الجمع بين رامان التصوير وتحليل متعدد المتغيرات لتصور اللجنين، السليلوز، وهيميسيلولوز في جدار الخلية النباتية

الكتلة الحيوية النباتية هي أكثر الموارد المتجددة وفرة على وجه الأرض ؛ تتكون بشكل أساسي من اللجنين والسليلوز والهيميسليلوز ؛ وتعتبر مصدرا جذابا للطاقة الحيوية والمواد الكيميائية الحيوية < فئة sup = 'xref'>1. لسوء الحظ ، يمكن أن يقاوم التدهور ويمنح الاستقرار المائي أو المتانة الهيكلية لجدار الخلية النباتية. تعزى هذه المقاومة إلى مساحة السطح التي يمكن الوصول إليها ، وحجم جسيمات الكتلة الحيوية ، ودرجة البلمرة ، وتبلور السليلوز ، واللجنين الواقي < فئة sup = 'xref'>2. وبالتالي ، فإن الفهم الشامل للطبيعة الهيكلية والكيميائية لجدار الخلية النباتية مهم من وجهة نظر بيولوجيا النبات والكيمياء ، وكذلك من وجهة نظر الاستخدام التجاري. توفر تحليلات الكيمياء الرطبة شائعة الاستخدام ، مثل الكروماتوغرافيا وقياس الطيف الكتلي والتحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي ، متوسط البيانات التركيبية للعينة المقاسة فقط. علاوة على ذلك ، فإن هذه الطرق غازية وتدمر التركيب الأصلي للأنسجة النباتية < فئة الدعم = 'xref'>3.

تعد تقنية تصوير رامان أداة قوية للتصور غير المدمر للمعلومات الكيميائية التي تم حلها مكانيا < فئة الدعم = 'xref'>4. يستخدم ضوء الليزر لإحداث تشتت غير مرن باستخدام الفوتون ويعتمد على التغيرات في الاستقطاب الناشئة عن الاهتزازات الجزيئية. في هذه الحالة ، يتسبب الماء في تشتت رامان ضعيف ، مما يجعل هذا النهج مناسبا للتحقيقات في الموقع للعينات البيولوجية< فئة الدعم = 'xref'>5. يمكن أن يوضح تطبيق تقنية تصوير رامان على جدار الخلية النباتية بنية وتكوين جدران الخلايا النباتية في حالتها الأصلية ، مع الدقة على مقياس الخلية المفردة وحتى طبقات جدار الخلية< فئة الدعم = 'xref'>6. يتكون تحليل تصوير رامان النموذجي لجدار الخلية النباتية بشكل عام من ثلاث خطوات: 1) تحضير العينة ، 2) الاستحواذ الطيفي ، و 3) معالجة البيانات.

على الرغم من أن إحدى المزايا الرئيسية لتصوير رامان هي القدرة على تحقيق أطياف خالية من الملصقات وغير مدمرة مع الحد الأدنى من تحضير العينة ، إلا أن تقسيم العينة المادية لا يزال ضروريا لفضح السطح المثير للاهتمام. يجب إجراء هذه العملية بعناية للحصول على سطح مستو ، لأن التقنية تعتمد على الحفاظ على التركيز البصري < فئة الدعم = 'xref'>7. يتطلب الاستحواذ الطيفي توازنا بين جودة الصورة وأوقات الاستحواذ الواسعة < فئة الدعم = 'xref'>8. تهدف معالجة البيانات إلى استخراج المعلومات الكيميائية بشكل فعال من بيانات الصورة ، خاصة بالنسبة للمكونات ذات الهياكل الكيميائية المتشابهة ، مثل السليلوز والهيميسليلوز. بسبب التداخل الطيفي القوي ، يصعب تمييز الأطياف الدقيقة. في هذه الحالة ، يعد التحليل متعدد المتغيرات نهجا مباشرا للكشف بشكل فعال عن المعلومات الهيكلية والكيميائية المخفية < فئة الدعم = 'xref'>9. يقدم هذا العمل بروتوكولا عاما يصف استخدام تصوير رامان لتصور المكونات الرئيسية في جدران الخلايا النباتية ، بما في ذلك اللجنين والسليلوز والهيميسليلوز.

1. إعداد العينة

1. قطع كتلة الأنسجة الصغيرة (حوالي 3 مم × 3 مم × 5 مم) من عينة النبات (على سبيل المثال، الجذعية الحور).
2. تزج الأنسجة في الماء المغلي منزوع الأيونات لمدة 30 دقيقة. نقل على الفور إلى الماء منزوع الأيونات في درجة حرارة الغرفة (رت) لمدة 30 دقيقة. كرر هذه الخطوة حتى يغسل الأنسجة إلى الجزء السفلي من الحاوية، مشيرا إلى أن الهواء في الأنسجة قد أزيلت وأن الأنسجة قد خففت.
   ملاحظة: للعينات التي تغرق إلى أسفل قبل هذه الخطوة، عموما تكرار هذه الدورة 3-5 مرات.
3. إعداد 20، 50، 70، 90٪ (ت / ت) أليكوتس من البولي ايثيلين جلايكول (بيج) في الماء منزوع الأيونات، وكذلك بيج النقي، والحفاظ على الحلول عند 65 درجة مئوية.
4. احتضان الأنسجة في سلسلة من حمامات بيج متدرج لتحل محل المياه والسماح لل بيج التسلل.
   ملاحظة: عادة، يستخدم بيج مع الوزن الجزيئي 2،000 (PEG2000) للتضمين.
   1. معالجة الأنسجة مع ز(أ) 20٪ بيج لمدة 1 ساعة، (ب) 50٪ بيج لمدة 1.5 ساعة، (ج) 70٪ بيج لمدة 2 ساعة، (د) 90٪ بيج لمدة 2 ساعة، و (ه) 100٪ بيج لمدة 10 ساعة.
5. قبل الحارة كاسيت في 65 درجة مئوية في الفرن. صب بيج تحتوي على كتلة في الكاسيت ثم ضع كتلة الأنسجة في الموضع المطلوب باستخدام ملاقط ما قبل تحسنت أو الإبر.
6. تبرد ببطء أسفل الكاسيت وتخزين الأنسجة في رت حتى الاستخدام.
7. تشريح كتلة بيج تحتوي على الأنسجة المستهدفة في كتلة صغيرة (حوالي 1 سم × 1 سم × 2 سم) باستخدام شفرة حلاقة حادة وتركيبه على مشراح.
8. قطع أجزاء رقيقة من كتلة بيج (عادة 3-10 ميكرون).
9. شطف القسم مع الماء منزوع الأيونات في ساعة الزجاج 10 مرات لإزالة بيج من الأنسجة.
10. تزج المقاطع مع التولوين / الايثانول (2: 1، الخامس / الخامس) لمدة 6 ساعات لإزالة المواد الاستخراجية. إعداد السائل التفاعل عن طريق خلط 65 مل من الماء منزوع الأيونات، 0.5 مل من حمض الخليك، و 0.6 غرام من الصوديوم كلوشعيرة في كوب. إضافة قسم واحد و 3 مل من السائل رد فعل إلى قارورة 5 مل. المسمار على الجزء العلوي من القارورة.
11. تسخين القارورة في حمام مائي في 75 درجة مئوية لمدة 2 ساعة لإزالة اللجنين من الأنسجة. شطف القسم مع الماء منزوع الأيونات في ساعة الزجاج 10 مرات.
12. نقل القسم غير المعالجة / ديليغنيفيد إلى شريحة المجهر الزجاجي. قم بتفكيك القسم بعناية باستخدام الفرش أو الإبر. إزالة الماء منزوع الأيونات اضافية مع ورقة الأنسجة.
13. تزج القسم في D ₂ O. تغطية العينة مع زلة غطاء الزجاج. ختم غطاء زلة مع طلاء الأظافر لمنع تبخر D ₂ O.

2. اكتساب الطيفي

1. فتح برنامج التشغيل الصك المجهر رامان مبائر. بدوره على الليزر (الطول الموجي = 532 نانومتر)، والتركيز على سطح السيليكون البلورية مع الهدف المجهر 100X، وانقر على زر المعايرة لمعايرة الصك.
2. تبديل الصكإلى وضع المجهر الضوئي وتشغيل مصباح المجهر. جبل شريحة المجهر على خشبة المسرح، مع زلة غطاء تواجه الهدف.
3. عرض العينة مع الهدف المجهر 20X وتحديد مجال الاهتمام. تطبيق زيت الغمر إلى ساترة والتبديل إلى الهدف المجهر الغمر (60X، الفتحة العددية نا = 1.35). التركيز على سطح العينة.
4. تبديل الصك إلى وضع الاختبار رامان وإيقاف مصباح المجهر.
5. اختر منطقة رسم الخرائط باستخدام أداة مستطيلة. تغيير حجم الخطوة لتحديد عدد الأطياف التي تم الحصول عليها.
   ملاحظة: كن على بينة من حجم الخطوة (عادة أكبر من القطر بقعة يحسبها الفتحة العددية للهدف؛ نظريا 1.22λ / نا). الأحجام أدناه هذا سوف يؤدي إلى الإفراط.
6. وقم بتعيين المعلمات الطيفية المثلى للحصول على أفضل نسبة من الإشارة إلى الضوضاء (شنر) والجودة الطيفية في وقت اقتناء مناسب (عموما <8 h)، ديبندينغ على ملاءمة العينة. عموما، إدخال المعلمات التصوير في برنامج الصك على النحو التالي: ليزر (532 نانومتر)، تصفية (100٪)، حفرة (300)، شق (100)، مطياف (1،840 سم ^-1 )، الأخاديد (1200t)، الهدف ( 60X النفط)، ووقت الاستحواذ (2 ق).
7. حفظ البيانات الطيفية قبل معالجة البيانات وتحويلها إلى شكل عالمي (على سبيل المثال، ملفات تكست).

3. تحليل البيانات

1. تحميل البيانات الطيفية (ملفات تكست) في برنامج تحليل البيانات (على سبيل المثال، ماتلاب). تطبيق تقنية الحد من الضوضاء على مجموعة البيانات لتحسين شنر (على سبيل المثال، خوارزمية سافيتسكي غولاي أو خوارزمية المويجات)
2. استخدام عينات غير المعالجة لإنتاج الصور من اللجنين والسكريات. لتصوير اللجنين، والنظر في الذروة الطيفية حوالي 1600 سم ^-1 بسبب العطرية متماثل تمتد الاهتزاز. لتصوير السكاريد (بما في ذلك السليلوز وهيميسيلولوز)، واستخدام الذروة الطيفية أجولة 2،889 سم ^-1 بسبب تش و تش ₂ تمتد.
3. استخدام عينات ديليغنيفيد لتوليد الصور من السليلوز وهيميسيلولوز. أداء الذاتي النمذجة منحنى القرار (سمكر) على أطياف المكتسبة للتمييز أطياف السليلوز وهيميسيلولوز وصورة توزيعاتها.
4. إجراء تحليل المكون الرئيسي (يكا) وتحليل العنقودية على البيانات المكتسبة للتمييز بين أطياف رامان من مختلف طبقات جدار الخلية.

الشكل 1 يقدم لمحة عامة عن نظام رامان نموذجي نموذجي لتصوير رامان من جدار الخلية النباتية. على سبيل المثال، أطياف رامان الأصلية من الحور ( بوبولوس نيغرا L.) لديها الانجرافات خط الأساس كبيرة والمسامير ( الشكل 2A ). بعد تنفيذ طريقة المعالجة المسبقة التلقائي لمجموعة بيانات التصوير رامان (أبري)، يتم إزالة هذه الملوثات الطيفية بنجاح ( الشكل 2B ). ويعرض الشكل 3 طيف رامان نموذجي من الحور، وترد مهام الفرقة الخاصة به في الجدول 1 . يتم إنشاء صورة رامان من اللجنين من خلال دمج المنطقة الطيفية من 1،550-1،650 سم -1 ، وهو ما يعزى إلى هيكل حلقة العطرية ( الشكل 4A ). الشكل 4D يعرض صورة رامان من السكريات، وويتحقق إش من خلال دمج الذروة في 2،889 سم -1 . إلى صورة السليلوز و هيميسيلولوز، يتم تنفيذ سمكر على بيانات التصوير رامان من عينة ديليغنيفيد. وتظهر الأطياف المقابلة والصور في الشكل 5 . ويعرض الشكل 6 النتائج التي حققها تحليل يكا والتحليل العنقودي.

الشكل 1: تخطيطي للرامان التصوير للجدار خلية النبات. يتم قياس عينة المقطع العرضي (الحور كمثال) من قبل نظام رامان الصغير الذي الأزواج المجهر الضوئي إلى رامان عالية الدقة مطياف مع جهاز كاشف جنبا إلى جنب (كسد) كاشف. في صورة حقل مشرق، يتم تنظيم جدار الخلية النباتية في الزاوية الخلية (سيسي)، لاميلا الأوسط المركب (سمل)، والجدار الثانوي (سو). تقليديا، يتم إنشاء صورة رامان من قبل ذروة واحدةالتكامل أو الكثافة. وهناك ملوثتان طيفيتان ( أي الانحرافات الأساسية والمسامير الكونية) موجودة في البيانات الأصلية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: رامان الأطياف قبل ( أ ) وبعد ( ب ) المعالجة المسبقة من قبل أبري. تمت إزالة اثنين من الملوثات الطيفية بنجاح. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: نموذجي رامان الطيف من جدار الخلية الحور. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: صور رامان من اللجنين ( أ ) والسكاريد ( ب ) داخل جدار الخلية الحور. يتم إنشاء صورة اللجنين من خلال دمج الذروة حوالي 1،600 سم -1 . يتم إنتاج صورة السكاريد من خلال دمج الذروة حول 2،889 سم -1 . الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5: صور رامان من السليلوز ( أ ) وهيميسيلولوز ( ب ) داخل جدار الخلية الحور. يتم تنفيذ سمكر على بيانات التصوير رامان من عينة محددة. تساهم إزالة اللدغة في التعرض للخصائص الطيفية للسليلوز والهيميسيلولوز. ويتركز السليلوز في الغالب في سو، في حين أن توزيع هيميسيلولوز هو تقريبا موحدة في جميع أنحاء جدار الخلية الحور. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 6: يكا ونتائج التحليل تجميع لتحديد تلقائيا طبقات جدار الخلية المختلفة في جدار الخلية الحور. باستخدام Pكا وتحليل التجميع، وتنقسم الأطياف إلى أربعة أجزاء المقابلة ل تجويف الخلية، سيسي، سمل و سو. ويرد أدناه متوسط ​​أطياف هذه الطبقات. وكشفت النتائج أن اللجنين يتركز على طول سمل وفي سيسي، في حين أن السكريات تتركز في الغالب في سو. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: مواقع الذروة رامان والتعيينات الفرقة

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.