مقالة منهجية

الوقت الفاصل بين التصوير متحد البؤر من الخلايا العصبية المهاجرة في شريحة عضوي نمط ثقافة الفأر الجنينية باستخدام الدماغ

11K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/55886

⸱

يوليو 25, 2017

 ,  ,  , 
1Institute of Molecular and Cellular Anatomy, Ulm University

في هذه المقالة

ملخص

يوفر هذا البروتوكول تعليمات للمراقبة المباشرة من الخلايا العصبية القشرية هجرة شعاعيا. في إليكتروبوراتيون الرحم ، يتم دمج ثقافة شريحة عضوي النمط، والوقت الفاصل بين التصوير متحد البؤر لدراسة مباشرة وديناميكية آثار أوفيركسريسيون أو دونريغولاتيون من الجينات التي تهم في الخلايا العصبية المهاجرة وتحليل التمايز أثناء التنمية.

الملخص

في الرحم إليكتروبوراتيون هو نهج سريع وقوي لدراسة عملية الهجرة شعاعي في القشرة المخية لتطوير الأجنة الماوس. وقد ساعدت على وصف مختلف خطوات الهجرة شعاعي وتوصيف الآليات الجزيئية السيطرة على هذه العملية. لتحليل الخلايا العصبية المهاجرة مباشرة وديناميكية يجب أن تعزى على مر الزمن. يصف هذا البروتوكول سير العمل الذي يجمع بين إليكتروبوراتيون الرحم مع ثقافة شريحة عضوي النمط والوقت الفاصل بين التصوير متحد البؤر، والذي يسمح لفحص مباشر وتحليل ديناميكي من الخلايا العصبية القشرية هجرة شعاعيا. وعلاوة على ذلك، توصيف مفصل من الخلايا العصبية المهاجرة، مثل سرعة الهجرة، وملامح السرعة، وكذلك التغيرات التوجه شعاعي، هو ممكن. طريقة يمكن بسهولة أن تتكيف لأداء تحليلات وظيفية من الجينات التي تهم في الخلايا العصبية القشرية تهاجر شعاعيا عن طريق فقدان وكسب وظيفة فضلا عن تجارب الإنقاذ. الوقت الفاصلالتصوير من الخلايا العصبية المهاجرة هو للدولة من بين الفن التقنية التي أنشئت مرة واحدة هو أداة قوية لدراسة تطور القشرة المخية في نماذج الماوس من اضطرابات الهجرة العصبية.

المقدمة

القشرة المخية الجديدة هي الموقع الرئيسي للوظائف الإدراكية والعاطفية والحسية. وهو يتألف من ست طبقات أفقية موجهة بالتوازي مع سطح الدماغ. خلال الخلايا السلف التنمية في الجدار الجانبي من تلسينيفالون الظهرية تؤدي إلى الخلايا العصبية الإسقاط التي تهاجر شعاعيا نحو سطح بيال واكتساب هوية طبقة محددة الخلايا العصبية. بعد أن يتم إنشاؤها في المناطق البطين / البطين (ف / سفز) هذه الخلايا العصبية تصبح متعددة الأقطاب عابرة وبطيئة هجرتها. بعد إقامة قصيرة في المنطقة المتوسطة (إيز) أنها تتحول إلى مورفولوجيا القطبين، نعلق على سقالة الدبقية شعاعي، ومواصلة الهجرة شعاعي المنحى في لوحة القشرية (كب). عند الوصول إلى الهدف النهائي إسقاط الخلايا العصبية فصل من العمليات الدبقية شعاعي واكتساب هوية طبقة محددة. الطفرات في الجينات التي تؤثر على خطوات مختلفة من هجرة الخلايا العصبية يمكن أن يسبب تشوه قشري شديد، مثل ليسنسشفويا أو المادة البيضاء تغاير 1 ، 2 .

في الرحم إليكتروبوراتيون هو تقنية سريعة وقوية ل ترانسفيكت الخلايا السلف العصبية في الدماغ النامية من الأجنة القوارض 3 ، 4 . مع هذه التقنية فمن الممكن لضربة قاضية و / أو أوفيركسريس الجينات ذات الاهتمام من أجل دراسة وظائفها في تطوير الخلايا العصبية. وقد ساعدت هذه الطريقة على وجه التحديد لوصف التفاصيل المورفولوجية وتوصيف الآليات الجزيئية لعملية الهجرة شعاعي 5 ، 6 ، 7 ، 8 ، 9 . الخلايا العصبية المهاجرة شعاعيا تخضع لتغييرات ديناميكية في شكل الخلية، وسرعة الهجرة، وكذلك الاتجاه المهاجرة، والتي تتطلب المراقبة المباشرة والمستمرة مع مرور الوقت. شريحة أورغانوتيبيك كولتووإعادة التصوير الفاصل الزمني متحد البؤر من العقول إليكتروبوراتد تسمح لمراقبة مباشرة الخلايا العصبية المهاجرة مع مرور الوقت. باستخدام هذا النهج مجتمعة، فمن الممكن لتحليل سمات متميزة من الخلايا العصبية المهاجرة التي لا يمكن التحقيق في أقسام الأنسجة الثابتة من العقول إليكتروبوراتد.

طبقنا مؤخرا الفاصل الزمني التصوير متحد البؤر من الخلايا العصبية المهاجرة في شرائح شريحة من العقول إليكتروبوراتد لدراسة دور عامل النسخ B خلية كل / سرطان الغدد الليمفاوية 11A (Bcl11a) خلال التنمية القشرية 10 . يتم التعبير عن Bcl11a في الشباب الخلايا العصبية القشرية المهاجرة واستخدمنا متحولة أليل Bcl11a أليل ( Bcl11a فلوكس ) 11 لدراسة وظائفها. إليكتروبوراتيون من كري ريكومبيناس جنبا إلى جنب مع بروتين الفلورسنت الأخضر (غفب) في الأسلاف القشرية من Bcl11a أدمغة فلوكس / فلوكس سمح لنا لخلق حالة متحولة الفسيفساء، والتي يتم تحوير عدد قليل من الخلايا فقط فيخلاف ذلك البرية من نوع الخلفية. وبهذه الطريقة، كان من الممكن لدراسة وظائف مستقلة الذاتي الخلية من Bcl11a على مستوى الخلية واحدة. وجدنا أن الخلايا العصبية الطافرة Bcl11a عرض سرعة منخفضة، والتحولات في ملامح السرعة، وكذلك تغييرات تشبه العشوائية أثناء هجرتها 10 . في بروتوكول المبين وصفنا سير العمل لنجاح إليكتروبوراتيون وشريحة إعداد الثقافة 12 من أدمغة الماوس، فضلا عن الوقت الفاصل بين التصوير متحد البؤر من الثقافات شريحة القشرية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة على جميع الإجراءات التجريبية من قبل لجنة رعاية الحيوان (ريجيرونسبراسيديوم توبينجن) ونفذت وفقا لقانون رعاية الحيوان الألماني والتوجيه الأوروبي 2010/63 / الاتحاد الأوروبي.

1. في أوتيرو إليكتروبوراتيون

  1. ميكروينجكتيون الإبر
    1. سحب الشعيرات الدموية الزجاج البورسليكات (القطر الخارجي: 1.0 مم، القطر الداخلي: 0.58 مم، طول: 100 ملم) في إبر حقن ميكروينجكتيون باستخدام مجتذب ميكروبيبيت مع خيوط مربع (2.5 ملم × 2.5 مم) والبرنامج التالي: هيت: 540، سحب : 125، السرعة: 20، والتأخير: 140. تحديد قيمة هيت لكل خيوط الفردية عن طريق إجراء اختبار رامب (هيت القيمة: رامب + 25).
    2. إبر شطبة في زاوية 38 درجة وسرعة عالية إلى المتوسطة مع ميكروغريندر للحصول على حجم تلميح من 20 إلى 30 ميكرون للحقن في يوم الجنينية (E) 13.5 أو أصغر و 30 إلى 40 ميكرون للحقن في الجنينية الأكبر سنامراحل. للتخزين، إصلاح الإبر في مربع أو طبق بتري مع النمذجة الطين لمنع الأضرار التي لحقت النصائح.
  2. حل الحمض النووي البلازميد
    1. إعداد البلازميد دنا بناء يحتوي على بروتين الفلورسنت مراسل (على سبيل المثال غفب) باستخدام مجموعة إعداد ماكسي خالية من الذيفان الداخلي وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
    2. تمييع حل الحمض النووي البلازميد إلى تركيز النهائي من 1 - 2 ميكروغرام / ميكرولتر في عازلة خالية من الذيفان الداخلي تريس-إدتا تحتوي على الأخضر السريع في تركيز النهائي من 0.01٪. حل قسامة ومخزن في -20 درجة مئوية.
  3. حل كلوريد الصوديوم البكتيري
    1. إعداد محلول كلوريد الصوديوم الجراثيم بإضافة الكحول البنزيل إلى تركيز النهائي من 0.9٪ إلى متساوي التوتر 0.9٪ محلول كلوريد الصوديوم. محلول مرشح العقيمة مباشرة قبل الاستخدام.
  4. كاربروفين حقن الحل
    1. إعداد حل حقن كاربروفين من قبلمضيفا كاربروفين إلى تركيز النهائي من 0.5 ملغ / مل إلى معقمة متساوي التوتر 0.9٪ محلول كلوريد الصوديوم. تخزين في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 28 يوما.
  5. التخدير، حقن الحمض النووي، إليكتروبوراتيون
    1. وزن E14.5 توقيت الحوامل الماوس ووضعه في غرفة تخدير شفافة متصلة المرذاذ والمشبعة مع 5٪ إيسوفلوران. عندما يكون الحيوان هو فاقد الوعي، ونقله إلى قناع تخدير تعلق على لوحة درجة حرارة 37 درجة مئوية والاحتفاظ بها تخدير مع 1.8 - 2.2٪ إيسوفلوران.
      ملاحظة: تقييم تطوير التخدير الجراحي عن طريق فقدان ذيل قرصة وردود الفعل دواسة (أخمص القدمين قرصة).
    2. لتسكين، وحقن 100 ميكرولتر من محلول حقن كاربروفين لكل 10 ملغ من وزن الجسم الماوس (5 ملغ / كغ من وزن الجسم) تحت الجلد. بدوره الماوس مع تراجعها وتغطية بعناية العينين مع هلام البترول لمنعهم من التجفيف.
    3. انتشر بلطف أطرافه وإصلاحهاإلى لوحة الاحترار مع الشريط الجراحي. تعقيم البطن مع الايثانول 70٪ تليها محلول اليود (7.5 ملغ / مل) باستخدام مسحات السليلوز. كرر هذا الإجراء ثلاث مرات لضمان التطهير السليم.
    4. تغطية البطن مع الشاش المعقم الذي تم قطع شق لتجنيب حقل (قطر: 2 - 2.5 سم) لشق البطن. رطوبة الشاش مع محلول كلوريد الصوديوم الجراثيم.
      الحذر: إعادة تقييم تطوير التخدير الجراحي عن طريق فقدان دواسة رد الفعل.
    5. باستخدام ميكرو أدسون ملقط (مسننة، طول: 12 سم) ومقص غرامة (الزاوية إلى الجانب، طول: 9 سم) قطع الجلد حوالي 1.5 سم على طول خط الوسط من البطن. قطع العضلات الكامنة على طول ألبا لينيا.
    6. إزالة قرن واحد الرحم مع ملقط حلقة (طول: 9 سم، القطر الخارجي: 3 ملم، القطر الداخلي: 2.2 ملم) ووضع بلطف على الشاش مبلل.
      الحذر: عقد قرن الرحم مع ملقط حلقة فقط بين الأجنةد لا تزعج المشيمة أو أي سفن الإمداد. الحفاظ على الرحم رطبة في جميع الأوقات مع محلول كلوريد الصوديوم الجراثيم.
    7. وضع بعناية الجنين مع ملقط حلقة وتحديد البطين الجانبي، الذي يعرض على شكل الهلال مواز الظل إلى الجيب السهمي. يقع موقع الحقن تقريبا في منتصف خط بين العين المصطبغة والتقارب من الجيوب الأنفية، حيث فروع الجيوب الأنفية السهمي إلى اثنين من الجيوب الأنفية عرضية. دفع إبرة حقن مكروي من خلال جدار الرحم وإلى البطين الجانبي.
      ملاحظة: إذا لزم الأمر، وعمق الحقن يمكن تصحيحها عن طريق تراجع الإبرة.
    8. حقن 1 إلى 2 ميكرولتر من محلول الحمض النووي في البطين الجانبي مع ميكروينجيكتور، الذي يتم تشغيله مع دواسة القدم، وذلك باستخدام الإعدادات التالية: 25 رطل لكل بوصة مربعة، 10 إلى 20 مللي ثانية لكل نبضة، و 5 إلى 10 نبضات. حقن ناجحة يمكن رصدها من قبل حل الحمض النووي الملونة، التي ينبغي أن تملأ نظام البطين.
    9. وضع أقطاب ملقط من نوع (قطر 3 ملم ل E13.5 أو أصغر و 5 مم قطر ل E14.5 أو أكثر) في مثل هذه الطريقة أن محطة "إيجابية" على نفس الجانب البطين حقن و "السلبية" محطة على الجانب الآخر من البطين حقن تحت الأذن من رأس الجنين.
    10. ترطيب الموقع إليكتروبوراتيون مع بضع قطرات من محلول كلوريد الصوديوم كلوريد الجراثيم وتطبيق 5 نبضات التيار الكهربائي (35 V ل E13.5 أو أصغر و 40 V ل E14.5 أو أكثر) من مدة 50 مللي ثانية مع فترات 950 مللي ثانية.
      ملاحظة: التيارات من 60 إلى 90 مللي أمبير وعادة ما تكون كافية لنجاح إليكتروبوراتيون. فإن التيارات المنخفضة لا ترانزفيكت كفاءة الخلايا العصبية، في حين أن التيارات العالية قد تؤدي إلى الموت الجنيني.
    11. كرر الإجراء (سف الخطوة 1.5.7 إلى 1.5.10.) لكل جنين من قرن الرحم ووضع بلطف مرة أخرى في تجويف البطن.
    12. إزالة قرن الرحم من الجانب الآخر وتكرار بروكوصفها في الخطوة 1.5.7. إلى 1.5.11.
    13. إغلاق تجويف البطن عن طريق خياطة طبقة العضلات قبل خياطة الجلد باستخدام مايكرو أدسون ملقط، ماثيو حامل إبرة (كربيد التنغستن، طول: 14 سم)، وخياطة الجراحية غير قابلة للامتصاص (3/8 دائرة، 13 ملم، نقطة تفتق).
      الحذر: يجب الحرص على عدم التقاط الرحم أو أي أجهزة أخرى أثناء خياطة.
    14. تطهير بعناية خياطة الجلد مع محلول اليود (7.5 ملغ / مل) وإزالة بلطف بيريوسولار الزائدة من هلام البترول باستخدام مسحات السليلوز. ضع الماوس تحت مصباح الأشعة تحت الحمراء حتى يستيقظ. مراقبة الماوس عن كثب خلال اليومين المقبلين. كرر العلاج تسكين كما هو موضح في الخطوة 1.5.2 بعد 12-24 ساعة.

2. أورغانوتيبيك شريحة الثقافة

  1. لامينين الأسهم الحل
    1. حل 1 ملغ من لامينين مجفف بالتجميد في الماء المعقم للحصول على محلول الأسهم لامينين 1 ملغ / مل. إعداد 50 أليكوتس ميكرولتر أند مخزن في -80 درجة مئوية.
  2. بولي L- ليسين الأسهم الحل
    1. حل 50 ملغ من بولي L- يسين في الماء المعقم للحصول على محلول مخزون بولي L-ليسين 1 ملغ / مل. إعداد 0.5 مل أليكوتس وتخزينها في -20 درجة مئوية.
  3. استكمال الحل الملح المتوازن هانك (هبس كاملة)
    1. إعداد هبس كاملة من خلال الجمع بين 50 مل من حل هبس 10X، 1.25 مل من 1 M هيبيس العازلة (الرقم الهيدروجيني 7.4)، 15 مل من 1 M حل الجلوكوز، 5 مل من محلول كلوريد الكالسيوم 100 ملي، 5 مل من 100 ملي سلفات المغنيسيوم الحل، و 2 مل من 1 M الصوديوم محلول كربونات الهيدروجين. إضافة الماء العقيمة تصل إلى 0.5 لتر، مرشح معقم، وتخزينها في 4 درجات مئوية.
  4. شريحة الثقافة المتوسطة
    1. الجمع بين 35 مل من بسال النسر المتوسط ​​(بمي)، 12.9 مل كاملة هبس (راجع القسم 2.3.1)، 1.35 مل من 1 M D- الجلوكوز، 0.25 مل من 200 ملي الجلوتامين، و 0.5 مل من البنسلين الستربتومايسين إلى الحصول على 50 مل من شريحة الثقافةمتوسط. تصفية معقمة وإضافة مصل الحصان إلى تركيز النهائي من 5٪. تخزين في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 4 أسابيع.
  5. نقطة انصهار منخفضة (لمب) أغاروس الحل
    1. إعداد 3٪ لمب الاغاروز حل عن طريق إذابة 1.5 غرام من الاغاروز لمب في 50 مل من هبس كاملة عن طريق التسخين في فرن الميكروويف لمدة 1-2 دقائق في قوة وسيطة.
      ملاحظة: مراقبة الحرارة بعناية لمنع تجاوز خلال الغليان.
    2. مكان الحل في حمام مائي في 38 درجة مئوية حتى جاهزة للاستخدام. تخزين في 4 درجات مئوية وإعادة استخدامها مرة واحدة.
  6. طلاء غشاء إدراجات
    1. إضافة قسامة واحدة من محلول الأسهم لامينين (سف الخطوة 2.1.1) وقسامة واحدة من محلول الأسهم بولي L- يسين (سف الخطوة 2.2.1) إلى 6 مل من الماء المعقم للحصول على حل طلاء (بما فيه الكفاية لمدة 6 إدراج) .
    2. وضع إدراج غشاء في لوحة 6 جيدا تحتوي على 2 مل من الماء المعقم في الجزء السفلي من كل بئر. إضافة 1 مل من حل الطلاء(سف الخطوة 2.6.1.) على رأس كل غشاء واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية و 5٪ جو ثاني أكسيد الكربون.
      ملاحظة: فقط استخدام إدراج مع أغشية واضحة بصريا، مثل بوليتيترافلورثيلين (بتف) غشاء.
    3. غسل الأغشية ثلاث مرات مع 1 مل من الماء المعقم والجافة. استخدام الأغشية المغلفة في نفس اليوم أو تخزينها في لوحة نظيفة 6-جيدا في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أربعة أسابيع.
  7. تشريح الدماغ والتضمين
    1. بعد يومين من إليكتروبوراتيون وضع الماوس في غرفة شفافة متصلة المرذاذ والمشبعة مع 5٪ إيسوفلوران. عندما يكون الحيوان فاقد الوعي، وإزالته من الغرفة والتضحية به عن طريق خلع عنق الرحم.
    2. إزالة الرحم التي تحتوي على الأجنة ووضعه في طبق بتري 10 سم مع الجليد الباردة كاملة هبس.
      ملاحظة: من هذه النقطة فصاعدا إبقاء جميع الحلول والأجنة، والعقول على الجليد.
    3. استخدام ستيريوميكروسكوب، ملقط غرامة يميل (مباشرة،11 سم) وزوج من فاناس توبينجن مقص الربيع (الزاوية يصل، طول: 9.5 سم) لفصل كل جنين من الرحم ونقله إلى طبق بتري آخر يحتوي على الجليد الباردة كاملة هبس.
    4. إجراء شق على مستوى جذع الدماغ وقطع على طول خط الوسط السهمي. قشر بعيدا عن الجلد والغضاريف التي تغطي الدماغ. ثم، وقطع الجذعية الدماغ الحق وراء نصفي الكرة الأرضية وإزالة الدماغ من الجمجمة. نقل الدماغ مع ملعقة ملعقة صغيرة (185 ملم × 5 ملم) إلى لوحة 12 جيدا تحتوي على الجليد الباردة كاملة هبس. جمع كل العقول من القمامة في لوحة 12 جيدا.
    5. استخدام ستيريوميكروسكوب الفلورسنت لفحص العقول في لوحة 12 جيدا للسطوع مضان وكذلك حجم المنطقة إليكتروبوراتد. حدد 2 إلى 4 العقول مع إشارات الفلورسنت مشرق في القشرة الحسية الجسدية المفترضة لمزيد من المعالجة.
    6. صب 3٪ لمب حل الاغاروز أبقى في 38 درجة مئوية في قشر بعيدا المتاح تضمين القالب. ازالتهاه الدماغ من لوحة 12 جيدا مع ملعقة ملعقة صغيرة واستنزاف بعناية الزائدة كامل هبس حول الدماغ باستخدام ورقة الأنسجة الجميلة.
    7. وضع الدماغ بلطف في حل الاغاروز، ودفعه إلى الجزء السفلي من القالب، وضبط بعناية موقفها باستخدام إبرة قياس 20. لأقسام الاكليلية، وتوجيه الدماغ مع لمبات حاسة الشم لافتا صعودا. الحفاظ على العفن على الجليد حتى يتم عزز الحل الاغاروز والاستمرار مع باجتزاء الدماغ.
  8. فيبراتوم سيكتيونينغ و شريحة الثقافة
    1. إزالة كتلة الاغاروز من القالب ووضعه على غطاء طبق بتري العقيمة. تقليم بعيدا الاغاروز الزائدة مع شفرة حلاقة نظيفة ترك ما يقرب من 2 إلى 3 ملم تحت لمبات الشم و 1 ملم من الاغاروز على الجانبين الآخرين. إصلاح كتلة أغاروس قلص مع لمبات الشم يشير لأسفل إلى مرحلة العينة باستخدام الغراء سيانوكريلات.
      ملاحظة: تعقيم الأدوات والمعدات مع الايثان 70٪l قبل باجتزاء.
    2. نقل مرحلة العينة إلى غرفة تشريح من مشراح شفرة تهتز تحتوي على الجليد الباردة كاملة هبس ووضع الدماغ مع الجانب الظهري نحو شفرة. قطع 250 ميكرون شرائح الدماغ سميكة تحتوي على المنطقة إليكتروبوراتد مع سعة منخفضة إلى معتدلة من 0.9 ملم وسرعة بطيئة جدا بطيئة من 0.09-0.12 مم / ثانية. عادة يتم الحصول على شرائح 4 إلى 6 مع إشارة الفلورسنت مشرق من كل الدماغ إليكتروبوراتد بنجاح.
    3. مع ملعقة ميكرو ملعقة عازمة وملقط غرامة يميل، ونقل بعناية شرائح الدماغ مع الاغاروز المحيطة إلى لوحة 6 جيدا تحتوي على الجليد الباردة كاملة هبس.
      الحذر: يجب الحرص على عدم إلحاق الضرر في أنسجة المخ عن طريق لمس فقط حافة الاغاروز حول المقاطع مع ملقط أثناء نقل.
    4. معالجة جميع العقول المحددة كما هو موضح في الخطوات 2.8.1. إلى 2.8.3.
    5. رطبة إدراج غشاء مع 100 ميكرولتر من هبس كاملة قبل وضع سي الدماغإيسس على الأغشية لتسهيل تحديد المواقع من شرائح. ما يصل إلى 5 شرائح يمكن وضعها على 1 غشاء إدراج.
    6. نقل بعناية شرائح على الأغشية باستخدام ملعقة ميكرو ملعقة عازمة وملقط غرامة يميل. سحب بلطف شريحة على ملعقة فقط عن طريق لمس حافة الاغاروز مع ملقط ودفع بلطف شريحة من ملعقة على الغشاء. ضع شريحة باستخدام ملقط والاستمرار في نقل شرائح المتبقية. إزالة هبس كامل الزائد مع ماصة.
      ملاحظة: لا تتداخل الشرائح مع بعضها البعض.
    7. مع مساعدة من ملقط بعناية وضع إدراج الغشاء مع شرائح في لوحة 6 جيدا تحتوي على 1.8 مل من وسط ثقافة شريحة (سف الخطوة 2.4.1) واحتضان عند 37 درجة مئوية و 5٪ من الغلاف الجوي ثاني أكسيد الكربون حتى مرور الوقت التصوير.

3. الوقت الفاصل بين التصوير

  1. إعداد المجهر
    1. تعيين غرفة المناخ وضعت على خشبة المسرحمقلوب متحد البؤر المجهر إلى 37 درجة مئوية و 5٪ جو ثاني أكسيد الكربون. استخدام كاشف الهجين للحد من كثافة الليزر وتحسين بقاء الخلية. لتحليل مفصل، استخدم مسافة عمل طويلة جدا 40X الهدف الجاف مع فتحة عددية من 0.6 أو أعلى.
      ملاحظة: جميع مكونات المجهر تحتاج إلى أن تكون قبل تحسنت إلى 37 درجة مئوية لمدة 2 - 3 ساعة قبل التصوير لتوفير التركيز مستقرة خلال عملية التصوير.
  2. شريحة التصوير
    1. حدد شريحة الدماغ للتصوير من لوحة 6 جيدا تحتوي على إدراج غشاء باستخدام مجهر مضان مقلوب.
      تنبيه: تجنب وقت التعرض لفترات طويلة للأشعة فوق البنفسجية لأن هذا قد يسبب فوتودماج الخلوية.
      ملاحظة: حدد شريحة مع الخلايا العصبية واحدة مشرقة في سفز العليا تهاجر شعاعي نحو سطح بيال من شريحة. عمليات الفلورسنت غرامة من الخلايا الدبقية شعاعي التي تمتد كامل كب تشير إلى السقالات شعاعي سليمي شعاعي، وهو استخدامد عن طريق ترحيل الخلايا العصبية القشرية.
    2. نقل إدراج غشاء مع شريحة، والتي تم اختيارها للتصوير الوقت الفاصل بين، في طبق قطرها 50 مم الزجاج السفلي تحتوي على 2 مل من شريحة متوسطة الثقافة مع مساعدة من ملقط. وضع الطبق في غرفة المناخ من المجهر متحد البؤر.
    3. تعيين القرار إلى 512 512 بكسل وزيادة سرعة المسح الضوئي من 400 هرتز إلى 700 هرتز من أجل زيادة معدل الإطار من حوالي 1.4 إلى حوالي 2.5 لقطة في الثانية، على التوالي. لا تستخدم أكثر من مرتين في المتوسط. تحديد Z- كومة من خلال المنطقة إليكتروبوراتد (عادة 400-100 ميكرون) مع حجم الخطوة من 1.5 ميكرون. بشكل جماعي، هذه الإعدادات تسمح للقرار والسطوع كافية من الصورة مع الحفاظ على انخفاض الصورة الضوئية أثناء الاستحواذ. بدء سلسلة الفاصل الزمني من خلال اتخاذ Z- كومة كل 30 دقيقة.
      ملاحظة: التعرض لفترات طويلة من شريحة إلى ضوء الليزر سوف تحفز فوتوداماج تقليل قابلية الخلايا. ضبط إكسوقت التعرض للضوء الليزر وفقا لذلك.
    4. تحليل سلسلة الوقت الفاصل بين استخدام برنامج إيماجيج (https://imagej.nih.gov/iij/) أو ما يعادلها.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

سابقا، لقد أظهرنا أن الحذف الجيني من Bcl11a التي كتبها في الرحم إليكتروبوراتيون يضعف الهجرة شعاعي من الخلايا العصبية الإسقاط الطبقة العليا في وقت متأخر من الولادة 10 . إليكتروبوراتيون من ناقلات البلازميد الحمض النووي تحتوي على كري-إيريس-غفب حذف Bcl11a بكفاءة في المشروط Bcl11a فلوكس / أدمغة فلوكس 11 . عندما قمنا بتحليل E14.5 ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

الهجرة الشعاعية هي عملية رئيسية في تطوير القشرة المخية الجديدة. الطفرات في الجينات التي تؤثر على خطوات مختلفة من هذه العملية يمكن أن يسبب تشوهات قشرية شديدة، بما في ذلك ليسنسيفالي والمادة البيضاء تغاير 1 ، 2 . لقد أظهرنا مؤخرا أن Bcl11a، الذي يتم التعبير عنه في الشباب الخلايا العصبية الإسقاط القشرية هجرة، يلعب دورا في الهجرة شعاعي. استخدمنا التصوير الفاصل الزمني متحد البؤر من الخلايا العصبية المهاجرة في شرائح القشرية الحاد...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

نشكر جاكلين أندراتسشك، إيلينا ويرل، ساتشي تاكيناكا، وماتياس توبيرر للمساعدة التقنية الممتازة، وكذلك فيكتور تارابكين للمناقشات مفيدة. وأيد هذا العمل من قبل منحة من دويتشه فورسشونغزجيمينشافت إلى سب (بر-2215).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الأيزوفلورانأبوت   ؛506949فورين
6 آبار لوحةكورنينج351146
12 بئركورنينج351143
خياطة جراحية غير قابلة للامتصاصEthiconK890H3/8 دائرة ، 13 مم ، نقطة تفتق
Micro Adson Fallpsأدوات العلوم الدقيقة11018-12مسننة ، الطول: 12 سم
مقص ناعمأدوات العلوم الدقيقة14063-09بزاوية إلى الجانب ، الطول: 9 سم
إبرة ماثيوأدوات العلوم الدقيقة12510-14كربيد التنجستن ، الطول: 14 سم
ملقط ناعم الرؤوسأدوات العلوم الدقيقة11370-40مستقيم ، 11 سم
Vannas T ü ؛ بينجن مقص الربيعأدوات العلوم الدقيقة15005-08بزاوية لأعلى ،
ملقط حلقيأدوات العلوم الدقيقة11103-09OD: 3 مم ، معرف ، 2.2 مم ، الطول: 9 سم
HBSS (10X)Gibco14180046
L-GlutamineGibco25030081
البنسلين / الستربتومايسينجيبكو15140122
مصل الحصانجيبكو26050088
BMEGibco41010026
الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكاتجهاز هارفارد30-00161.0 OD × 0.58 ID × 100 L mm
نظام التخديرهارفارد Apparaus72-6471
غرفة التخديرهارفارد Apparaus34-0460
علبة مرشح fluosorberهارفارد أباراوس34-0415
نقطة انصهار منخفضة الاغاروزInvitrogen16520100
تهتز شفرة ميكروتومLeicaVT1200 S
مجهر ستيريو مضانLeicaM205 FA
مجهر ستيريوLeicaM125
مقلوب مضان ثقافة الأنسجة مجهرلايكاDM IL LED
مجهر المسح الضوئي بالليزر متحد البؤرLeicaTCS SP5II
كاشف هجينLeicaHyD
الهدف ، 40x / 0.60 NALeica11506201
المجهر نظام التحكم في درجة الحرارةمكعب خدمات التصويرالحي ، الطوب & إدراج
MilliporePICM0RG50
microgrinderNarishigeEG-45استخدام زاوية 38 درجة لشطف
الحاقن الصغيرباركر هانيفين  052-0500-900بيكوسبريتزر الثالث
كاربروفينفايزر لصحةNDC 61106-8507ريماديل
emdedingPolysciences18986-1
طقم ماكسي البلازميد الخالي من السمومالداخلية Qiagen12362
سريع أخضرسيجماF7252
لامينينسيجماL2020
بولي إل ليسينسيجماP5899
هيبسسيجماH4034
D-الجلوكوزسيجماG6152
كلوريد الكالسيومسيجماC7902
كبريتات المغنيسيومسيجماM2643
بيكربونات الصوديومسيجماS6297
الموجة المربعة الكهربائيةسونيدلCUY21EDIT
ملاقط مع أقطاب قرصية بلاتينية مقاس 5 ممSonidel
مجتذب ماصات دقيقةSutter InstrumentP-97
خيوط صندوقSutter InstrumentFB255B2.5 مم × 2.5 مم
ملعقة صغيرةVWR231-0191185 مم × 5 مم
، أدواتدقيقة عالميةFD5040-100
مختبرات لوحة حامل 9.5 سم ثقافة خلية الصندوق قالب CUY650P5 ملعقة طبق سفلي زجاجي 50 مم

المراجع

  1. Evsyukova, I., Plestant, C., Anton, E. S. Integrative mechanisms of oriented neuronal migration in the developing brain. Annu Rev Cell Dev Biol. 29, 299-353 (2013).
  2. Kwan, K. Y., Sestan, N., Anton, E. S. Transcriptional co-regulation of neuronal migration and laminar identity in the neocortex. Development. 139 (9), 1535-1546 (2012).
  3. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).
  4. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
  5. LoTurco, J. J., Bai, J. The multipolar stage and disruptions in neuronal migration. Trends Neurosci. 29 (7), 407-413 (2006).
  6. Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nat Neurosci. 7 (2), 136-144 (2004).
  7. Tabata, H., Nakajima, K. Multipolar migration: the third mode of radial neuronal migration in the developing cerebral cortex. J Neurosci. 23 (31), 9996-10001 (2003).
  8. Pacary, E., et al. Proneural transcription factors regulate different steps of cortical neuron migration through Rnd-mediated inhibition of RhoA signaling. Neuron. 69 (6), 1069-1084 (2011).
  9. Tabata, H., Nagata, K. Decoding the molecular mechanisms of neuronal migration using in utero electroporation. Medical Molecular Morphology. 49 (2), 63-75 (2016).
  10. Wiegreffe, C., et al. Bcl11a (Ctip1) Controls Migration of Cortical Projection Neurons through Regulation of Sema3c. Neuron. 87 (2), 311-325 (2015).
  11. John, A., et al. Bcl11a is required for neuronal morphogenesis and sensory circuit formation in dorsal spinal cord development. Development. 139 (10), 1831-1841 (2012).
  12. Polleux, F., Ghosh, A. The slice overlay assay: a versatile tool to study the influence of extracellular signals on neuronal development. Sci STKE. (136), pl9(2002).
  13. Greig, L. C., Woodworth, M. B., Galazo, M. J., Padmanabhan, H., Macklis, J. D. Molecular logic of neocortical projection neuron specification, development and diversity. Nat Rev Neurosci. 14 (11), 755-769 (2013).
  14. De Marco Garcia, N. V., Fishell, G. Subtype-selective electroporation of cortical interneurons. J Vis Exp. (90), e51518(2014).
  15. Holubowska, A., Mukherjee, C., Vadhvani, M., Stegmuller, J. Genetic manipulation of cerebellar granule neurons in vitro and in vivo to study neuronal morphology and migration. J Vis Exp. (85), (2014).
  16. Venkataramanappa, S., Simon, R., Britsch, S. Ex utero electroporation and organotypic slice culture of mouse hippocampal tissue. J Vis Exp. (97), (2015).
  17. Simon, R., et al. A dual function of Bcl11b/Ctip2 in hippocampal neurogenesis. EMBO J. 31 (13), 2922-2936 (2012).
  18. Youn, Y. H., Pramparo, T., Hirotsune, S., Wynshaw-Boris, A. Distinct dose-dependent cortical neuronal migration and neurite extension defects in Lis1 and Ndel1 mutant mice. J Neurosci. 29 (49), 15520-15530 (2009).
  19. Nadarajah, B., Brunstrom, J. E., Grutzendler, J., Wong, R. O., Pearlman, A. L. Two modes of radial migration in early development of the cerebral cortex. Nat Neurosci. 4 (2), 143-150 (2001).
  20. Higginbotham, H., Yokota, Y., Anton, E. S. Strategies for analyzing neuronal progenitor development and neuronal migration in the developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 21 (7), 1465-1474 (2011).
  21. Stubbs, D., et al. Neurovascular congruence during cerebral cortical development. Cereb Cortex. 19, Suppl 1. i32-i41 (2009).
  22. Ayala, R., Shu, T., Tsai, L. H. Trekking across the brain: the journey of neuronal migration. Cell. 128 (1), 29-43 (2007).
  23. Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة