Method Article

الجمع بين رامان التصوير وتحليل متعدد المتغيرات لتصور اللجنين، السليلوز، وهيميسيلولوز في جدار الخلية النباتية

DOI:

10.3791/55910

⸱

June 10th, 2017

 ,  , 
1Beijing Key Laboratory of Lignocellulosic Chemistry, Beijing Forestry University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويهدف هذا البروتوكول لتقديم طريقة عامة لتصور اللجنين، السليلوز، وهيميسيلولوز في جدران الخلايا النباتية باستخدام رامان التصوير وتحليل متعدد المتغيرات.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تطبيق رامان التصوير إلى الكتلة الحيوية النباتية آخذ في الازدياد لأنه يمكن أن توفر المعلومات المكانية والتراكيب على المحاليل المائية. ولا يتطلب التحليل عادة إعداد عينات واسعة النطاق؛ يمكن الحصول على المعلومات الهيكلية والكيميائية دون وضع العلامات. ومع ذلك، كل صورة رامان يحتوي على آلاف الأطياف. وهذا يثير صعوبات عند استخراج المعلومات الخفية، وخاصة بالنسبة للمكونات ذات الهياكل الكيميائية مماثلة. يقدم هذا العمل تحليلا متعدد المتغيرات لمعالجة هذه المشكلة. بروتوكول يحدد طريقة عامة لتصور المكونات الرئيسية، بما في ذلك اللجنين والسليلوز، وهيميسيلولوز داخل جدار الخلية النباتية. في هذا البروتوكول، وصفت إجراءات لإعداد العينات، واكتساب الطيفية، ومعالجة البيانات. وهي تعتمد اعتمادا كبيرا على مهارة المشغل في إعداد العينات وتحليل البيانات. باستخدام هذا النهج، وتحقيق رامان يمكن أن يؤديها مستخدم غير متخصص لاكتساب هيغh- بيانات ذات جودة ونتائج ذات مغزى لتحليل جدار الخلية النباتية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتلة الحيوية النباتية هي أكثر الموارد المتجددة وفرة على وجه الأرض ؛ تتكون بشكل أساسي من اللجنين والسليلوز والهيميسليلوز ؛ وتعتبر مصدرا جذابا للطاقة الحيوية والمواد الكيميائية الحيوية < فئة sup = 'xref'>1. لسوء الحظ ، يمكن أن يقاوم التدهور ويمنح الاستقرار المائي أو المتانة الهيكلية لجدار الخلية النباتية. تعزى هذه المقاومة إلى مساحة السطح التي يمكن الوصول إليها ، وحجم جسيمات الكتلة الحيوية ، ودرجة البلمرة ، وتبلور السليلوز ، واللجنين الواقي < فئة sup = 'xref'>2. وبالتالي ، فإن الفهم الشامل للطبيعة الهيكلية والكيميائية لجدار الخلية النباتية مهم من وجهة نظر بيولوجيا النبات والكيمياء ، وكذلك من وجهة نظر الاستخدام التجاري. توفر تحليلات الكيمياء الرطبة شائعة الاستخدام ، مثل الكروماتوغرافيا وقياس الطيف الكتلي والتحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي ، متوسط البيانات التركيبية للعينة المقاسة فقط. علاوة على ذلك ، فإن هذه الطرق غازية وتدمر التركيب الأصلي للأنسجة النباتية < فئة الدعم = 'xref'>3.

تعد تقنية تصوير رامان أداة قوية للتصور غير المدمر للمعلومات الكيميائية التي تم حلها مكانيا < فئة الدعم = 'xref'>4. يستخدم ضوء الليزر لإحداث تشتت غير مرن باستخدام الفوتون ويعتمد على التغيرات في الاستقطاب الناشئة عن الاهتزازات الجزيئية. في هذه الحالة ، يتسبب الماء في تشتت رامان ضعيف ، مما يجعل هذا النهج مناسبا للتحقيقات في الموقع للعينات البيولوجية< فئة الدعم = 'xref'>5. يمكن أن يوضح تطبيق تقنية تصوير رامان على جدار الخلية النباتية بنية وتكوين جدران الخلايا النباتية في حالتها الأصلية ، مع الدقة على مقياس الخلية المفردة وحتى طبقات جدار الخلية< فئة الدعم = 'xref'>6. يتكون تحليل تصوير رامان النموذجي لجدار الخلية النباتية بشكل عام من ثلاث خطوات: 1) تحضير العينة ، 2) الاستحواذ الطيفي ، و 3) معالجة البيانات.

على الرغم من أن إحدى المزايا الرئيسية لتصوير رامان هي القدرة على تحقيق أطياف خالية من الملصقات وغير مدمرة مع الحد الأدنى من تحضير العينة ، إلا أن تقسيم العينة المادية لا يزال ضروريا لفضح السطح المثير للاهتمام. يجب إجراء هذه العملية بعناية للحصول على سطح مستو ، لأن التقنية تعتمد على الحفاظ على التركيز البصري < فئة الدعم = 'xref'>7. يتطلب الاستحواذ الطيفي توازنا بين جودة الصورة وأوقات الاستحواذ الواسعة < فئة الدعم = 'xref'>8. تهدف معالجة البيانات إلى استخراج المعلومات الكيميائية بشكل فعال من بيانات الصورة ، خاصة بالنسبة للمكونات ذات الهياكل الكيميائية المتشابهة ، مثل السليلوز والهيميسليلوز. بسبب التداخل الطيفي القوي ، يصعب تمييز الأطياف الدقيقة. في هذه الحالة ، يعد التحليل متعدد المتغيرات نهجا مباشرا للكشف بشكل فعال عن المعلومات الهيكلية والكيميائية المخفية < فئة الدعم = 'xref'>9. يقدم هذا العمل بروتوكولا عاما يصف استخدام تصوير رامان لتصور المكونات الرئيسية في جدران الخلايا النباتية ، بما في ذلك اللجنين والسليلوز والهيميسليلوز.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد العينة

  1. قطع كتلة الأنسجة الصغيرة (حوالي 3 مم × 3 مم × 5 مم) من عينة النبات (على سبيل المثال، الجذعية الحور).
  2. تزج الأنسجة في الماء المغلي منزوع الأيونات لمدة 30 دقيقة. نقل على الفور إلى الماء منزوع الأيونات في درجة حرارة الغرفة (رت) لمدة 30 دقيقة. كرر هذه الخطوة حتى يغسل الأنسجة إلى الجزء السفلي من الحاوية، مشيرا إلى أن الهواء في الأنسجة قد أزيلت وأن الأنسجة قد خففت.
    ملاحظة: للعينات التي تغرق إلى أسفل قبل هذه الخطوة، عموما تكرار هذه الدورة 3-5 مرات.
  3. إعداد 20، 50، 70، 90٪ (ت / ت) أليكوتس من البولي ايثيلين جلايكول (بيج) في الماء منزوع الأيونات، وكذلك بيج النقي، والحفاظ على الحلول عند 65 درجة مئوية.
  4. احتضان الأنسجة في سلسلة من حمامات بيج متدرج لتحل محل المياه والسماح لل بيج التسلل.
    ملاحظة: عادة، يستخدم بيج مع الوزن الجزيئي 2،000 (PEG2000) للتضمين.
    1. معالجة الأنسجة مع ز(أ) 20٪ بيج لمدة 1 ساعة، (ب) 50٪ بيج لمدة 1.5 ساعة، (ج) 70٪ بيج لمدة 2 ساعة، (د) 90٪ بيج لمدة 2 ساعة، و (ه) 100٪ بيج لمدة 10 ساعة.
  5. قبل الحارة كاسيت في 65 درجة مئوية في الفرن. صب بيج تحتوي على كتلة في الكاسيت ثم ضع كتلة الأنسجة في الموضع المطلوب باستخدام ملاقط ما قبل تحسنت أو الإبر.
  6. تبرد ببطء أسفل الكاسيت وتخزين الأنسجة في رت حتى الاستخدام.
  7. تشريح كتلة بيج تحتوي على الأنسجة المستهدفة في كتلة صغيرة (حوالي 1 سم × 1 سم × 2 سم) باستخدام شفرة حلاقة حادة وتركيبه على مشراح.
  8. قطع أجزاء رقيقة من كتلة بيج (عادة 3-10 ميكرون).
  9. شطف القسم مع الماء منزوع الأيونات في ساعة الزجاج 10 مرات لإزالة بيج من الأنسجة.
  10. تزج المقاطع مع التولوين / الايثانول (2: 1، الخامس / الخامس) لمدة 6 ساعات لإزالة المواد الاستخراجية. إعداد السائل التفاعل عن طريق خلط 65 مل من الماء منزوع الأيونات، 0.5 مل من حمض الخليك، و 0.6 غرام من الصوديوم كلوشعيرة في كوب. إضافة قسم واحد و 3 مل من السائل رد فعل إلى قارورة 5 مل. المسمار على الجزء العلوي من القارورة.
  11. تسخين القارورة في حمام مائي في 75 درجة مئوية لمدة 2 ساعة لإزالة اللجنين من الأنسجة. شطف القسم مع الماء منزوع الأيونات في ساعة الزجاج 10 مرات.
  12. نقل القسم غير المعالجة / ديليغنيفيد إلى شريحة المجهر الزجاجي. قم بتفكيك القسم بعناية باستخدام الفرش أو الإبر. إزالة الماء منزوع الأيونات اضافية مع ورقة الأنسجة.
  13. تزج القسم في D 2 O. تغطية العينة مع زلة غطاء الزجاج. ختم غطاء زلة مع طلاء الأظافر لمنع تبخر D 2 O.

2. اكتساب الطيفي

  1. فتح برنامج التشغيل الصك المجهر رامان مبائر. بدوره على الليزر (الطول الموجي = 532 نانومتر)، والتركيز على سطح السيليكون البلورية مع الهدف المجهر 100X، وانقر على زر المعايرة لمعايرة الصك.
  2. تبديل الصكإلى وضع المجهر الضوئي وتشغيل مصباح المجهر. جبل شريحة المجهر على خشبة المسرح، مع زلة غطاء تواجه الهدف.
  3. عرض العينة مع الهدف المجهر 20X وتحديد مجال الاهتمام. تطبيق زيت الغمر إلى ساترة والتبديل إلى الهدف المجهر الغمر (60X، الفتحة العددية نا = 1.35). التركيز على سطح العينة.
  4. تبديل الصك إلى وضع الاختبار رامان وإيقاف مصباح المجهر.
  5. اختر منطقة رسم الخرائط باستخدام أداة مستطيلة. تغيير حجم الخطوة لتحديد عدد الأطياف التي تم الحصول عليها.
    ملاحظة: كن على بينة من حجم الخطوة (عادة أكبر من القطر بقعة يحسبها الفتحة العددية للهدف؛ نظريا 1.22λ / نا). الأحجام أدناه هذا سوف يؤدي إلى الإفراط.
  6. وقم بتعيين المعلمات الطيفية المثلى للحصول على أفضل نسبة من الإشارة إلى الضوضاء (شنر) والجودة الطيفية في وقت اقتناء مناسب (عموما <8 h)، ديبندينغ على ملاءمة العينة. عموما، إدخال المعلمات التصوير في برنامج الصك على النحو التالي: ليزر (532 نانومتر)، تصفية (100٪)، حفرة (300)، شق (100)، مطياف (1،840 سم -1 )، الأخاديد (1200t)، الهدف ( 60X النفط)، ووقت الاستحواذ (2 ق).
  7. حفظ البيانات الطيفية قبل معالجة البيانات وتحويلها إلى شكل عالمي (على سبيل المثال، ملفات تكست).

3. تحليل البيانات

  1. تحميل البيانات الطيفية (ملفات تكست) في برنامج تحليل البيانات (على سبيل المثال، ماتلاب). تطبيق تقنية الحد من الضوضاء على مجموعة البيانات لتحسين شنر (على سبيل المثال، خوارزمية سافيتسكي غولاي أو خوارزمية المويجات)
  2. استخدام عينات غير المعالجة لإنتاج الصور من اللجنين والسكريات. لتصوير اللجنين، والنظر في الذروة الطيفية حوالي 1600 سم -1 بسبب العطرية متماثل تمتد الاهتزاز. لتصوير السكاريد (بما في ذلك السليلوز وهيميسيلولوز)، واستخدام الذروة الطيفية أجولة 2،889 سم -1 بسبب تش و تش 2 تمتد.
  3. استخدام عينات ديليغنيفيد لتوليد الصور من السليلوز وهيميسيلولوز. أداء الذاتي النمذجة منحنى القرار (سمكر) على أطياف المكتسبة للتمييز أطياف السليلوز وهيميسيلولوز وصورة توزيعاتها.
  4. إجراء تحليل المكون الرئيسي (يكا) وتحليل العنقودية على البيانات المكتسبة للتمييز بين أطياف رامان من مختلف طبقات جدار الخلية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الشكل 1 يقدم لمحة عامة عن نظام رامان نموذجي نموذجي لتصوير رامان من جدار الخلية النباتية. على سبيل المثال، أطياف رامان الأصلية من الحور ( بوبولوس نيغرا L.) لديها الانجرافات خط الأساس كبيرة والمسامير ( الشكل 2A ). بعد تنفيذ طريقة المعالجة المسبقة التلقائي لمجموعة بيانات التصوير رامان (أبري)، يتم إزالة هذه الملوثات الطيفية بنجاح ( الشكل 2B ). ويعرض

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

جدار الخلية النباتية هو مركب الذي تم تنظيمه في عدة طبقات، بما في ذلك زاوية الخلية (سيسي)، الجدار الثانوي (سو، مع S1، S2، و S3 طبقات)، والمركبة لاميلا المتوسطة (سمل، لاميلا المتوسطة بالإضافة إلى الابتدائي المجاور الجدار)، مما يجعل من الصعب الحصول على سطح مستو أثناء إعداد العينة. وهكذا، عينات النبات، وخاصة العشب، والتي لديها بنية أكثر تعقيدا من الخشب، وغالبا ما تحتاج إلى أن تكون عززت للسماح ل سيكتيونينغ غرامة. بيج هو المصفوفة الصلبة مثالية لقطع وتحقيق رامان، لأنه قابل للذوبان في الم...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر وزارة العلوم والتكنولوجيا الصينية (2016YDF0600803) للحصول على الدعم المالي.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ميكروتومحراري علميميكروم HM430
مجهر رامان متحدالبؤر هوريبا جوبين إيفونإكسبلورا
فرنشنغهاي ZHICHENGZXFD-A5040

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gonzalo, G. D., et al. Bacterial Enzymes Involved in Lignin Degradation. J. Biotechnol. 236, 110-119 (2016).
  2. Rosatella, A. A., Afonso, C. A. M. Chapter 2. Ionic Liquids in the Biorefinery Concept: Challenges and Perspectives. , Wiley. 38-64 (2016).
  3. Sun, L., et al. Understanding tissue specific compositions of bioenergy feedstocks Through hyperspectral Raman imaging. Bio. 108 (2), 286-295 (2009).
  4. Tolstik, T., et al. Classification and prediction of HCC tissues by Raman imaging with identification of fatty acids as potential lipid biomarkers. J. Cancer. Res. Clin. Oncol. 141 (3), 407-418 (2015).
  5. Schrader, B. Infrared and Raman spectroscopy: methods and applications. , John Wiley and Sons. (2008).
  6. Gierlinger, N., et al. Imaging of plant cell walls by confocal Raman microscopy. Nat. Protoc. 7 (9), 1694-1708 (2012).
  7. Luca, A. C. D., et al. Online fluorescence suppression in modulated Raman spectroscopy. Anal. Chem. 82 (2), 738-745 (2009).
  8. Schlücker, S., et al. Raman microspectroscopy: a comparison of point, line, and wide-field imaging methodologies. Anal. Chem. 75 (16), 4312-4318 (2003).
  9. Cooper, J. B. Chemometric analysis of Raman spectroscopic data for process control applications. Chemometr. Intell. Lab. Syst. 46 (2), 231-247 (1999).
  10. Cheng, H. J., Hsiau, S. S. The study of granular agglomeration mechanism. Powder Technol. 199 (3), 272-283 (2010).
  11. Zhang, X., et al. Method for removing spectral contaminants to improve analysis of Raman imaging data. Sci. Rep. 6, 39891(2016).
  12. Shinzawa, H., et al. Multivariate data analysis for Raman spectroscopic imaging. J. Raman Spectrosc. 40 (12), 1720-1725 (2009).
  13. Lawton, W. H., Sylvestre, E. A. Self modeling curve resolution. Technometrics. 13, 617-633 (1971).
  14. Zhang, X., et al. Method for automatically identifying spectra of different wood cell wall layers in Raman imaging data set. Anal. Chem. 87 (2), 1344-1350 (2015).
  15. Kudelski, A. Analytical application of Raman spectroscopy. Talanta. 76 (1), 1-8 (2008).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Raman ImagingMultivariate AnalysisPlant Cell WallLignin VisualizationCellulose ImagingHemicellulose AnalysisSpectral AcquisitionData ProcessingSample PreparationConfocal Microscopy

Related Articles