يصف هذا العمل توحيد طريقة للحصول على السكان الخلايا الجرثومية المنقى من الأنسجة الخصية من أنواع الثدييات المختلفة. وهو بروتوكول مباشر يجمع بين التفكك الخصية الميكانيكية، تلطيخ مع هويشت-33342 و يوديد بروبيديوم، و فاكس فرز، مع تطبيقات واسعة في الدراسات المقارنة للبيولوجيا التناسلية للذكور.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
نهج موحد لتنقية مولتبيسيسيز من الثدييات خلايا الجرثومية الذكور من الأنسجة الميكانيكية التفكك والتدفق الخلوي
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
كان الفلورسنت تنشيط الخلايا الفرز (فاكس) واحدة من الطرق المفضلة لعزل السكان المخصب من الخلايا الجرثومية الخصية الثدييات. حاليا، فإنه يسمح للتمييز ما يصل إلى 9 الفئران السكان الخلايا الجرثومية مع ارتفاع الغلة والنقاء. هذا عالية الدقة في التمييز والتنقية ممكنة بسبب التغيرات الفريدة في هيكل الكروماتين وكمية طوال الحيوانات المنوية. ويمكن التقاط هذه الأنماط عن طريق التدفق الخلوي للخلايا الجرثومية الذكور ملطخة الأصباغ الحمض النووي ملزم الفلورسنت مثل هويشت-33342 (هويشت). هنا هو وصف مفصل للبروتوكول وضعت مؤخرا لعزل الخلايا الجرثومية الخصية الثدييات. باختصار، يتم إنشاء تعليق خلية واحدة من الأنسجة الخصية عن طريق التفكك الميكانيكية، ملطخة مزدوجة مع هويشت و يوديد بروبيديوم (بي) ومعالجتها عن طريق التدفق الخلوي. استراتيجية التسلسلي التسلسلي، بما في ذلك اختيار الخلايا الحية (بي سلبية) مع محتوى الحمض النووي مختلفة (كثافة هويشت)، طs المستخدمة خلال فرز فاكس لتمييز ما يصل إلى 5 أنواع الخلايا الجرثومية. وتشمل هذه الحالات، مع متوسط النقاء المقابلة (يحددها الفحص المجهري): سبيرماتوغونيا (66٪)، الابتدائي (71٪) والثانوية (85٪) الحيوانات المنوية، والحيوانات المنوية (90٪)، فصل أكثر إلى جولة (93٪) واستطالة (87٪). تنفيذ سير العمل بأكمله هو واضح، ويسمح لعزل 4 أنواع الخلايا في وقت واحد مع الجهاز فاكس المناسبة، ويمكن أن يؤديها في أقل من 2 ساعة. كما خفض وقت المعالجة أمر بالغ الأهمية للحفاظ على علم وظائف الأعضاء من خلايا الجسم الحي السابقين ، وهذه الطريقة مثالية للدراسات المصب عالية الإنتاجية من الذكور البيولوجيا الخلية الجرثومية. وعلاوة على ذلك، بروتوكول موحد لتنقية متعددة الطبقات من الخلايا الجرثومية الثدييات يلغي المصادر المنهجية للمتغيرات ويسمح لمجموعة واحدة من الكواشف لاستخدامها لنماذج حيوانية مختلفة.
المقدمة
ونظرا لعدم وجود نظام في المختبر ممثل تطور الحيوانات المنوية، وجود عدم التجانس الخلوية كبيرة في خصية، دراسات بيولوجيا الخلية الجرثومية الذكور تتطلب تقنيات قوية لعزل السكان المخصب من أنواع الخلايا المحددة. وقد استخدمت على نطاق واسع الفرز خلية مضان (فاكس) لهذا الغرض 1 ، 2 ، 3 ، 4 ، 5 ، كما أنه يوفر عالية الغلة والنقاء، ويفوق أساليب العزلة الأخرى في عدد أنواع الخلايا الجرثومية التي يمكن التعرف عليها و حدد 6 ، 7 ، 8 . ويستند مبدأ تحليل التدفق الخلوي على الكشف عن أنماط ضوء التفاضلية التالية شعاع الليزر الإثارة من خلايا واحدة. كما يمر خلية من خلال الليزر فإنه يعكس / ينثر الضوءفي جميع الزوايا، يتناسب مع حجم الخلية (مبعثر إلى الأمام؛ فسك) وإلى تعقيد الخلايا (الجانب مبعثر؛ سك). انظر أورميرود 9 للحصول على معلومات مفصلة عن التدفق الخلوي.
والخلايا الجرثومية الذكور تخضع تعديلات محددة في محتوى الحمض النووي، هيكل الكروماتين، وحجم وشكل في جميع مراحل مختلفة من الحيوانات المنوية. وهكذا، يمكن تحديد السكان خلية متميزة وفصلها عن طريق الجمع بين تشتت الضوء وتلطيخ الحمض النووي مع الأصباغ الفلورية 10 ، 11 . العديد من الأصباغ يمكن استخدامها لهذا الغرض (استعرض في جيسينجر و رودريجيز كاسورياغا 3 )، مثل هويشست-33342 (هويشست) التي كثيرا ما تستخدم في تحليل التدفق الخلوي للخلايا الخصية للعقد الماضي 1 ، 2 ، 4 ، 10 ، 12 . UPOن الإثارة مع الأشعة فوق البنفسجية ضوء، هويشت تنبعث مضان الأزرق يتناسب مع محتوى الحمض النووي الخلوي في حين يعكس مضان أحمر بعيدة التباين في هيكل الكروماتين والضغط 1 ، 13 ، 14 . ونتيجة لذلك، الخلايا الجرثومية الذكور في مراحل مختلفة من التمايز تظهر أنماط محددة خلال فاكس من هويست الملون تعليق خلية واحدة (هو-فاكس، 1 ، 12 ). ومن المثير للاهتمام، ويرجع ذلك إلى آلية إفلوكس صبغ التي هي نشطة فقط خلال مرحلة سبيرماتوغونيال، شدة هويشت مضان الأزرق لا يتناسب مع محتوى الكروماتين في هذه الخلايا، وأنها تجمع كجانب جانب خلال هو-فاكس 15 . بالإضافة إلى ذلك، الجمع بين تلطيخ هويشست مع يوديد بروبيديوم يبيدي صبغ (بي) يسمح للمستخدمين للتمييز الحية (بي سلبية) من الخلايا الميتة (بي إيجابية) خلال فاكس 1 <سوب>، 2 ، 10 ، 12 . وقد استخدمت هذه الاستراتيجية سابقا في تحليلات سايتوميتريك تدفق الخلايا الجرثومية الخصية والأمثل على نطاق واسع في الماوس لتمييز ما يصل إلى 9 أنواع الخلايا الجرثومية، بما في ذلك الخلايا في 4 مراحل مختلفة من الانقسام الاختزالي I 1 ، 2 ، 4 ، 16 . لغرض هذا العمل، تلطيخ هويشت ثلاث مزايا رئيسية. أولا، تم تطبيق هو-فاكس بنجاح لعزل الخلايا الجرثومية الذكور في نموذج الماوس 1 ، 2 ، 12 ، والقوارض الأخرى مثل الفئران وخنزير غينيا 17 ، 18 ، 19 . ثانيا، هوشست هو صبغ خلية متخلل ولا يتطلب بيرمابيليزاتيون غشاء، لذلك بريزرفيس سلامة الخلية. وأخيرا، لا حاجة إلى العلاج ريبونوكلياز منذ ربط هويشت تفضيلي لتسلسل الحمض النووي بولي (د [أت]) 1 ، 20 ، مما يعني أنه يتم الحفاظ على الحمض النووي الريبي، بالإضافة إلى الحمض النووي والبروتينات، ويمكن استخدامها لمزيد من الدراسات الجزيئية المصب من الجرثومة تمايز الخلايا.
على الرغم من التشابه في الحمض النووي بلوادي و / أو ستينابيليتي لوحظ في تحليلات التدفق الخلوي من أنواع الثدييات (استعرض في جيسينجر و رودريجيز كاسورياغا 3 )، كان هناك قدر كبير من التباين في البروتوكولات الموصوفة لعزل الخلايا الجرثومية الذكور عن طريق التدفق الخلوي. وقد استخدمت دراسات مختلفة بروتوكولات محددة لتفكك الأنسجة، واستخدمت الأصباغ ملزم الحمض النووي متميزة (وحدها أو في تركيبة) واستراتيجيات فاكس التزوير في الكائنات نموذج مختلف، أساسا الماوس والفئران وخنزير غينيا. ومن ثم، فإن المقارنة المباشرة بين البيانات التي تم جمعها لمختلف الأنواع يمكن أن تتأثر بالتبغوذلك بسبب التباين بين المنهجيات. الأهم من ذلك، فإن حفظ مذهل للديناميات لونين في جميع أنحاء الحيوانات المنوية الثدييات (2N-4N-2N-1N) يشير إلى أن بروتوكول موحد يمكن تطبيقها بشكل عرضي على مجموعة متنوعة من أنواع الثدييات.
وكان الهدف من هذه الدراسة لتطوير سير عمل واحد ينطبق على أنواع الثدييات المختلفة، من خلال الجمع بين وتكييف التقنيات المنشورة سابقا 2 ، 20 . تم تحقيق توحيد طريقة لمعالجة الأنسجة من خلال أداء التفكك الميكانيكية للتغلب على الحاجة إلى تعديلات محددة الأنواع المطلوبة للهضم الأنزيمي 5 . ومن الجدير بالذكر أن تفكك الميكانيكية من الأنسجة القوارض الخصية وقد ثبت أن أداء أفضل من الأنزيمية الهضم الأنسجة 20 و هو-فاكس من تعليق خلية واحدة الناتجة عن كل من الطرق المعرضنتائج مماثلة 5 . كدليل على المبدأ، يصف هذا البروتوكول الإعدادات المستخدمة لعزل ما يصل إلى 5 السكان الخلية الجرثومية: سبيرماتوغونيا (سبغ). (سيك I)، والحيوانات المنوية الثانوية (سيك إي)، والحيوانات المنوية (سبد) - جولة (رسبد) واستطالة (إسبد). الأهم من ذلك، فمن السهل أن تنفذ في المختبر، مع المتطلبات الرئيسية يجري نظام تفكك الأنسجة والوصول إلى فارز الخلية مجهزة ليزر الأشعة فوق البنفسجية. هذا سير العمل ( الشكل 1 ) سريع ومباشر ويسمح العزلة في وقت واحد من 4 السكان الخلايا الجرثومية من الأنسجة الخصية الطازجة في أقل من 2 ساعة. ويعد وقت المعالجة المخفض أمرا حاسما للحفاظ على سلامة الخلوية لمزيد من الإجراءات النهائية. وعلاوة على ذلك، فإن أدائها الناجح في 5 أنواع مختلفة تشير إلى أنه يمكن تطبيقها على نطاق واسع داخل كليد الثدييات، مما يجعلها الطريقة المثلى لعزل الخلايا الجرثومية لدراسات مقارنة من الثدييات التناسلية للذكور الثديياتفوتوني؛.
ويتكون هذا البروتوكول من ثلاثة أقسام رئيسية، وبصرف النظر عن الخطوات التحضيرية: (1) التفكك الميكانيكي للأنسجة الخصية و (2) تلطيخ الخلايا الخصية مع هويشت و بي، تليها (3) فاكس فرز الخلايا المنوية ذات الصلة. مرة واحدة التي تم جمعها، وهذه المجموعات المخصبة من مختلف الخلايا الجرثومية الخصية الثدييات يمكن استخدامها لمجموعة واسعة من التطبيقات. يصف هذا البروتوكول "واحد الحجم يناسب الجميع" طريقة التفكك لتنقية الخلايا الجرثومية الذكور من العديد من أنواع الثدييات المختلفة. اعتمادا على نوع من مستخدمي الدراسة ترغب في إجراء مع الخلايا الجرثومية المعزولة، وسائل الإعلام الأخرى أو المخازن المؤقتة يمكن استخدامها. الخطوات بروتوكول التالية هي لتوليد تعليق خلية واحدة من الخصية الفئران كله.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
جميع الإجراءات الموضحة أدناه تمتثل للوائح لجنة الدراسات الحيوانية في جامعة واشنطن في سانت لويس.
1. الاستعدادات لبروتوكول التفكك الميكانيكية
- قبل الرطب و 50 ميكرون المتاح الأنسجة خرطوشة التفريق للتفكك الخصية الفئران كله.
ملاحظة: يحتوي هذا الخرطوشة المصنوعة من الأنسجة القابل للتصرف على ميكروبلادس مصممة لقطع الأنسجة وشبكة من الصلب غير متحرك مع ما يقرب من 100 ثقوب سداسية. أحجام مختلفة من شبكة للخرسانة تصنيف الأنسجة المتاحة للتكيف مع هذا البروتوكول على أساس الأنواع وأنواع الخلايا المطلوبة. تم استخدام 50 خرطوشة ميكرون لجميع أنواع الثدييات المذكورة في هذه الورقة.- تحميل 1 مل من الجليد الباردة الفينول الأحمر الحرة 1x دولبيكو تعديل النسر المتوسطة (دمم) على 50 ميكرون المتاح خرطوشة الأنسجة التخلص.
ملاحظة: الفينول الأحمر قد تتداخل مع الكشف عن فلوريس الحمراءخلال فترة نظام مراقبة الأصول الميدانية. - نضح 1X دمم من خرطوشة تصنيف الأنسجة مع المتاح 3 مل إبرة أقل حقنة من ميناء حقنة.
- تحميل 1 مل من الجليد الباردة الفينول الأحمر الحرة 1x دولبيكو تعديل النسر المتوسطة (دمم) على 50 ميكرون المتاح خرطوشة الأنسجة التخلص.
- بدوره على نظام تصنيف الأنسجة عن طريق الضغط على زر "أون". هذا النظام لا يتطلب "الاحماء" الوقت.
- قبل الرطب ثلاثة 40 ميكرون مرشحات المتاح مع الجليد الباردة 1X دمم. وضع كل 40 ميكرون مرشح القابل للتصرف على أنبوب مخروطي 50 مل. ماصة 1 مل من 1X دمم والسماح تمر من خلال السائل.
- إعداد 100 مم × 15 ملم طبق بتري لجمع الأنسجة الخصية. ماصة 500 ميكرولتر من دمم 1X على طبق بتري.
2. إعداد الأنسجة الخصية لبروتوكول التفكك الميكانيكية
- تشريح الماوس الذكور لإزالة بعناية الخصيتين كلها جديدة أو شظايا الخصية (إذا التعامل مع أنواع الثدييات الأخرى) مع مقص جراحي وملقط.
ملاحظة: تأكد من أن الأنسجة خالية من الدهون ونخر. الاب إيش الأنسجة الخصية تولد متفوقة واحدة خلية نوعية تعليق من الأنسجة المجمدة.- نقل التي تم جمعها الخصيتين / شظايا إلى 100 مم × 15 مم طبق بتري ملم تحتوي على 500 ميكرولتر من دمم 1X.
- شطف بلطف الأنسجة في دمم 1X لإزالة خلايا الدم الحمراء (إذا كان موجودا).
- إزالة بعناية الغلالة البيضاء الغلالة. سوف سمك الغلالة البيضاء الغلالة تختلف في أنواع مختلفة.
- الاستيلاء على نهاية واحدة من الخصية مع ملقط.
- ثقب الطرف الآخر من الخصية مع مشرط في حين لا يزال عقد نهاية واحدة من الخصية مع ملقط من الخطوة السابقة.
- كشط الأنابيب الخصية باستخدام مشرط في حين لا يزال عقد نهاية واحدة من الخصية مع ملقط من الخطوة 2.2.1.
- قطع الأنابيب الخصية إلى قطع من ~ 2-3 مم 3 باستخدام مشرط.
3. الحصول على تعليق خلية واحدة عن طريق التفكك الميكانيكية من الأنسجة الخصية
أونتنت "> ملاحظة: خطوات التفكك الموصوفة أدناه هي لخصية الفأر البالغة، وينبغي تعديل أحجام الأنسجة الخصية من الفئران الأحداث أو الأنواع غير الفئران وفقا لذلك، وقد لا تحتوي حيوانات الأحداث على جميع مراحل الخلايا الجرثومية، وبعض أنواع الثدييات لديها يتغير تكوين الأنسجة الخصية خلال مواسم التربية مقارنة بموسم غير التزاوج.- نقل قطع صغيرة أنبوبي الخصية إلى قبل تبلل 50 ميكرون خرطوشة الأنسجة تصنيف باستخدام ملقط وإضافة 1 مل من 1X دمم.
- تحميل خرطوشة تصنيف الأنسجة إلى نظام تقسيم الأنسجة وعملية لمدة 5 دقائق عن طريق تحويل مقبض الباب من "الاستعداد" إلى "تشغيل" واسطة.
- إزالة خرطوشة تصنيف الأنسجة من نظام تقسيم الأنسجة ونضح تعليق خلية مع المتاح 3 مل إبرة أقل حقنة من ميناء حقنة.
- نضح عدة مرات لإزالة جميع السائل من الأنسجة خرطوشة التفريق. ليسكل من 1 مل يمكن استردادها من خرطوشة تقسيم الأنسجة.
- تمرير تعليق خلية يستنشق من خلال اثنين من المتاح قبل تبلل مرشحات 40 ميكرون. تصفية مرتين لإزالة أي مجاميع الخلية.
- وضع واحد قبل تبلل 40 ميكرون مرشح في أنبوب مخروطي 50 مل. مباشرة إضافة خلايا يستنشق في حقنة على مرشح 40 ميكرون. ماصة تمر من خلال تعليق خلية واحدة مع ماصة المتاح.
- إزالة المستخدمة قبل تبلل 40 ميكرون تصفية ووضع آخر قبل تبلل 40 ميكرون تصفية في أنبوب مخروطي 50 مل. ماصة التي تم جمعها تعليق خلية واحدة على نظيفة 40 ميكرون مرشح.
- جمع تصفيتها تعليق خلية واحدة مع ماصة المتاح نظيفة.
- ماصة تصفية خلية تصفيتها العودة إلى 50 ميكرون الأنسجة خرطوشة تصنيف وعملية لمدة 5 دقائق أخرى في نظام تصنيف الأنسجة.
- استعادة كل السائل من الأنسجة ديسغراتيعلى خرطوشة.
4. تلطيخ مع هويشت و بروبيديوم يوديد (بي)
- نقل استرداد الخلية المستردة من 50 ميكرون خرطوشة الأنسجة تصنيف إلى أنبوب 1.5 مل نظيفة. سيتم استرداد ما يقرب من 1-1.5 مل من تعليق خلية واحدة.
- تقسيم تعليق خلية واحدة المستردة في أربعة 1.5 مل أو 5 مل أنابيب.
- للأنابيب الثلاثة الأولى، ماصة 150 ميكرولتر من تعليق خلية واحدة وماصة بقية تعليق خلية واحدة في الماضي من الأنابيب الأربعة (ما يقرب من 550 ميكرولتر من تعليق خلية واحدة).
ملاحظة: كمية تعليق خلية واحدة في أنبوب الماضي قد تختلف على أساس كفاءة الانتعاش تعليق الخلية في الخطوة 3.6.
- للأنابيب الثلاثة الأولى، ماصة 150 ميكرولتر من تعليق خلية واحدة وماصة بقية تعليق خلية واحدة في الماضي من الأنابيب الأربعة (ما يقرب من 550 ميكرولتر من تعليق خلية واحدة).
- تعيين أنبوب الأول من الأنابيب الأربعة كسيطرة غير ملوثين لدورة فاكس.
- إعداد صبغة واحدة ملطخة (بي أو هويشت) تعليق الخلية كما الضوابط. إضافة 2.5 ميكرولتر من هويشت أو 1 ميكرولتر من بي إلى كل أنبوب (الثاني والثانيالثالثة).
- إعداد أنبوب ملون مزدوج. سيتم استخدام هذا لجمع المجموعات السكانية الفرعية الخلية الجرثومية. إضافة 2.5 ميكرولتر من هويشت و 1 ميكرولتر من بي إلى أنبوب الماضي.
ملاحظة: هوشست لديه الصلاحية من 2-3 أشهر. استخدام مخزونات أقدم من الصبغة سوف يسبب تغييرات كبيرة خلال جلسة فاكس. - احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة في الظلام. وضع عينات في مدورة أنبوب أو عكس أنابيب 1.5 مل كل 5-10 دقائق.
- تصفية خلية تعليق مع قبل مبلل 40 ميكرون مصفاة والحفاظ على حل تصفيتها على الجليد وفي الظلام حتى جلسة فاكس.
ملاحظة: خطوة الترشيح ضرورية لمنع كتل الخلايا ل فاكس. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام العلاج مع الدناز (انظر الشكل 1 ) أو 2-نافثول-6،8 ديسولفونيك حامض ديبوتاسيوم الملح (ندا 20 ) للحد من تراص الخلايا. سوف فترات الانتظار لفترات طويلة تؤثر على إشارة الفلورسنت الكشف خلال فاكس ويمكن أن يؤدي إلى زيادة موت الخلايا.
5. مضان تنشيط الخلايا فرز (فاكس) إعداد وتنقية الخلايا الخصية
- إعداد فاكس جمع الأنابيب.
- معطف 5 مل أنابيب البولي بروبلين جولة القاع أو أنابيب 1.5 مل مع 400 ميكرولتر من فبس لجمع الخلايا. صب فبس الزائد بعد طلاء.
- إضافة فاكس جمع المتوسطة (1X دمم + 10٪ مصل الأبقار الجنين، فبس) إلى أنابيب: 1 مل ل 5 مل أنابيب أو 100 ميكرولتر ل 1.5 مل أنابيب.
- إعداد شروط الفرز المناسبة في فارز الخلية والبرمجيات.
ملاحظة: آلات فرز الخلايا الأخرى وبرامج التحليل يمكن استخدامها مع استراتيجيات الإعداد والابتسامة مماثلة الموضحة أدناه. تم تكييف الظروف الموصوفة هنا من غايسنسكايا وبورتفين 2 ، جيسينجر ورودريجيز كاسورياغا 3 ، وجيتون، وآخرون. 4- تحميل ليزر الأشعة فوق البنفسجية مع 463/25 نانومتر الفرقة تمرير مرشح للكشف عن هويشت الأزرق و 680 نانومتر لب باند تمرير مرشح للكشف عن هويشت الأحمر وكشف بي.
- استخدام مرآة مزدوج اللون 555DLP لتمييز الأزرق من مضان أحمر.
- استخدام 70 ميكرون فوهة وفرز الخلايا بمعدل 1000-2000 خلية / ثانية.
ملاحظة: كفاءة الفرز يتأثر مباشرة من معدل التدفق. ارتفاع معدلات التدفق (> 3500 الأحداث / ق) زيادة سرعة الفرز ولكن يؤدي إلى تلوث السكان. انظر المرجع 12 للحصول على مزيد من المعلومات.
- تعيين بوابات باستخدام عينات السيطرة.
- تحميل وتشغيل عينة غير ملوثين.
- يستبعد حطام الخلية استنادا إلى نمط فسك مقابل مخطط سك. سوف الحطام الخلية يطفو على السطح في الربع السفلي الأيسر من المؤامرة. تعسفا تعيين عتبة الحطام الخلية من قبل المستخدم أو فني فارز الخلية.
- بوابة على خلايا واحدة عن طريق ضبط عتبة ل فسك وعرض النبض. فارز الخلايا المختلفة لها طرق مختلفة للتمييزغويش سينغليتس. كما يعكس عرض النبض الوقت الخلايا تأخذ لعبور الليزر، خلايا واحدة لها قيم أقل بالمقارنة مع المجاميع متعددة الخلايا. ويمكن استخدام ضبط العتبة على مؤامرة من أجل عرض فسك مقابل النبضة لتحديد سينغليتس.
- تعيين الأمثل أنبوب المضاعفات الضوئية (بمت) الفولتية.
- استخدام كل من ملونين وصبغ واحد ملون الخلايا لإنشاء عتبة بي أو هويشت إشارة مضان.
ملاحظة: من المهم لتحسين الفولتية بتم الأساسية لخلايا الفائدة من أجل إنشاء مجموعة مضان المناسبة لكل صبغ. هذا أمر بالغ الأهمية للكشف عن إشارة الأمثل والحساسية. يتم استخدام خلايا التحكم الملون غير الملوث وحيدة لتأسيس مجموعة من الخلايا الملوثة سلبا وإيجابيا مع بي و / أو أصباغ هويشت وتقليل الضوضاء في الإشارات. لمزيد من التفسيرات حول الأمثل من الجهد بمت باستخدام خلايا التحكم، يرجى الرجوع إلى غايسنسكايا وبورتفين 2 - بوابة، عن، الخلية الحيةs استنادا إلى تلطيخ بي (بي سلبية) و فسك مؤامرة. الخلايا الميتة تكون إيجابية ل بي مضان.
- تعيين بوابة محتوى الحمض النووي عن طريق التآمر رسم بياني من التهم الخلية استنادا إلى مضان الأزرق هويشت. 3 قمم مع زيادة تركيزات هويشت مضان الأزرق يجب أن تظهر، وتمثل هابلويد (1C)، ديبلويد (2C)، وخلايا رباعي رباعي (4C) الخلايا. تعيين 3 بوابات، واحدة لكل ذروة.
- مراقبة ما لا يقل عن 500،000 الأحداث على فسك مقابل مؤامرة سك قبل الشروع في التباعد على السكان الخلية الجرثومية.
- بوابة مختلف السكان الخلايا الجرثومية.
- تحميل هوشست / بي ملون عينة.
- تعيين أول 3 بوابات الأم المشتركة بين جميع السكان.
- استبعاد الحطام الخلية على أساس فسك مقابل مؤامرة سك. حدد سينغليتس استنادا إلى فسك مقابل مؤامرة نبض العرض. حدد الخلايا الحية عن طريق النابضة بي الخلايا السلبية.
- تحديد بوابة سبيرماتوغونيا.
- مؤامرة بي الخلايا السلبية على أساس هويشت الأزرق والأحمر مضانشدة. تظهر سبيرماتوغونيا كما السكان الجانب (انظر الشكل 1 ).
- تحديد بوابات للسكان الخلية الجرثومية المتبقية. ملاحظة: راجع الشكل 1 والشكل التكميلي 2 للتفاصيل البصرية.
- مؤامرة بي الخلايا السلبية في بوابة محتوى الحمض النووي.
- ل سبيرماتيدس بوابة الذروة مع أدنى هويشت مضان (1C).
- للحيوانات المنوية إي، بوابة ذروة مع مضان هويشت المتوسطة (2C).
- للحيوانات المنوية I، بوابة ذروة مع أعلى مضان هويشت (4C).
- مؤامرة هويشت الأزرق والأحمر مضان شدة لصقل الحيوانات المنوية والسكان الحيوانات المنوية السكان من بوابات محتوى الحمض النووي.
- جمع بوابات سكانية مختارة في أنابيب جمع أعدت سابقا. وسوف يستغرق كل الخصية في المتوسط 45 دقيقة إلى 1.5 ساعة لجمع ما يقرب من 0.5-6.0 × 10 6 خلايا لكل سكان فرعية.
ملاحظة: التعرض لفترات طويلة خلية ل هويشست ماy تحول قليلا موقع السكان مع مرور الوقت. قم بتحديث الإعدادات بعد 20-30 دقيقة من فاكس. سوف يكون الحد الأقصى للمردود لكل فئة فرعية يتوقف على كفاءة خطوة التفكك.
6. تقييم المجهري من الخلايا المنقى
- تدور الخلايا التي تم جمعها في 500-600 x ج في 4 درجات مئوية لمدة 10 دقيقة.
- إعادة تعليق بيليه الخلية مع 1 مل من الجليد الباردة حل 1X الفوسفات العازلة (بس) أو دمم 1X.
ملاحظة: يمكن تعديل حجم إعادة تعليق وفقا لعدد الخلايا فرزها والتركيز النهائي المطلوب. - ماصة 40 ميكرولتر من الخلايا غسلها على شريحة زجاجية نظيفة ووضع ساترة.
- إصلاح الخلايا المتبقية مع بارافورمالدهيد 4٪ (بفا) وتخزين الخلايا الثابتة في 4 درجات مئوية في الظلام للرجوع إليها في المستقبل.
- ماصة 100 ميكرولتر 4٪ بفا مباشرة في أنابيب جمع.
- دوامة لفترة وجيزة الأنابيب أو ماصة بضع مرات لضمان حسن خلط تعليق الخلية.
- تصور الشرائح أعدت في المجهر مجهزة مصباح الأشعة فوق البنفسجية للكشف عن مضان هويشت تحت الهدف 63X. الرجوع إلى قسم النتائج - تقييم مورفولوجيك لسكان الخلايا الجرثومية فرزها - لمزيد من التفاصيل حول كيفية تحديد أنواع الخلايا الجرثومية محددة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تعليق خلية واحدة من التفكك الميكانيكي للأنسجة الخصية
الشكل 2 يقارن تعليق خلية واحدة التي حصل عليها التفكك الميكانيكية من الأنسجة الخصية الماوس تحت ظروف مختلفة. العينات التي تم الحصول عليها عن طريق تجهيز الأنسجة الطازجة، غير ملوثين ( الشكل 2A ) أو ملطخة هويشت ( الشكل 2B
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
وبالنظر إلى ديناميات لونين المحفوظة للغاية أثناء الحيوانات المنوية في الثدييات، وكان الهدف من هذا العمل لتطوير بروتوكول لعزل الخلايا الجرثومية الذكور في مراحل متميزة من التمايز من الأنسجة الخصية مختلفة الثدييات ( الشكل 1 ). واحدة من العقبات الرئيسية في تطبيق سير العمل واحد لنماذج حيوانية مختلفة هي الحاجة إلى تعديلات محددة الأنواع، وخاصة فيما يتعلق بروتوكولات الأنسجة التفكك. الطرق الحالية تعتمد في الغالب على الهضم الأنزيمي والبروتوكولات في كثير من الأح...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
جميع المؤلفين تعلن أي مصالح المتنافسة.
شكر وتقدير
المؤلفين أشكر مستشفى هيلسايد الحيوان (سانت لويس، مو) لكلب الخصيتين. جيسون أراند ومختبر الدكتور تيد سيسرو في جامعة واشنطن في سانت لويس (واشو) لتوفير الخصيتين الفئران و بريان تابيرس للمساعدة في جمع؛ جاريد هارتسوك ومختبر الدكتور سالت في واشو للخصيتين خنزير غينيا. والدكتور مايكل تالكوت في قسم الطب المقارن في واشو لخياطة الخصية المصغرة. كما يعترف المؤلفون بمركز ألفين جيه سيتمان للسرطان في كلية الطب بجامعة واشنطن ومستشفى بارنز اليهودي في سانت لويس، مو، لاستخدام جهاز سيتمان فلو سايتوميتري كور الذي يوفر خدمة فرز الخلايا التي يديرها الموظفون. يتم دعم مركز السرطان سيتمان في جزء من نسي دعم مركز السرطان منحة # P30 CA91842.
وقد تم تمويل هذا البحث من قبل زمالة دكتوراه فكت [سفر / بد / 51695/2011 إلى أكل]، ومنح من الولايات المتحدة المعاهد الوطنية للصحة [R01HD078641 و R01MH101810 إلى Dفك] وعقد بحثي [فك / 01262/2014 إلى مكافحة غسل الأموال].
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 4٪ بارافورمالدهايد | VWR | # 15710 | 4٪ PFA ، لتثبيت الخلايا المصنفة |
| Medimachine | BD Biosciences | # 340588 ؛ | نظام تفكك الخصية |
| 1X Dulbecco تعديل تقنيات النسر متوسط | الحياة | # 31053 | DMEM ، لتفكك الخصية |
| Medicon | BD Biosciences | # 340591 | خرطوشة التفكيك لتفكك الخصية |
| مصل الأبقار الجنيني | Thermo Scientific | # 10082139 | FBS ، لمجموعة FACS |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | #H3570 | Hoecsht ، لتلوين |
| FACS40 وميكرو ؛ مصفاة الخلايا m | GREINER BIO-ONE | # 89508-342 | لتفكك الخصية |
| 100 × 15 مم طبق بتري | Falcon | # 351029 | لتشريح الخصية |
| 5 مل أنابيب البولي بروبيلين المستديرة القاع Falcon | # 352063 | لمجموعة FACS | |
| 1.5 مل أنابيب Eppendorf | VWR | # 20170-650 | لمجموعة FACS |
| 3 مل حقنة لا داعي لها | BD Biosciences | #309657 | لتفكك الخصية |
| 50 مل أنبوب مخروطي | MIDSCI | لتفكك الخصية | |
| بروبيديوم يوديد | Invitrogen | #L7011 | PI ، لتلوين FACS |
| فارز الخلايا MoFlo Legacy | Beckman Coulter | #ML99030 | |
| لبرنامج فرز الخلايا FACS Summit | Beckman Coulter | #ML99030 | لمحلول |
| ملحي مخزن فوسفات | FACS Thermo Scientific | #AM9625 | PBS ، للفحص |
| المجهري شريحة زجاجية | مجهرية فيشر Scientific | # 12-544-4 | للفحص |
| غطاء زجاجي | فيشر علمي | # 12-548-87 | للفحص المجهري |
| ماصة نقل يمكن التخلص منها (3 مل) سامكو | العلمية | # 225 | لتفكك الخصية |
| DNase I | Roche | # 10104159001 | لتفكك الخصية |
| شفرة جراحية من الفولاذ الكربوني | Miltex | # 4-111 | لتشريح الخصية |
| عداد الخلايا الآلي للكونتيسة | Invitrogen | #C10227 | لعد الخلايا التلقائي |
| محلول Trypan الأزرق (0.4٪) | Sigma | #T8154 | لتلطيخ الجدوى |
المراجع
- Bastos, H., et al. Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis. Cytometry A. 65 (1), 40-49 (2005).
- Gaysinskaya, V., Bortvin, A. Flow cytometry of murine spermatocytes. Curr Protoc Cytom. 72, (2015).
- Geisinger, A., Rodriguez-Casuriaga, R. Flow cytometry for gene expression studies in Mammalian spermatogenesis. Cytogenet Genome Res. 128 (1-3), 46-56 (2010).
- Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. Flow cytometry purification of mouse meiotic cells. J Vis Exp. (50), (2011).
- Lima, A. C., et al. Multispecies Purification of Testicular Germ Cells. Biol Reprod. , (2016).
- Bryant, J. M., Meyer-Ficca, M. L., Dang, V. M., Berger, S. L., Meyer, R. G. Separation of spermatogenic cell types using STA-PUT velocity sedimentation. J Vis Exp. (80), (2013).
- Chang, Y. F., Lee-Chang, J. S., Panneerdoss, S., MacLean, J. A. 2nd, Rao, M. K. Isolation of Sertoli, Leydig, and spermatogenic cells from the mouse testis. Biotechniques. 51 (5), (2011).
- Margolin, G., Khil, P. P., Kim, J., Bellani, M. A., Camerini-Otero, R. D. Integrated transcriptome analysis of mouse spermatogenesis. BMC Genomics. 15, 39(2014).
- Ormerod, M. G. Flow Cytometry - A Basic Introduction. , Available from: http://flowbook.denovosoftware.com/ (2008).
- Grogan, W. M., Farnham, W. F., Sabau, J. M. DNA analysis and sorting of viable mouse testis cells. J Histochem Cytochem. 29 (6), 738-746 (1981).
- Mays-Hoopes, L. L., Bolen, J., Riggs, A. D., Singer-Sam, J. Preparation of spermatogonia, spermatocytes, and round spermatids for analysis of gene expression using fluorescence-activated cell sorting. Biol Reprod. 53 (5), 1003-1011 (1995).
- Gaysinskaya, V., Soh, I. Y., van der Heijden, G. W., Bortvin, A. Optimized flow cytometry isolation of murine spermatocytes. Cytometry A. 85 (6), 556-565 (2014).
- Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J Exp Med. 183 (4), 1797-1806 (1996).
- Watson, J. V., Nakeff, A., Chambers, S. H., Smith, P. J. Flow cytometric fluorescence emission spectrum analysis of Hoechst-33342-stained DNA in chicken thymocytes. Cytometry. 6 (4), 310-315 (1985).
- Lassalle, B., et al. 'Side Population' cells in adult mouse testis express Bcrp1 gene and are enriched in spermatogonia and germinal stem cells. Development. 131 (2), 479-487 (2004).
- Omran, H. M., Bakhiet, M., Dashti, M. G. DNA integrity is a critical molecular indicator for the assessment of male infertility. Mol Med Rep. 7 (5), 1631-1635 (2013).
- Rodriguez-Casuriaga, R., Folle, G. A., Santinaque, F., Lopez-Carro, B., Geisinger, A. Simple and efficient technique for the preparation of testicular cell suspensions. J Vis Exp. (78), (2013).
- Rodriguez-Casuriaga, R., Geisinger, A., Santinaque, F. F., Lopez-Carro, B., Folle, G. A. High-purity flow sorting of early meiocytes based on DNA analysis of guinea pig spermatogenic cells. Cytometry A. 79 (8), 625-634 (2011).
- Rodriguez-Casuriaga, R., et al. Rapid preparation of rodent testicular cell suspensions and spermatogenic stages purification by flow cytometry using a novel blue-laser-excitable vital dye. MethodsX. 1, 239-243 (2014).
- Rodriguez-Casuriaga, R., et al. Ultra-fast and optimized method for the preparation of rodent testicular cells for flow cytometric analysis. Biol Proced Online. 11, 184-195 (2009).
- Hess, R. A., Renato de Franca, L. Spermatogenesis and cycle of the seminiferous epithelium. Adv Exp Med Biol. 636, 1-15 (2008).
- Zhao, H., Traganos, F., Dobrucki, J., Wlodkowic, D., Darzynkiewicz, Z. Induction of DNA damage response by the supravital probes of nucleic acids. Cytometry A. 75 (6), 510-519 (2009).
- Gassei, K., Ehmcke, J., Dhir, R., Schlatt, S. Magnetic activated cell sorting allows isolation of spermatogonia from adult primate testes and reveals distinct GFRa1-positive subpopulations in men. J Med Primatol. 39 (2), 83-91 (2010).
- Hayama, T., et al. Practical selection methods for rat and mouse round spermatids without DNA staining by flow cytometric cell sorting. Mol Reprod Dev. 83 (6), 488-496 (2016).
- Zhu, L., et al. FACS selection of valuable mutant mouse round spermatids and strain rescue via round spermatid injection. Zygote. 23 (3), 336-341 (2015).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
