Method Article

تعديل محطة الطرفية تقييد جزء تحليل لقياس طول تيلومير باستخدام التهجين في هلام

DOI:

10.3791/56001

⸱

July 10th, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Departments of Pathology and Infectious Diseases and Microbiology, University of Pittsburgh, 2University of Pittsburgh Cancer Institute, 3Department of Environmental and Occupational Health, University of Pittsburgh, 4Departments of Psychiatry, Psychology, Behavioral & Community Health Sciences, University of Pittsburgh

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه المقالة، ويناقش بروتوكول مفصل لقياس طول تيلومير باستخدام تعديل جزء طرفية تحليل جزء الذي يوفر قياسا سريعا وفعالا مباشرة من طول تيلومير. ويمكن تطبيق هذه التقنية على مجموعة متنوعة من مصادر الخلايا من الحمض النووي لقياس طول تيلومير.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هناك العديد من التقنيات المختلفة لقياس طول التيلومير، ولكل منها مزاياها وعيوبها. يستخدم النهج التقليدي، تحليل تيلومير تقييد جزء (ترف)، تقنية التهجين الحمض النووي حيث يتم هضم عينات الحمض النووي الجيني مع الانزيمات تقييد، وترك وراءها تيلومير الحمض النووي يكرر وبعض الحمض النووي تيلوميري الفرعية. يتم فصل هذه عن طريق الكهربائي الاغاروز هلام، ونقلها إلى غشاء فلتر وهجين إلى تحقيقات قليل النوكليوتيد الموسومة مع إما التوهج أو النشاط الإشعاعي لتصور شظايا تقييد تيلومير. هذا النهج، في حين تتطلب كمية أكبر من الحمض النووي من التقنيات الأخرى مثل ير، يمكن قياس توزيع طول تيلومير من السكان من الخلايا ويسمح قياس أعرب في كيلوباسس المطلقة. توضح هذه المخطوطة إجراء تهجين الحمض النووي المعدل لتحديد طول تيلومير. يتم هضم الحمض النووي الجيني لأول مرة مع الانزيمات تقييد (التي لا قطعالتيلوميرات) وفصلها الكهربائي الاغاروز هلام. ثم يتم تجفيف الجل والحمض النووي هو التشويه والتحريف في الموقع إلى التحقيق أوليغونكلأوتيد راديولبلد. هذا التهجين في الموقع يتجنب فقدان الحمض النووي تيلومير ويحسن كثافة الإشارة. بعد التهجين، يتم تصوير المواد الهلامية باستخدام شاشات الفوسفور ويتم قياس طول تيلومير باستخدام برنامج الرسوم البيانية. وقد تم تطوير هذا الإجراء من قبل مختبرات الدكاترة. وودرينغ رايت وجيري شي في جامعة تكساس جنوب غرب 1 ، 2 . هنا، نقدم وصفا مفصلا لهذا الإجراء، مع بعض التعديلات.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تيلوميرس، وتقع في نهايات الكروموسومات، وتكرر النيوكليوتيدات من تسلسل تغغ (على الكروموسومات البشرية) التي تلعب دورا حاسما في حماية المعلومات الوراثية الخلوية 3 ، 4 ، 5 . التيلوميرات هي عدة آلاف من أزواج قاعدة في الطول وتعمل على حماية سلامة بقية الكروموسوم خلال تكرار الحمض النووي. النسخ المتماثل من الكروموسومات ليست مثالية مما أدى إلى الغايات من الكروموسوم لا يتم نسخ تماما. ويسمى هذا عدم الكفاءة في تكرار "مشكلة تكرار نهاية" ويؤدي إلى فقدان بعض تيلومير يكرر خلال كل جولة من النسخ المتماثل 6 ، 7 . يمكن استعادة طول تيلومير بعد انقسام الخلايا عن طريق تيلوميراز، وهو انزيم الذي يحل محل تسلسل تيلومير المفقودة 8 ، 9 . ومع ذلك، التيلوميراز ليس كذلكتنشيطها في معظم الخلايا الجسدية البشرية ونتيجة لذلك، مع مرور الوقت، سوف تلوميرس تقصير، مما أدى في النهاية إلى الشيخوخة الخلوية 10 . نظرا لتقصير التيلومير، تعتبر التيلوميرات علامة بيولوجية للشيخوخة وخطر الأمراض المرتبطة بالعمر 11 ، 12 . بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تتأثر طول تيلومير من العوامل الوراثية والبيئية، ونمط الحياة وغيرها من المحفزات مثل الإجهاد التأكسدي، مشيرا إلى أن طول تيلومير يمكن أن تلعب دورا كعلامة بيولوجية في الدراسات السمية والوبائية والسلوكية 13 ، 14 ، 15 .

توضح هذه المقالة تقنية لقياس طول التيلومير باستخدام تحليل مقطعي طرفية مقسم (ترف) تم تكييفه من مندر وشاي 2 وكيمورا وآخرون. 16 ، ومثل هربرت، شاي والريغهت 1 و هوسمان و موك 17 . تقليديا، تحليل ترف ينطوي على إجراء لطخة الجنوبية. وتعتبر البقع الجنوبية "معيار الذهب" لدراسة طول تيلومير وتستخدم بنشاط لدراسة طول الكريات البيض في دراسات علم الأوبئة 18 . يستخدم هذا التحليل ترف هضم الحمض النووي الجيني ترك وراء تيلومير يكرر. ثم يتم فصل شظايا الحمض النووي عن طريق الرحلان الكهربائي، والتشويه والتحويل إلى غشاء النيتروسليلوز. يتم تهجين متواليات التيلومير إلى مسبار قليل النوكليوتيد تيلومير. بدلا من نقل التيلوميرات فصل إلى غشاء، تقنيات ترف أخرى تستخدم في التهجين هلام تقنيات مع وبدون تمسخ الحمض النووي. إن إدراج التشوه مهم عند النظر في الكشف عن التيلوميرات الخلالية، التي تم الإبلاغ عنها في بعض الأنواع 19 . الإجراءات التي تفتقر إلى تغيير طبيعة الخطوات فقط كشف ثه واحد تقطعت بهم السبل الحمض النووي الذين تقطعت بهم السبل في تلوميرس الطرفية ولن ربط تسلسل تيلومير الخلالي 18 .

إلى جانب تحليل ترف، وهناك العديد من التقنيات الأخرى لقياس طول تيلومير أن لكل منها مزاياها وعيوبها. تقنية تدفق فيش يمكن قياس متوسط ​​طول تيلومير من الخلايا الفردية من نوع خلية متميزة باستخدام التدفق الخلوي 16 ، 20 . في حين أنه يمكن أن علامة بدقة التيلوميرات مع تحقيقات محددة للغاية وتقليل الخطأ البشري من خلال الأتمتة، تدفق الأسماك هي مكلفة وأقل كفاءة ويتطلب عينات جديدة وفني ذو مهارات عالية، مما يحد من قدرتها على دراسات علم الأوبئة 16 . وبالإضافة إلى ذلك، هذه الطريقة لا تمثل التغيرات المحتملة في عدد الكروموسومات في عدد السكان الخلية. تقنية أخرى، قر، مقبولة على نطاق واسع كوسيلة لقياس طول تيلومير لدراسات علم الأوبئة 16 بسبب إنتاجية عالية، منخفضة التكلفة ومتطلبات كميات صغيرة من الحمض النووي مقارنة مع أساليب أخرى. ومع ذلك، قر يمكن فقط قياس متوسط ​​محتوى الحمض النووي تيلوميريك نسبة إلى الجين نسخة واحدة، وبالتالي، تقدير غير مباشر لمتوسط ​​طول التيلومير. كما أنها تعطي معامل عال من التباين في دراسات المقارنة، مقارنة مع البقع الجنوبية، مما يؤدي إلى دقة مشكوك فيها 21 .

الإجراء ترف له أوجه القصور الخاصة التي تحد من استخدامه لبعض الدراسات. تقنيات ترف تتطلب كمية كبيرة من الحمض النووي مقارنة مع أساليب أخرى (بين 2 و 3 ميكروغرام لكل عينة). وهذا يحد من تطبيقات التقنية لفحص طول تيلومير من العينات السريرية التي يمكن جمع الحمض النووي الجيني كافية، ولا يمكن استخدامها على عينات الحمض النووي المتدهورة. بالإضافة إلى ذلك، فإن تحليل ترف مكلف وكثيفة العمالة، والتي تتطلب 4-5 أيام لتحقيق نتائج. ومع ذلك، فإن ترف ينتج معامل انخفاض التباينمنح استنساخه. في حين أن هذا البروتوكول هو مختلف عن لطخة الجنوبية التقليدية (الاستفادة في الموقع التهجين هلام)، وتقنيات اثنين هي في الأساس نفسه.

التقنية المعروضة هنا هي مزيج من لطخة الجنوبية وهجن في التهجين. ربط خطوة تغيير طبيعة الحمض النووي من البقع الجنوبية مع التهجين في هلام. هذا الجمع لديه فائدة إضافية من تحسين قوة إشارة التحقيق مقارنة مع لطخة الجنوبية، وقد أسفرت باستمرار نتائج قابلة للقياس داخل مختبرنا. بالإضافة إلى ذلك، فإن استخدام تحقيقات المشعة بدلا من تحقيقات تشيميلومينسنت يعطي كثافة إشارة أعلى ويسمح للتصور والتقدير الكمي مع فوسفهوريماجر، مما يجعل تحليلات ترف سهل الاستعمال.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. استخراج الحمض النووي الجيني

  1. إجراء استخراج الحمض النووي الجيني من الخلايا (هنا، خط الخلية بج-هتيرت) ليتم تحليلها باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي التجارية، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
  2. قياس تركيز الحمض النووي مع مطياف. إذا كان تركيز الحمض النووي أقل من 100 ميكروغرام / مل، يعجل الحمض النووي مع الإيثانول و ريسوسبيند في حجم المخزن المؤقت تي (10 ملي تريس كل؛ 0.1 ملي إدتا (إثيلينديامينيتتراسيتيك حمض)؛ الرقم الهيدروجيني 8.0)، لضمان تركيز الحمض النووي من 100-600 ميكروغرام / مل).

2. تقييم النزاهة الحمض النووي

ملاحظة: هذا الجزء من بروتوكول يحدد تقييم سلامة الحمض النووي باستخدام نظام هلام الكهربائي مع 11 سم × 14 سم هلام. ويمكن أيضا أن تستخدم أنظمة أخرى وأحجام هلام، ولكن الجهد ووقت الهجرة الحمض النووي قد تختلف.

  1. إعداد هلام الاغاروز 1٪ من خلال الجمع بين 1 غرام من الاغاروز الصف الكهربائي في 100 مل من العازلة تاي 1X (40 ملي ترهي قاعدة. 20 ملي حمض الخليك. 2 ملي إدتا؛ ودرجة الحموضة 8.5) والميكروويف حتى يتم حل الاغاروز والحل واضح. تبريد الحل في درجة حرارة الغرفة حتى تصل إلى 50 درجة مئوية (حوالي 15-20 دقيقة).
  2. في حين أن الحل أغاروس التبريد، وإعداد هلام الصب صينية بإضافة الصب نهاية البوابات إلى علبة الصب. لمنع تسرب الاغاروز، تبريد البوابات نهاية إلى 4 درجات مئوية قبل أن تعلق على علبة الصب.
  3. مرة واحدة وقد تبرد محلول الاغاروز إلى 50 درجة مئوية، إضافة 10 ميكرولتر من إيثيديوم بروميد (10 ملغ / مل في د 2 O) وتصب حل الاغاروز في علبة الصب هلام. إضافة المشط إلى علبة الصب.
  4. السماح الحل أغاروس لتصلب لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  5. إعداد عينات الحمض النووي للالكهربائي عن طريق تمييع 25 نانوغرام من الحمض النووي الجيني باستخدام 1X العازلة تي إلى الحجم النهائي من 9 ميكرولتر وإضافة 1 ميكرولتر من 10X تحميل صبغ (0.25٪ (ث / ت) بروموفينول الأزرق، 0.25٪ (ث / ت) زيلين سيانول فف، 30٪ (ت / ت) الجلسرين). اخلط جيدا.
    6. إعداد نظام هلام الكهربائي للهجرة الحمض النووي عن طريق ملء نظام الكهربائي مع العازلة تاي 1X بحيث مستوى العازلة هو عدة مليمترات فوق هلام. تحميل آبار الجل مع كامل عينات الحمض النووي. إضافة 5 ميكرولتر من سلم الحمض النووي لبئر واحد.
  6. تشغيل هجرة الحمض النووي في 100 V لمدة حوالي 2 ساعة أو حتى الصبغة الزرقاء البروموفينول هو ما يقرب من نصف الطريق من خلال هلام.
  7. صورة هلام باستخدام الأشعة فوق البنفسجية ترانزيلوميناتور أو ما يعادلها.
    ملاحظة: عينات الحمض النووي مع سلامة جيدة لديها فرق الوزن الجزيئي عالية مع عدم تلطيخ (وهذا يرجع إلى دنا القص أو كسر). إذا تم تلطيخ نطاقات الحمض النووي، لديهم سلامة منخفضة وغير مناسبة لتحليل لطخة الجنوبي، ويجب أن يعاد عزل الحمض النووي مع الخلايا الطازجة.

3. الجينوم الحمض النووي الهضم

  1. أداء عملية الهضم من الحمض النووي الجيني في الحجم النهائي من 20-40 ميكرولتر.
    ملاحظة: أحجام أكبرمن 40 ميكرولتر سوف تتجاوز الآبار من هلام الاغاروز.
    1. الجمع بين 3 ميكروغرام من الحمض النووي الجيني والمبلغ المناسب من 10X دنا الهضم العازلة (الموردة مع الإنزيمات تقييد) بحيث تركيز النهائي هو 1X، في ميكروتوب. إضافة 1 ميكرولتر من انزيم تقييد رساي (10000 U / مل) و 1 ميكرولتر من إنزيم تقييد هينفي (10000 U / مل) إلى كل أنبوب. ضبط الحجم النهائي باستخدام العقيمة، منزوع الأيونات H 2 O. مزيج جيدا. أجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة (10 - 15 ثانية في 16،000 x ج) للتأكد من أن جميع المكونات هي في الجزء السفلي من الأنبوب.
  2. احتضان الهضم عند 37 درجة مئوية لمدة ≥16 ساعة. بعد الهضم، وتخزين الحمض النووي هضمها في 4 درجات مئوية أو -20 درجة مئوية لمدة لا تزيد عن 2 أيام إذا لزم الأمر 17 .

4. الجينوم الحمض النووي جل الكهربائي

ملاحظة: هذا الجزء من بروتوكول يحدد إجراء لاستخدام 20 سم × 25 سم نظام هلام الكهربائي. هلام مختلفة الكهربائيةيمكن استخدام أنظمة التفرغ، ولكن قد تحتاج العديد من المتغيرات إلى تعديل بما في ذلك الجهد، وقت الهجرة وكمية العازلة الكهربائي تضاف إلى النظام من أجل تحقيق نتائج مثلى.

  1. إعداد حل الاغاروز 0.6٪ من خلال الجمع بين 2.25 غرام من هلام الكهربائي الصف الاغاروز مع 375 مل من العازلة الكهربائي، إما 1X تاي أو 0.5X تب (110 ملي قاعدة تريس، 90 ملي حمض البوريك، 2.5 ملي إدتا، ودرجة الحموضة 8.3).
    ملاحظة: بالنسبة للتيلوميرات التي تقل عن 8،000 كيلوبايت، يوصى ب 0.5x تب بينما يوصى باستخدام 1X تاي للتيلوميرات بين 8،000 كيلوبايت و 20،000 كيلوبايت 1 .
  2. ميكروويف الحل حتى يذوب الاغاروز والحل واضح. السماح للحل لتبرد لمدة 15-20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة أو حتى تصل الاغاروز 50 درجة مئوية.
  3. في حين أن الحل الاغاروز هو التبريد، وإعداد نظام هلام الكهربائي ل هلام الصب كما هو موضح في الخطوة 2.2. صب حل هلام الاغاروز في علبة الصب هلام. وضع مشط فيهلام. السماح هلام لتصلب لمدة 45 دقيقة كشفت في درجة حرارة الغرفة.
  4. إعداد عينات الحمض النووي هضمها للالكهربائي. لرد فعل 40 أول، إضافة 0.4 ميكرولتر من 10X صبغ التحميل في كل عينة من الحمض النووي هضمها. أجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة (10-15 ق، 16000 x ج) للتأكد من أن كل من الحل هو في الجزء السفلي من الأنبوب.
  5. إعداد نظام هلام الكهربائي للهجرة الحمض النووي. إزالة البوابات نهاية ومشط من هلام. ملء النظام الكهربائي هلام مع 1X تاي أو 0.5X تب إلى خط التعبئة، وضمان أن الجل مغمورة تماما في المخزن المؤقت.
  6. تحميل آبار الجل مع عينات الحمض النووي مثل أن هناك بئر فارغة بين العينات. تجنب تسبب فقاعات أو ثقب هلام. إضافة 10 ميكرولتر من سلم الحمض النووي في الآبار على طرفي نقيض من هلام.
    ملاحظة: نوع سلم الحمض النووي يعتمد على طول التيلوميرات، والتي سوف تختلف من شخص لآخر وبين مصادر الخلايا.
  7. تشغيل الكهربائي هلام في 150 V لمدة 30 دقيقة للتحرك بسرعة الحمض النووي في هلام. ثم ضبط الجهد إلى 57 فولت وتشغيل لمدة 18-24 ساعة.

5. جل الفلورسنت التصوير والتهجين

  1. بعد 18-24 ح، إيقاف مصدر الطاقة الكهربائي هلام. إزالة علبة الصب هلام مع هلام من العازلة الكهربائي. شريحة قبالة الزاوية اليمنى العليا من هلام لتكون بمثابة مرجع لتوجه هلام.
  2. إعداد قطعة من ورقة الترشيح عن طريق قطع الورق ليكون حجم أكبر قليلا من هلام. وضع ورقة الترشيح على الجزء العلوي من هلام في علبة الصب والسماح للورقة لامتصاص الحل الزائد على هلام. إزالة بعناية فقاعات الهواء بين ورقة الترشيح والهلام باستخدام ماصة كما الأسطوانة للضغط على فقاعات من خلال الجانبين.
  3. إزالة هلام من علبة الصب عن طريق التقليب هلام وورق الترشيح أكثر من ذلك أن الورق هو تحت هلام. نقل الجل مع ورقة الترشيح إلى مجفف هلام وتغطيهلام مع التفاف البلاستيك. إزالة جميع فقاعات الهواء بين التفاف البلاستيك والهلام باستخدام ماصة كما الأسطوانة.
  4. تجفيف هلام لمدة 2 ساعة عند 50 درجة مئوية.
  5. مرة واحدة المجففة، وإزالة التفاف البلاستيك ونقل الجل وفلتر ورقة إلى طبق زجاج يحتوي على 250 مل من الماء منزوع الأيونات (كافية لتغطية هلام). إزالة بعناية ورقة الترشيح واحتضان هلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. سوف يكون هلام رقيقة، حازمة وسهلة للتلاعب دون تمزيق.
  6. إعداد 5X سك حل (750 ملي كلوريد الصوديوم، 75 ملي سترات الصوديوم) في الماء منزوع الأيونات.
  7. وضع الجل على رأس شبكة من النايلون (12 في × 12 بوصة). لفة شبكة النايلون والهلام معا التأكد من أن هلام ليست على اتصال مع نفسها. وضع شبكة وهلام في أنبوب التهجين (على سبيل المثال ، 12 في أنبوب مع 1.5 في القطر).
    ملاحظة: عندما تدحرجت بشكل صحيح، فإن هلام يكون على اتصال مع شبكة النايلون على كلا الجانبين.
  8. الجمع بين 100 مل من سك 5X و 12 ميكرولتر من الأخضر الفلورسنت النووي أسيد وصمة عار، ومكان في أنبوب التهجين. حماية الحل من الضوء واحتضان لمدة 30 دقيقة في 42 درجة مئوية في فرن التهجين مع دوران.
  9. إزالة شبكة النايلون / هلام من أنبوب التهجين، لفة مفتوحة ومكان شقة في طبق زجاج يحتوي على 250 مل من الماء منزوع الأيونات، وإزالة بلطف شبكة النايلون. صورة هلام باستخدام فوسفهوريماجر. استخدام إعدادات الفلورسنت: 520 بب، 40 الأزرق و 488 نانومتر. تعيين أنبوب مضخم (بمت) إلى 375، الطائرة البؤرية إلى +3 ملم والحساسية إلى وضعها الطبيعي. حفظ الصورة إلى ملف.

6. التهجين

  1. إعداد مسبار تيلومير المشعة.
    1. الجمع بين 2 ميكرولتر (2 نانوغرام) من التحقيق تيلومير (5- (سك تا) 4 3 ')، 2.5 ميكرولتر من 10X بولينوكليوتيد كيناز رد فعل العازلة، 3 ميكرولتر من γ 32 P-داتب (6000 سي / ممول)، 4 ميكرولتر من T4 الكيناز بولينوكليوتيد والدناز مجانا، الماء منزوع الأيونات معقم إلى الحجم النهائي من 20 ميكرولتر في ميكرأنبوب أوسنتريفوج.
      تنبیھ: اتبع السلامة واللوائح الإشعاعیة للمرافق عند استخدام النشاط الإشعاعي.
  2. طرد مركزي لفترة وجيزة (10-30 ثانية في 16،000 x ج) واحتضان في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. أجهزة الطرد المركزي لمدة 10-30 ثانية في 16000 x ج واحتضان عند 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة لوقف رد الفعل.
  3. باستخدام العمود G-25 اللوني ميكروسبين، مزيج من محتويات العمود بواسطة فورتيكسينغ، ثم الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 700 x ج في درجة حرارة الغرفة. تجاهل الترشيح.
  4. تحميل الحل التحقيق المشعة في العمود اللوني G-25 وأجهزة الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 700 × ز. حفظ الترشيح.
    ملاحظة: الحفاظ على الترشيح لأن هذا يحتوي على التحقيق تيلومير المشعة. يمكن تخزين مسبار المشعة في 4 درجات مئوية إذا لزم الأمر.
  5. إعداد 250 مل من حل تغيير طبيعة تتألف من 1.5 M كلوريد الصوديوم و 0.5 M هيدروكسيد الصوديوم في الماء منزوع الأيونات معقم.
  6. وضع هلام في طبق زجاج يحتوي على 250 مل من تغيير طبيعة الحل وحاضنةأكل لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. إزالة حل تغيير طبيعة واستبدالها مع 250 مل من الماء منزوع الأيونات معقم. احتضان لمدة 10 دقيقة على شاكر المداري (40 - 50 دورة في الدقيقة) في درجة حرارة الغرفة.
  7. إعداد 250 مل من محلول تحييد تتألف من 1.5 كلوريد الصوديوم و 0.5 M حمض تريس الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.0 في الماء منزوع الأيونات معقم.
  8. إزالة الماء منزوع الأيونات واستبدالها مع 250 مل حل التعادل واحتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  9. خلال الحضانة في محلول التعادل، وإعداد 50 مل حل التهجين تتألف من 5X سك، 5X حل دينهاردت (0.1٪ البوليمر الاصطناعية غير الأيونية، 0.1٪ البولي فينيل بيروليدين، 0.1٪ ألبومين المصل البقري)، 10 ملي فوسفات الصوديوم (نا 2 هبو 4 ) و 1 ملي الصوديوم بيروفوسفات تيتراباسيك ديكاهيدرات (نا 4 P 2 O 7 10 H 2 O) في الماء منزوع الأيونات معقم.
  10. لفة هلام في شبكة النايلون ومكان في أنبوب التهجين (خطوة5.7). إضافة 20 مل من حل التهجين واحتضان في الفرن التهجين في 42 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة مع التناوب.
  11. إزالة حل التهجين واستبدالها مع 20 مل من حل التهجين الطازجة. إضافة مجمل التحقيق تيلومير واحتضان في الفرن التهجين في 42 درجة مئوية بين عشية وضحاها مع التناوب.

7. هلام غسل، الفوسفور شاشة التعرض، و راديو التصوير

  1. إعداد 500 مل من حل سك 2X (300 ملي كلوريد الصوديوم، 30 ملي سترات الصوديوم) في الماء منزوع الأيونات معقم.
  2. إعداد 250 مل من سك 0.1x (15 ملي كلوريد الصوديوم، 1.5 ملي سيترات الصوديوم) و 0.1٪ كبريتات دوديسيل الصوديوم (سدز) في الماء منزوع الأيونات.
  3. إزالة هلام وشبكة من أنبوب التهجين ومكان في طبق زجاج يحتوي على 250 مل من 2X سك. قم بإزالة شبكة النايلون وإزالتها من الطبق. ضع الطبق الزجاجي على شاكر المداري واحتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  4. إزالة 2X سك واستبدالها مع 250 مل من سك 0.1x و 0.1٪ حل سدز، واحتضان لمدة 15 دقيقة على شاكر المداري في درجة حرارة الغرفة.
  5. أثناء الحضانة، وفضح شاشة الفوسفور إلى ممحاة الصورة لمدة 15 دقيقة.
  6. إزالة سك 0.1x و 0.1٪ حل سدز واستبدالها مع 250 مل من سك 2X. احتضان لمدة 15 دقيقة على شاكر المداري.
  7. إزالة هلام من حل سك 2X وإما التفاف هلام في غلاف بلاستيكي أو وضعه في كيس قابل للحرارة الحرارة. إزالة جميع الفقاعات وجيوب الهواء بين هلام واللف البلاستيك أو الحقيبة البلاستيكية. وضع الجل في كاسيت التعرض مع شاشة فوبشور. فضح الشاشة الفوسفور إلى هلام بين عشية وضحاها.
  8. صورة شاشة الفوسفور المكشوفة باستخدام فوسفوريماجر.

8. تيلومير طول الكمي

  1. فتح ملف فوسفهوريماجر التي تحتوي على صورة الفلورسنت من الفلورسنت الأخضر حمض هلام ملون الأخضر ( الشكل 1 ).
  2. حدد "أدوات" ثم "بكسل المسافة9 ؛. باستخدام الماوس، رسم خط من الجزء السفلي من هلام جيدا إلى منتصف الفرقة علامة الأولى وتسجيل المسافة. كرر هذا الإجراء لكل الفرقة علامة ( الشكل 2 ). سيتم استخدام هذه المسافات في برنامج الرسوم البيانية كما هو موضح أدناه.
  3. فتح فوسفوريماج من هلام راديولبلد ( الشكل 3 ). حدد "مدير الكائن" ثم "الشبكة". تعيين الشبكة إلى 1 عمود و 150 الصفوف. ضبط الشبكة بحيث تمتد من الجزء العلوي من هلام إلى الجزء السفلي من هلام. ضبط عرض الشبكة على قدم المساواة عرض الحارة، والنقر على حافة الشبكة وسحب عرض الشبكة على قدم المساواة عرض الحارة.
  4. نسخ هذه الشبكة (بحيث يكون العرض والارتفاع من المربعات لا تزال هي نفسها) ونقل الشبكة الثانية إلى حارة فارغة (لأغراض الخلفية). مواصلة نسخ ونقل شبكات إضافية لممرات عينة إضافية.
    ملاحظة: عند الانتهاء، يجب أن يكون هناكشبكات لكل ممر عينة وشبكة واحدة من حارة فارغة للخلفية ( الشكل 4 ).
  5. حدد "تحليل" ثم حدد "تقرير وحدة التخزين" حدد كافة شبكات التقرير.بمجرد عرض تقرير وحدة التخزين، انقر نقرا مزدوجا فوق التقرير لتنشيط برنامج جدول البيانات حفظ ملف جدول البيانات، وستكون بيانات هذا الملف تحت حارة "المجلد".
  6. افتح برنامج رسوم بيانية مناسب وقم بإنشاء بيانات وجدول جديد. حدد "Y: إنتر ورسم قيمة Y واحدة لكل نقطة" ثم حدد "إنشاء".
  7. تسمية العمود الأول (العمود X) باسم "المسافة المقاسة" وتسمية العمود الثاني (العمود Y) باسم "الوزن الجزيئي". أدخل الأوزان الجزيئية للعلامة لكل شريط علامة في العمود Y. أدخل مسافات الهجرة التي تم الحصول عليها في الخطوة 8.2 المقابلة لكل علامة الوزن الجزيئي.
  8. انتقل إلى 'تحليل' وحدد 'تحليل' ثم 'ريجريسي غير الخطيةعلى (منحنى صالح) "وحدد" موافق ". في الشاشة التالية، حدد "الأسي ثم" مرحلة واحدة الاضمحلال ". حدد علامة التبويب "المدى" وأدخل "150" في "عدد النقاط التي تحدد المنحنى" وحدد "إنشاء جدول إحداثيات زي لتصدير أو نسخ المنحنى إلى برنامج آخر".
    ملاحظة: النتيجة، 'غير الخطية تناسب البيانات 1'، يحتوي على الوزن الجزيئي لكل مسافة في الصف Y.
  9. لتحليل ممرات العينة، حدد مجال التحليل الذي هو أعلى وأدناه من نطاقات تيلومير الفعلية. لا تستخدم كامل طول حارة ( الشكل 5 ). تحديد مواقع الشبكة لمنطقة تحليل كل حارة.
  10. حدد 'ملف'، 'جديد' 'إنشاء جدول جديد ورسم بياني'. حدد "Y: إنتر ورسم قيمة Y واحدة لكل نقطة" ثم حدد "إنشاء". انسخ ولصق قيم حجم حارة الخلفية (قيم الشدة) من ملف جدول البياناتفي العمود الأول (X) وقيم وحدة التخزين (قيم الكثافة) من حارة العينة في العمود الأول Y. إذا كان هناك عدة ممرات نموذجية، فانسخ كل مجموعة من قيم وحدة التخزين من ملف جدول البيانات إلى أعمدة Y إضافية في برنامج الرسوم البيانية ملف.
  11. حذف القيم من عمود الخلفية (X) وكل حارة عينة (Y) التي تقع خارج مجالات التحليل المحددة في الخطوة 8.8.
    ملاحظة: يجب أن يحتوي جدول البيانات فقط على قيم في مواقع الشبكة المقابلة لمجالات التحليل.
  12. حدد تحليل، ثم "تحليل" و "تحويل". انقر فوق موافق'. حدد "تحويل القيم Y باستخدام Y = يكس". وهذا سيحول البيانات في البيانات 2 (قيمة الشدة المحولة (Y) = كثافة العينة (Y) - كثافة الخلفية (X)).
    1. حدد تحليل ثم 'تحليل'، 'تحليل العمود' و 'إحصائيات العمود'. حدد موافق. علامة التبويب النتائج "العقيد. إحصائيات تحويل البيانات 2 'يظهرتحت صف "مجموع"، Σ (إنت i ).
  13. حدد 'ملف'، 'جديد'، 'إنشاء جدول جديد ورسم بياني'. حدد "Y: إنتر ورسم قيمة Y واحدة لكل نقطة" ثم حدد "إنشاء". نسخ ولصق البيانات العمود Y من صفحة النتائج "نونلين صالح من البيانات 1، كيرف 'في العمود X الجديد. انسخ والصق بيانات العمود Y من صفحة النتائج "تحويل البيانات 2" إلى العمود Y الجديد. حدد تحليل ثم "تحليل" و "تحويل". انقر فوق موافق'. حدد "تحويل القيم Y باستخدام Y = Y / X".
    1. حدد تحليل ثم 'تحليل'، 'تحليل العمود' و 'إحصائيات العمود'. حدد موافق. علامة التبويب النتائج "العقيد. إحصائيات تحويل البيانات 3 "تحت صف" مجموع "، Σ (إنت i / مو i ). مو = الوزن الجزيئي.
  14. لحساب متوسط ​​طول تيلومير (تل) لكل عينة، استخدمالصيغة تل = Σ (إنت i ) / Σ (إنت i / مو i ).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تحليل ثلاثة تركيزات من الحمض النووي (1، 2 و 3 ميكروغرام) معزولة عن خط الخلية بج-هتير (تيلوميراز خلد الخلايا الليفية القلفة البشرية) 22 والبشري خلايا الدم وحيدات النوى البشرية (بمكس) لطول تيلومير. ويبين الجدول 1 تخصيصات حارة لكل عينة من الحمض النووي. ويبين الشكل 1 وصمة عار حمض الفلورسنت النووي من هلام. معايير الوزن الجزيئي واضحة للعيان. تم تحديد المسافة من الجزء العلوي من هلام...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بعد الكهربائي، تشويه الحمض النووي الجيني أعلى من 800 بي بي. يمكن أن يحدث هذا إذا كانت إنزيمات التقييد خاطئة أو إذا كانت هناك حاجة لإنزيمات إضافية (كما هو موضح أعلاه). وهناك تفسير آخر محتمل هو أن البروتين لا يزال تعلق على الحمض النووي. عند تحديد تركيز الحمض النووي من قبل الطيف، يجب أن تكون نسبة 260/280 حوالي 1.8. إذا كانت هذه النسبة <1.5، هناك تلوث البروتين التي يمكن أن تتداخل مع تقييد انزيم الهضم. إما أن عينة الحمض النووي تحتاج إلى إعادة معزولة، أو أن البروتين يحتاج إلى إزالتها...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب تعترف بدعم من معهد جامعة بيتسبرغ للسرطان بيوبهافيورال الأورام مرفق مشترك التي يتم دعمها جزئيا من قبل جائزة P30CA047904.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Biologics
Rsa1, إنزيم تقييدNew England Biolabs, IncR0167S10,000 U/mL, DNA digest.  يأتي مع Cutsmart Buffer (عازلة الهضم)
Hinf1 ، إنزيم التقييدNew England Biolabs، IncR0155S10,000 U / mL ، هضم الحمض النووي. يأتي مع Cutsmart Buffer (عازلة الهضم)
Seakem GTG AgaroseLonza50071درجة الرحلان الكهربائي
agarose Optikinase  affymetrix78334X 500 UNT4 عديد النوكليوتيدات كيناز
SYBR صبغة الحمض النووي الأخضر IThermoFisher ScientificS7567Syber Green
exactسلم الحمض النووي الجيني 24- كيلو بايتفيشر ScientificBP2580100
C-Strand Probe (3'- (G3AT2) 4-'5)تقنياتمطلوبة حسب الطلب من قليل النوكليوتيد
DNA Gamma-ATP-P32Perkin ElmerBLU502Zالنظائر المشعة
Qiagen الدم والخلايا الحمض النووي مجموعة صغيرةQiagen13323طقم استخراج الحمض النووي
GE Illustra Microspin G-25 العمودGE Healthcare LifeSciences 27-5325-01لتنقية مسبار oligo النشط
Ficoll 400بوليمر اصطناعي غير
أيوني <قوي > معدات / برامج < قوي>
نظام الرحلان الكهربائي للهلام Owl A5 (20 سم × 25 سم)ThermoFisher Scientific A5Gel Electrophores
Horizon 11.4 Gel Electrophores: (11 سم × 14 سم)Corel Life Sciences11068020جل الرحلان الكهربائي
شبكة النايلون ، 50 ، 12 بوصة × 12 بوصةTed Pellam، Inc41-12105
GE Storage Phosphor ScreensGE Healthcare علوم الحياة28-9564-75
كاسيت التعرض لشاشة الفوسفورGE Healthcare Life Sciences63-0035-44
حاضنة التهجين Isotempفيشر Scientific13-247-20Q
أنابيب التهجين الأسطوانيةفيشر Scientific13-247-300
شاكر الراقصة الشرقية المداريSigma-aldrichZ768499-1EAشاكر مداري
تايفون 9400ABIلتصوير المواد الهلامية وشاشات الفوسفور
GraphPad Prism 6GraphPadالإصدار 6.05برنامج الرسوم البيانية
Microsoft Excelبرنامج جداول بيانات Microsoft Excel MicrosoftOffice 365
NanodropThermo ScientificNanodrp 2000Spectrophotometer
الحمض النووي المتكاملة :

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Herbert, B. S., Shay, J. W., Wright, W. E. Analysis of telomeres and telomerase. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 18 Unit 18 16(2003).
  2. Mender, I., Shay, J. W. Telomere Restriction Fragment (TRF) Analysis. Bio Protoc. 5 (22), (2015).
  3. Blackburn, E. H. Telomeres and Telomerase: The Means to the End (Nobel lecture). Angew Chem Int Ed Engl. 49 (41), 7405-7421 (2010).
  4. Greider, C. W. Telomerase Discovery: The Excitement of Putting Together Pieces of the Puzzle (Nobel lecture). Angew Chem Int Ed Engl. 49 (41), 7422-7439 (2010).
  5. Szostak, J. W. DNA Ends: Just the Beginning (Nobel lecture). Angew Chem Int Ed Engl. 49 (41), 7386-7404 (2010).
  6. Watson, J. M., Riha, K. Telomeres, Aging, and Plants: From Weeds to Methuselah - A Mini-Review. Gerontology. 57 (2), 129-136 (2011).
  7. Lu, W., Zhang, Y., Liu, D., Songyang, Z., Wan, M. Telomeres-Structure, Function, and Regulation. Exp Cell Res. 319 (2), 133-141 (2013).
  8. MacNeil, D. E., Bensoussan, H. J., Autexier, C. Telomerase Regulation from Beginning to the End. Genes (Basel). 7 (9), 64(2016).
  9. Fouquerel, E., Opresko, P. Convergence of The Nobel Fields of Telomere Biology and DNA Repair. Photochem Photobiol. , Epub ahead of print (2016).
  10. Bernadotte, A., Mikhelson, V. M., Spivak, I. M. Markers of Cellular Senescence. Telomere Shortening as a Marker of Cellular Senescence. Aging (Albany NY). 8 (1), 3-11 (2016).
  11. Opresko, P. L., Shay, J. W. Telomere-Associated Aging Disorders. Ageing Res Rev. , Epub ahead of print 1568-1637 (2016).
  12. Chiodi, I., Mondello, C. Telomere and Telomerase Stability in Human Diseases and Cancer. Front Biosci (Landmark Ed). 1 (21), 203-224 (2016).
  13. Blackburn, E. H., Epel, E. S., Lin, J. Human Telomere Biology: A Contributory and Interactive Factor in Aging, Disease Risks, and Protection. Science. 350 (6265), 1193-1198 (2015).
  14. Lindqvist, D., et al. Psychiatric Disorders and Leukocyte Telomere Length: Underlying Mechanisms Linking Mental Illness with Cellular Aging. Neurosci Biobehav Rev. 55, 333-364 (2015).
  15. Bodelon, C., Savage, S. A., Gadalla, S. M. Telomeres in Molecular Epidemiology Studies. Prog Mol Biol Transl Sci. 125 (113), (2014).
  16. Kimura, M., et al. Measurement of telomere length by the Southern blot analysis of terminal restriction fragment lengths. Nat Protoc. 5 (9), 1596-1607 (2010).
  17. Haussmann, M. F., Mauck, R. A. TECHNICAL ADVANCES: New strategies for telomere-based age estimation. Mol Ecol Resour. 8 (2), 264-274 (2008).
  18. Nussey, D. H., et al. Measuring telomere length and telomere dynamics in evolutionary biology and ecology. Methods Ecol Evol. 5 (4), 299-310 (2014).
  19. Delany, M. E., Krupkin, A. B., Miller, M. M. Organization of telomere sequences in birds: evidence for arrays of extreme length and for in vivo shortening. Cytogenet Cell Genet. 90 (1-2), 139-145 (2000).
  20. Baerlocher, G. M., Vulto, I., de Jong, G., Lansdorp, P. M. Flow cytometry and FISH to measure the average length of telomeres (flow FISH). Nat Protoc. 1 (5), 2365-2376 (2006).
  21. Sanders, J. L., Newman, A. B. Telomere length in epidemiology: a biomarker of aging, age-related disease, both, or neither. Epidemiol Rev. 35, 112-131 (2013).
  22. Parikh, D., Fouquerel, E., Murphy, C. T., Wang, H., Opresko, P. L. Telomeres are partly shielded from ultraviolet-induced damage and proficient for nucleotide excision repair of photoproducts. Nat Commun. 6, 8214(2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Telomere LengthTerminal Restriction FragmentIn Gel HybridizationAgarose Gel ElectrophoresisGenomic DNA DigestionTelomere ProbePhosphor ImagingDNA LadderHybridization OvenPeripheral Blood Mononuclear

Related Articles