل. ما لم تكن عقيمة سابقا، "الماصة؛" هذا الحل من خلال عامل تصفية حقنه 0.22 ميكرومتر للتعقيم.
      ملاحظة: هذا البروتين هو الإشارات البيوكيميائية التي سوف تكون منقوشة على سطح المائية. أيضا، في حين يمكن أن تتباين تركيزات البروتين، تركيزات أعلى تعتبر مثالية لأنماط البروتين أقوى.
  2. رد فعل البروتين مع 2-إيمينوثيولاني بخلط كل الحلول الأسهم معا؛ واستخدام الجدول 1 باء لحساب نسبة حجم الصحيح. عادة، تستخدم نسبة مولى من 8:1 2-إيمينوثيولاني للبروتين-
    ملاحظة: للبروتينات أكبر أو أكثر تمييع التركيزات، استخدام نسبة مولى أعلى من 2-إيمينوثيولاني. أرجع إلى الشركة المصنعة ' s البروتوكول 15-
  3. احتضان رد فعل ح 1 في درجة حرارة الغرفة. استخدام desalting تدور الصغرى-عمود لإزالة المنتج البروتين ثيولاتيد من كواشف مختبر المتبقية، عقب الشركة المصنعة ' s بروتوكول 16-
    ملاحظة: هو حد استبعاد هذا الراتنج كاتشين 5.
  4. استخدام Ellman ' s الاعتداء إلى قياس كمي عدد ثيولس مجاناً للبروتين. تتبع الشركة المصنعة ' بروتوكول s ل المقايسة 17-

3. تشكيل هيدروجيل

  1. إنشاء الحل السلائف جل استناداً إلى القيم المحسوبة من الجدول 1. مزيج معا بيجدا، فيبرونيكتين، وأحجام اللفة. "الماصة؛" الحل بقوة لضمان حل متجانسة، ولكن تجنب خلق الفقاعات. يبقى الحل محمية من الضوء.
  2. "الماصة؛" حل جل السلائف بعناية بين الشرائح الزجاجية اثنين من العفن هلام. عادة، بإضافة وحدة تخزين بين 800 و 1000 ميليلتر للعفن. يعرض حل جل في القالب للأشعة فوق البنفسجية (الطول الموجي: 365 نانومتر، السلطة: 3-4 ميغاواط/سم 2) لمدة 1-2 دقيقة لتشكيل المائية.
    ملاحظة: لا تعرض المائية لفترة طويلة على ضوء الأشعة فوق البنفسجية، كما أنه سيحد من البروتين السطحي الزخرفة قدرات.
  3. تقلع مقاطع الموثق وإزالة الشرائح الزجاجية أعلى بلطف بتطبيق مقابل الضغط على الفواصل الجانب الثاني-
    4. استخدام
  4. لكمه خزعة حجم مناسب لقطع العينات المائية. لكمه من أصل الهلاميات المائية متعددة من المستطيل جل لتكون بمثابة replicates والتحكم في عينات-

4. القياسات المائية صلابة

  1. لكمه من الهلاميات المائية مع 8 مم خزعة لكمه رهيوميتير لوحة موازية 8 مم. تحميل عينة المائية واحدة في رهيوميتير (انظر الجدول للمواد)-
  2. السفلي هندسة اللوحة مواز هو 8 ملم في القطر حتى صنع اتصال مع سطح الهلام. الاحتفاظ بمسافة 0.5 مم لنموذج 0.5 mm سميكة المائية فجوة.
  3. الاحتلالات وقت تنفيذ لمدة 5 دقائق في سلالة 0.1% و 0.1 هرتز التردد، و 37 ° متوسط جيم ز ' القيم عبر اكتساح كل الوقت. تشغيل الهلاميات المائية المستقلة ل replicates لكل تشكيل.
    ملاحظة: ز ' يجب أن تكون القيم ثابتة عبر النقاط الزمنية؛ إذا فليست، يجهد في المئة وينبغي أن يقوم تواتر عمليات التمشيط لتحديد المناسبة قيم 14-

5. الزخرفة البروتين

  1. تحضير النمط المطلوب النبائط باستخدام برنامج تصميم (CAD) الحاسوب. طباعة النبائط على ورقة شفافة باستخدام طابعة ذات دقة عالية. نقع النبائط في الإيثانول 70% عن 10 دقيقة قبل الاستخدام. تسمح النبائط الهواء الجاف في غطاء ثقافة خلية قبل استخدام.
  2. إضافة حل البروتين ثيولاتيد إعدادها في الخطوة 2 إلى السطح للمائية للزخرفة السطحية. "الماصة؛" 1-2 ميليلتر/سم 2 ثيولاتيد حل البروتين على سطح كل جل خفض التدريجي.
    ملاحظة: من المهم للتقليل من حجم البروتين؛ إضافة فقط ما يكفي لتغطية كامل سطح العينة المائية بالتساوي.
  3. بعناية مكان النبائط على سطح المائية. عدم السماح بفقاعات الهواء بين النبائط والسطح المائية. اضغط برفق على القناع لإزالة أي فقاعات هذا الشكل.
  4. فضح المائية إلى جولة ثانية من ضوء الأشعة فوق البنفسجية (الطول الموجي: 365 نانومتر، السلطة: 3-4 ميغاواط/سم 2) على 30-60 س.
    ملاحظة: من المهم أن تعرض النمط لضوء الأشعة فوق البنفسجية ما يكفي لخلق نمط قوية دون التسبب في فقدان وظيفة البروتين.
    5. أغسل
  5. الهلاميات المائية مع برنامج تلفزيوني لإزالة الأنواع الممتص ومكان كل المائية داخل اللوحة جيدا. كن حذراً عند وضع المواد الهلامية في كل بئر؛ تأكد من أن السطح منقوشة على الوجه حتى. غسل المواد الهلامية في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية؛ المواد الهلامية مستقرة لمدة أسبوعين على الأقل في 4 ° C.

6. تحضير الهلاميات المائية "بذر خلية"

  1. احتضان المواد الهلامية في متوسطة القاعدية لمدة 5-10 دقيقة عند 37 درجة مئوية قبل البذر. للخلايا البطانية البشرية الوريد السري (هوفيكس)، استخدم المتوسطة EGM-2 دون عوامل النمو. التقليل من حجم المتوسط إضافة إلى كل جيدا لمنع المائية العائمة. لوحة 48، حسنا، استخدام وحدة تخزين 250 ميليلتر من المتوسطة.
    2. ز
  2. تدور أسفل اللوحة في 300 x لمدة 3 دقيقة لضمان أن الهلاميات المائية تقع في الجزء السفلي من البئر ولا تطفو. القيام بذلك قبل البذر الخلية مباشرة.

7. خلية استمطار في الهلاميات المائية

  1. استخدام خلايا الثدييات العقيمة القياسية الثقافة إجراءات خلية البذر وإجراءات تجريبية. إزالة هوفيكس من قوارير زراعة الأنسجة باستخدام البروتوكولات القياسية خلية مفرزة. أغسل طبق استنبات الأنسجة مع PBS العقيمة واحتضان مع التربسين لمدة 3-5 دقيقة في 37 درجة مئوية.
  2. إخماد تعليق خلية تريبسينيزيد مع الخلايا الزائدة المتوسطة أو التربسين حل التعادل.
  3. معين باستمرار تعليق خلية في أجهزة الطرد المركزي في 300 x ز 5 كحد أدنى بعناية إزالة المادة طافية وإبقاء بيليه الخلية.
  4. ريسوسبيند بيليه الخلية في EGM القاعدية-2 مع أية عوامل النمو. استخدام هيموسيتوميتير لخلية العد.
  5. 75,000 إضافة خلايا/سم 2 لكل المائية السطحية التي بيبيتينج ببطء إلى مركز كل جيدا حتى لا يؤدي إلى الإخلال بالمواد الهلامية. ضع لوحة جيدا إلى حاضنة ثقافة خلية عند 37 درجة مئوية. لعدة أيام، بشكل دوري إزالة الطبق للمراقبة-

8. تقييم بيواكتيفيتي

  1. الثقافة كولاي بين عشية وضحاها في تعليق في مرق رطل في وقف مداري في 37 درجة مئوية و 200 لفة في الدقيقة. تدور أسفل ثقافة كولاي وصب وتشكيل خلية بيليه في حجم الحد الأدنى من برنامج تلفزيوني. تزن بها lysozyme وإعادة تشكيل في 1 ملغ/مل لحل الأسهم.
  2. "الماصة؛" كمية صغيرة (25 ميليلتر) الحل lysozyme المخزون في أنابيب ميكروسينتريفوجي. إضافة مستويات متفاوتة من اللفة فوتوينيتياتور (0-12 ملم) وعرض العينات إلى 1 دقيقة للأشعة فوق البنفسجية. في مجموعة منفصلة، بإضافة نفس الكمية من اللفة (2 مم) إلى الحل lysozyme وفضح عينات في أوقات متباينة في ضوء الأشعة فوق البنفسجية (0-4 دقيقة). وتشمل replicates لكل معاملة.
  3. حجم مركزة كولاي متساوية إضافة إلى حل لكل عينة lysozyme لتركيز بروتين lysozyme نهائي من 0.5 ملغ/مل. تبني الحلول المختلطة بشأن ح 4 في درجة حرارة الغرفة-
    ملاحظة: يسمح هذا الوقت ل lysozyme الوظيفية جدار الخلية البكتيرية والإفراج عن البروتينات في الحل-
  4. استخدام غير المعالجة lysozyme المحتضنة مع كولاي لعنصر تحكم إيجابية؛ والنظر في هذا قياس النشطة بيولوجيا 100%. استخدم الحل lysozyme المحتضنة مع برنامج تلفزيوني وحدها كعنصر سلبي.
  5. تدور أسفل العينات لإزالة الحطام خلية وإبقاء المادة طافية. تشغيل مقايسة برادفورد لقياس التركيز الكلي للبروتين داخل المادة طافية قياس كمية البكتيريا ليساتي.
    6. تشغيل
  6. مقايسة برادفورد بعد الشركة المصنعة ' s البروتوكول 18. حساب إضعاف التغيير في تركيز البروتين مقارنة بمراقبة سلبية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بروتوكول لإنشاء أنماط النشطة بيولوجيا على سطح الوتد الهلاميات المائية يتضح في الشكل 1. ووضع جدول لحساب حجم وتركيز لكل حل الأسهم (الجدول 1 ألف). يتم تعديل البروتينات تكون معطلة على السطح المائية مع 2-إيمينوثيولاني (الشكل 1ب). رد الفعل هذا يتم استخدام وحدات التخزين من الجدول 1 باء. الحل المائية السلائف مستعدة مع 10% وزن/حجم بيجدا مع اللفة (الشكل 1

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذا البروتوكول يوفر طريقة لإنشاء أنماط البروتينات النشطة بيولوجيا للتطبيقات البيولوجية. وهناك عدة التعديلات التي يمكن إجراؤها على التكيف مع هذا البروتوكول لتجارب مختلفة. أولاً، سوف تختلف متطلبات مرفق الخليوي لأنواع مختلفة من الخلايا. إذا كان من الملاحظ في البداية مرفق خلية الفقيرة إلى المواد الهلامية، ينصح زيادة تركيز البروتين ECM داخل الحل السلائف. يمكن أن تستخدم بروتينات ECM الأخرى بدلاً من فيبرونيكتين، بما في ذلك أنواع مختلفة من الكولاجين، لامينين، أو مزيج منها. لكل نوع من الخلايا الجديدة، ينبغي أن يكون الأمثل مرفق خل...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كانت هذه الدراسة أساسا بدعم من المنح المقدمة من "جمعية القلب الأمريكية عالم التنمية المنحة" (12SDG12050083 إلى G.D.)، المعاهد الوطنية للصحة (R21HL102773، R01HL118245 إلى G.D.) والمؤسسة الوطنية للعلوم (كبة-1263455 و CBET-1350240 إلى G.D.).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
يمكن أيضا تصنيع PEG-diacrylate (PEGDA)Laysan BioACRL-PEG-ACRL-3400أو شراؤها من خلال بائعين آخرين. يمكن استخدام أوزان جزيئية مختلفة.
ليثيوم فينيل -2،4،6-ثلاثي ميثيل بنزويل فوسفينات (LAP)يتم تصنيعه في المختبر
فيبرونيكتينكورنينج356008يمكن استخدام بروتينات أخرى مرفقة للخلايا ، مثل اللامينين ، المحلول
الملحي المخزن بالفوسفات (PBS)SigmaD8537-500ML
Photomask FineLine Imagingn / aمطبوعات مخصصة على صفائح شفافة بدقة DPI عالية.
مقاطع الموثق مختلفالبائعين
مصدر ضوء الأشعة فوق البنفسجية المضغوط (365 نانومتر) يمكناستخدام مصادرضوء الأشعة فوق البنفسجية الأخرى ، ومعايرة الطاقة مطلوبة.
2-إيمينوثيولان (بيرس تراوت كاشف)Thermo Sci.26101
إلمان s الكاشف: DTNB ؛ 5،5-dithio-bis (2-حمض النيتروبنزويك) ThermoSci.22582
الخلايا البطانية للوريد السري البشري (HUVECs)لونزابين 6-10
EGM-2 MediaLonzaCC31-56 و CC-3162EGM-2 بدون عوامل النمو في التجارب. تم استخدام وسائط EGM-2 الكاملة لصيانة الخلية
0.25٪ Trypsin EDTALife Tech25200-056
Trypsin NeutralizerLife TechR-002-100
أجهزة طرد مركزيمختلفة للبائعين مقياس
الدمHausser Sci. خط ساطع
حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA)سيجما ألدريتشE6758
0.22 ومايكرو ؛ م مرشحخلية علاج229743
1 مل حقنة
زجاجية مجهر شرائحفيشر علمي.12-550C
فواصلبلاستيكية بائعين مختلفينسمك 0.5 مم
70٪ إيثانولBICCA2546.70-1
درع حيويبيولوجي19-150-0010
كاشف برادفورد   ؛BIO-RAD
- Sephadex G-25GE Healthcare95016-754
Microspin ColumnsThermo Sci.PI69725
AR-G2 أدوات إعادة التسخينTA
تم استخدام رقم مرور راتنج تحلية

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yao, S., et al. Co-effects of matrix low elasticity and aligned topography on stem cell neurogenic differentiation and rapid neurite outgrowth. Nanoscale. 8 (19), 10252-10265 (2016).
  2. Evans, N. D., et al. Substrate stiffness affects early differentiation events in embryonic stem cells. Eur Cells Mater. 18, 1-13 (2009).
  3. Ye, K., et al. Matrix Stiffness and Nanoscale Spatial Organization of Cell-Adhesive Ligands Direct Stem Cell Fate. Nano Lett. 15 (7), 4720-4729 (2015).
  4. Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
  5. Sridhar, B. V., Doyle, N. R., Randolph, M. A., Anseth, K. S. Covalently tethered TGF-beta1 with encapsulated chondrocytes in a PEG hydrogel system enhances extracellular matrix production. J Biomed Mater Res A. 102 (12), 4464-4472 (2014).
  6. Salinas, C. N., Anseth, K. S. Decorin moieties tethered into PEG networks induce chondrogenesis of human mesenchymal stem cells. J Biomed Mater Res A. 90 (2), 456-464 (2009).
  7. Joddar, B., Guy, A. T., Kamiguchi, H., Ito, Y. Spatial gradients of chemotropic factors from immobilized patterns to guide axonal growth and regeneration. Biomaterials. 34 (37), 9593-9601 (2013).
  8. Wylie, R. G., Ahsan, S., Aizawa, Y., Maxwell, K. L., Morshead, C. M., Shoichet, M. S. Spatially controlled simultaneous patterning of multiple growth factors in three-dimensional hydrogels. Nat Mater. 10 (10), 799-806 (2011).
  9. Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnol Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).
  10. Lutolf, M. P., Hubbell, J. A. Synthetic biomaterials as instructive extracellular microenvironments for morphogenesis in tissue engineering. Nat Biotechnol. 23 (1), 47-55 (2005).
  11. Saik, J. E., Gould, D. J., Keswani, A. H., Dickinson, M. E., West, J. L. Biomimetic hydrogels with immobilized ephrinA1 for therapeutic angiogenesis. Biomacromolecules. 12 (7), 2715-2722 (2011).
  12. McCall, J. D., Anseth, K. S. Thiol-ene photopolymerizations provide a facile method to encapsulate proteins and maintain their bioactivity. Biomacromolecules. 13 (8), 2410-2417 (2012).
  13. Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility. Biomaterials. 29 (6), 997-1003 (2009).
  14. Zuidema, J. M., Rivet, C. J., Gilbert, R. J., Morrison, F. A. A protocol for rheological characterization of hydrogels for tissue engineering strategies. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 102 (5), 1063-1073 (2014).
  15. Truat's Reagent Instructions. Thermo Scientific. , Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/.../MAN0011238_Trauts_Reag_UG.pdf (2017).
  16. Ellman's Reagent Instructions. Thermo Scientific. , Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0011216_Ellmans_Reag_UG.pdf (2017).
  17. Desalting Columns. GE Life Sciences. , Available from: https://www.gelifesciences.com/gehcls_images/GELS/Related%20Content/Files/1478781880316/litdoc52130800_2016111034421.pdf (2017).
  18. Quick State Bradford Reagent Protein Assay, Instruction Manual. Bio-Rad. , Available from: http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/4110065A.pdf (2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Hydrogel PatterningPhotochemistry TechniqueBioactive ProteinsPEG HydrogelsThiol ene ChemistrySubstrate StiffnessSpatial CuesProtein ImmobilizationCell MigrationVEGF Patterning

Related Articles