الأسلوب الحالي يساعد على تحديد isoform خاصة مثبطات هيستون ديسيتيلاسيس (هداك) في خلايا هيلا بتحليل أوهبلك--مرض التصلب العصبي المتعدد من ركائز متعددة. هذا أسلوب خال من الأجسام المضادة ليعكس النشاط HDAC1 و HDAC6 في المعيشة البيئة الخلية، على النقيض من فحوصات خالية من خلية واحدة-إيسوفورم.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
قياس واحد من HDAC1 والنشاط HDAC6 في الحلة الخلايا باستخدام أوهبلك--مرض التصلب العصبي المتعدد
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
البحث عن جديد هيستون deacetylase (هداك) مثبطات زيادة الاهتمام باكتشاف العقاقير. تم الانتقائية Isoform في دائرة الضوء منذ الموافقة على روميديبسين، فئة أنا هداك مثبط لعلاج السرطان، والتحقيق السريرية من مثبطات HDAC6 محددة للورم النخاعي المتعدد. يتم استخدام الأسلوب الحالي لتحديد النشاط المثبطة لاختبار المركبات في HDAC1 و HDAC6 في الخلايا. ويقاس النشاط isoform استخدام فائقة الأداء اللوني السائل – تحليل الطيف الكتلي (أوهبلك مللي ثانية) من ركائز محددة المحتضنة مع خلايا هيلا المعالجة وغير المعالجة. ويمتاز الأسلوب يعكس النشاط هداك الذاتية داخل بيئة الخلية، على عكس الخلية الحرة البيوكيميائية فحوصات أجريت على isoforms معزولة. وعلاوة على ذلك، لأنه يقوم على التحديد الكمي لركائز الاصطناعية، الطريقة لا تتطلب الاعتراف بالضد من البروتينات أسيتيلاتيد الذاتية. أنها قابلة للتكيف بسهولة إلى عدة خطوط الخلايا وعملية تلقائية. وقد أثبتت الأسلوب مفيداً في إيجاد مركبات HDAC6 انتقائية في نيوروبلاستس. وترد النتائج الممثلة هنا بمعيار هداك مثبطات تريتشوستاتين (غير محددة)، MS275 (HDAC1 الخاصة)، وتوباستاتين (HDAC6-محدد) باستخدام خلايا هيلا.
المقدمة
هداكس تنتمي إلى عائلة من الإنزيمات قادرة على ديسيتيلاتي هيستونيس داخل الهيكل الكروماتين. كما لدى غيرها ركائز البروتين سيتوسول وتقع في مختلف أقسام الخلية. إجمالي 18 هداك isoforms أنه تم التعرف حتى الآن وقد تم تتصل عدة آليات الخلية، بما في ذلك تنظيم عوامل النسخ والتعبير الجيني، فضلا عن إشارات الخلية والنقل1،2،3،،من45،،من67. مثبطات الحفاز هداك ظهرت كالعقاقير العلاجية المحتملة لعلاج السرطان. معظم مثبطات هداك معتمدة حاليا من قبل إدارة الأغذية ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1-خلية ثقافة
ملاحظة: يتم تنفيذ الخطوات التالية في غطاء زراعة الأنسجة قياسية. ومن المتوقع الإلمام بتقنية العقيمة.
- الثقافة خلايا هيلا إلى كونفلوينسي 80% في قارورة ثقافة الخليوي T75 في MEM تستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين، البنسلين G (100 U/mL)، وستربتوميسين (100 مغ/مل).
ملاحظة: الخلية الثقافة والعلاج، وتحلل خطوات تجري تحت الاندفاق الصفحي، مع الخلية خطوات الحضانة عند 37 درجة مئوية في جو هوميديفيد من 5% CO2 تحت ظروف معقمة. - تغسل الخلايا مرتين مع 5 مل دببس ونضح في دببس وإضافة 1 مل كاشف تفكك الخلية. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لفصل الخلايا.
- إضافة 9 مل من ذاكرة الثقافة المتوسطة ودقة ريسوسبيند تعلي....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تثبت تطبيق الأسلوب على تحديد مثبطات انتقائية وغير انتقائي ل HDAC1 (الفئة الأولى) و HDAC6 (الفئة IIb)، خلايا هيلا تعامل مع المركبات القياسية المعروفة: تريتشوستاتين A (غير انتقائية بين HDAC1 و HDAC6)18، MS275 (HDAC1-الانتقائية المانع)19، وتوباستاتين (مثبط انتقائي HDAC6)20. باستخدام هذا الأسلوب (الشكل 1)، IC50 قيم يمكن أن مباشرة تحددها في الخلايا الحية ل HDAC1 (بالنظر إلى ديسيتيلي.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تثبيط هداك موضوع ساخن في اكتشاف المخدرات، مع تركيز الحالي على مثبطات HDAC6 الانتقائي ل علاج السرطان21. عادة ما يتم تقييم الانتقائية هداك بسلسلة من فحوصات الفائق، والخلية الحرة، التي تنوي تحديد فاعلية مثبطة نحو الفردية هداك isoforms21. ولكن انتقائية المانع يجب بالإضافة إلى ذلك تأكيد في الخلايا الحية بتقييم وضع ركائز البروتين الذاتية، مثل هيستونيس أسيتيلاتيون (للفئة الأولى هداكس) وتوبولين (ل HDAC6). ولذلك، الخلية فحوصات التي تنطوي على الاعتراف بجسم (مثلاً، إيمونوستين.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
شكر وتقدير
الكتاب نعترف بتكلفة العمل CM1406 (البيولوجيا الكيميائية جينية). وأيد البحث عنها في هذا المنشور الأساس ميرسييه بيير.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| BATCP | سيجما ألدريتش | B4061 | |
| MAL | سيجما ألدريتش | SCP0168 | مرادف: BOC-Ac-Lys-AMC |
| MOCPAC | سيجما ألدريتش | M2195 | |
| MS275 | سيجما ألدريتش | EPS002 | |
| تريكوستاتين | إيه سيجما ألدريتش | T8552 | |
| توباستاتين | سيجما ألدريتش | SML0044 | |
| الأسيتونيتريل ، حمض | 10660131 | فيشر | |
| HPLC ، LC / MS الصف | فيشر | Scientific 10596814 | |
| H2< / sub>O ، HPLC | مقطر بدرجة H2< / sub>O تمت ترشيحه من خلال نظام تنقية Milli-Q | ||
| الكاشف TrypLE Express | ThermoFisher Scientific | 12604013 | |
| DMSO ، درجة زراعة الخلايا | Applichem | 146463 | |
| DPBS | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
| مصل الأبقار الجنيني | Biowest | S1810 | |
| MEM | ThermoFisher Scientific | 22561021 | |
| البنسلين الستربتومايسين | Bioconcept | 4-01F00-H | |
| 10x RIPA buffer | Abcam | ab156034 | |
| أقراص مثبطات البروتياز السريع | Sigma-Aldrich | S8820 | |
| ألواح 96 بئر ، معقمة ، مسطحة القاع ، معالجة ثقافة الأنسجة Corning | VWR | 29442-058 | |
| ألواح 96 بئر ، غير معقمة ، V-bottom Corning | VWR | 29442-404 | المستخدمة في خطوة الطرد المركزي |
| صفيحة 96 بئر ، قاع مخروطي ، 249944 Nunc | ThermoFisher Scientific | متوافقة مع نظام Acquity UHPLC | |
| قوارير ثقافة الخلايا T75 Corning | Sigma-Aldrich | CLS430641 | |
| رقائق الختم الحراري القابلة للنزع | المياه | 186002789 | |
| نظام Acquity UPLC | Waters | ||
| Eppendorf الطرد المركزي 5810 R | Fisher Scientific | 05-413-323 | |
| برنامج التكامل: MassLynx V4.1 | Waters | رقم الكتالوج غير متوفر | |
| Combi thermo-sealer SP-0669/240 | Waters | رقم الكتالوج غير متوفر | |
| Quattro micro API Tandem Quadrupole System | Waters | كتالوج |
المراجع
- Arrowsmith, C. H., Bountra, C., Fish, P. V., Lee, K., Schapira, M. Epigenetic protein families: a new frontier for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 11 (5), 384-400 (2012).
- Henikoff, S., Greally, J. M. Epigenetics, cellular memory and gene regulation. Curr Biol. 26 ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
