ويصف هذا البروتوكول إعادة برمجة الابتدائي السلي السائل وغشاء الخلايا الجذعية الوسيطة في الخلايا الجذعية المستحثة pluripotent استخدام نهج ابيسومال غير دمج في ظروف محددة بالكامل كيميائيا. وترد تفاصيل إجراءات استخراج والثقافة، وإعادة برمجة، وتوصيف الخلايا الجذعية المستحثة pluripotent الناتجة بطرق صارمة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
إعادة برمجة الابتدائي السائل السلوى وغشاء الخلايا بلوريبوتينسي في ظروف خالية من كرة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
حصلت العلاج ذاتي يستند إلى الخلية على خطوة أقرب إلى الواقع مع الأخذ بالخلايا الجذعية المستحثة pluripotent. الخلايا الجذعية الجنينية، مثل السائل السلوى وغشاء الخلايا الجذعية الوسيطة، تمثل نوعا فريداً من خلايا غير متمايزة بالوعد في هندسة الأنسجة وإعادة برمجة في اللجنة التوجيهية للتدخلات المستقبلية في طب الأطفال والخلايا الجذعية المصرفية. يصف البروتوكول المعروضة هنا إجراء أمثل لاستخراج واستزراع الابتدائي السلي السائل وغشاء الخلايا الجذعية الوسيطة وتوليد ابيسومال الناجمين عن الخلايا الجذعية pluripotent من هذه الخلايا في ثقافة محددة بالكامل كيميائيا شروط استخدام فيترونيكتين الماشوب البشري والمتوسطة E8. ويرد أيضا وصف خطوط جديدة بتطبيق أساليب صارمة – التدفق الخلوي والتصوير [كنفوكل]، وتشكيل تيراتوما والتنميط النسخي –. الأسطر التي تم إنشاؤها حديثا تعبر عن علامات للخلايا الجذعية الجنينية – Oct3/4A، نانج، Sox2، وهيئة تنظيم الاتصالات-1-60، وهيئة تنظيم الاتصالات-1-81، سا-4 – بينما يجري سلبية بالنسبة لعلامة سا-1. خطوط الخلايا الجذعية تشكل تيراتوماس في الفئران بيج مشمولان في 6-8 أسابيع وتيراتوماس تحتوي على أنسجة تمثيلية من جميع الطبقات الجرثومية الثلاث. التنميط النسخي للخطوط بتقديم البيانات ميكرواري التعبير العالمي إلى خوارزمية تقييم بلوريبوتينسي بيوينفورماتيك تعتبر جميع خطوط pluripotent وذلك، أن هذا النهج بديل جذاب للتجارب الحيوانية. يمكن بسهولة استخدام الخطوط التوجيهية الجديدة في المصب التجارب التي تنطوي على الاستفادة المثلى من التمايز وهندسة الأنسجة.
المقدمة
تكنولوجيا الخلايا الجذعية المستحثة pluripotent (اللجنة التوجيهية) يرتفع عن المخدرات والمرض والنمذجة التنموية، وعلاجات استبدال خلية المحتملة فحص السمية1،،من23. العلاج البديلة نظرياً يمكن أن يتحقق عن طريق حقن الخلايا، في المختبر متباينة زرع الأنسجة (مثل بقع القلب)، أو تسترشد التجديد عن طريق هندسة الأنسجة. السائل السلوى (أفسك) وغشاء الخلايا الجذعية (أمسك) مصدر ممتاز لخلايا لهذه التدخلات أما مباشرة4،5،،من67 أو كمحتوى خلية بداية لإعادة برمجة في بلوريبوتي....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
البروتوكول يتبع المبادئ التوجيهية المؤسسية للجنة الأخلاقيات البحثية البشرية. تم الحصول على موافقة خطية من المريض لاستخدام السائل السلوى للبحوث.
هذا البروتوكول يتبع سياسات رعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة لجامعة جنوب ألاباما.
1-العزلة والثقافة من الخلايا الجذعية الوسيطة السلي الابتدائية
-
طلاء خلايا السائل السلوى
- الحصول على الحد أدنى من 2.5 مل سائل السلوى حصاد عملية بزل طبيب.
ملاحظة: يجب أن يتم التعامل مع كافة الخلايا الحية والأنسجة بمجلس وزراء زراعة أنسجة معقمة ويجب استخدام معدات الوقاية الشخصية المناسبة. مطلوب الإلمام بالثقافة الخلية الأساسية وتقنية العقيمة.
- الحصول على الحد أدنى من 2.5 مل سائل السلوى حصاد عملية بزل طبيب.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تم الحصول على موافقة خطية مستنيرة من المرضى قبل الحصاد السائل السلوى لأغراض الاختبار وتكريس قاسمة صغيرة من السائل للبحوث الوراثية. مطلوب لا موافقة لاستخدام الغشاء السلوى في البحوث كما المشيمة تمثل النفايات الطبية. الخلايا الجذعية السائل والغشاء السلي عرض خصائص الوسيطة نموذجية، وشكليا خلاياها على شكل عمود الدوران ومرحلة مشرقة. عند إعادة برمجة، الخلايا يخضع الوسيطة إلى الظهارية (MET) الانتقال والحصول على مورفولوجيا تشبه حصاة كبيرة ومنظمة المكانية من المستعمرات، التي تشير إلى خصائص الظهارية........
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
المرحلة الأولى من إنشاء اللجنة التوجيهية من الخلايا الجذعية الجنينية ينطوي على استخراج الخلايا المصدر من الأنسجة الجنينية، والثقافة، والتوسع، وإدخال والبلازميدات إعادة برمجة ابيسومال. هذه المرحلة هو متبوعاً بنقطة ثقافة حوالي 14-18 يوما قبل أن يمكن توسيع المستعمرات الأولى أعيدت برمجتها تماما. المرحلة النهائية نضوج المستنسخين اللجنة التوجيهية. استخراج الأولية للخلايا الجذعية غشاء السلي يتحقق عن طريق هضم الميكانيكية والانزيميه مجتمعة amnion. ووجدنا أن فترة حضانة من 30 دقيقة أسفرت عن أكبر عدد من الخلايا المستخرجة مع بقاء أعل.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.
شكر وتقدير
هذا العمل كان يدعمها في فوندز Medizinische Forschung في جامعة زيوريخ، فورشونجسكريديت من جامعة زيوريخ، وديكينستون NMSCh تحت 10.216 الزمالات و 12.176، المجتمع السويسري للقلب، "العلم الوطني السويسري" مؤسسة في إطار المنحة [320030-122273] و [310030-143992]، البرنامج الإطاري السابع، صمام الحياة، اللجنة الأوروبية في إطار منحة [242008]، ومؤسسة مايينفيش أولغا، مؤسسة امدو، بدء المنحة 2012 من مستشفى جامعة زيورخ، و التمويل الداخلي لمعهد السرطان ميتشل.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| طقم تفكك الورم ، نظام | Miltenyi Biotec | 130-095-929 | البشري ، مجموعة الكاشف ، يشمل أنابيب تفكك الأنسجة وإنزيمات تفكك الأنسجة |
| اللطيفةMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | نظام تفكك الأنسجة ، الفصل |
| Thermo Scientific & trade ؛ شاندون & تجارة; مشرط يمكن التخلص منه رقم 10 ، معقم ، ملفوف بشكل فردي ، 5.75 (14.6 سم) | ثيرمو-فيشر | 3120032 | |
| 70 وميكرو ؛ مصافي الخلايا m | Corning | 10054-456 | |
| RPMI 1640 متوسطة | Thermo-Fisher | 32404014 | |
| منصة هزاز | VWR | 40000-300 | |
| 50 مل أنابيب الطرد المركزي | Thermo-Fisher | 339652 | |
| 15 مل أنابيب الطرد المركزي | Thermo-Fisher | 339650 | |
| EBM-2 الوسط القاعدي | Lonza | CC-3156 | الوسط القاعدي لوسط AFMC |
| FGF 2 الإنسان (معبرا عنه بالإشريكية القولونية ، غير الجليكوزيلات) | Prospec Bio | CYT-218 | bFGF، مكمل ل AFMC المتوسطة |
| EGF Human ، Pichia | Prospec Bio | CYT-332 ؛ | EGF ، مكمل غذائي لوسط AFMC |
| LR3 الأنسولين مثل عامل النمو -1 المؤتلف البشري | Prospec Bio | CYT-022 | IGF ، مكمل لمصل |
| الأبقار الجنيني المتوسط AFMC ، Thermo-Fisher المؤهل للخلايا الجذعية الجنينية | 10439024 | FBS | |
| المضاد الحيوي المضاد للفطريات (100X) | Thermo-Fisher | 15240062 ؛ | بالنسبة ل AFSC / AMSC الأولية ، بالنسبة ل AFSC / AMSC الروتينية ، لا ينبغي أن يكون ذلك ضروريا ، لا تستخدمه في وسط للخلايا المنقولة! |
| حل انفصال خلايا Accutase | تقنيات الخلايا الجذعية | 07920 | إنزيم انفصال الخلية |
| CryoStor & trade ؛ CS10 | StemCell Technologies | 07930 | وسط التجميد |
| الكامل PBS ، درجة الحموضة 7.4 | Thermo-Fisher Scientific | 10010023 | |
| مجموعة EndoFree Plasmid Maxi Kit (10) | Qiagen | 12362 | لعزل البلازميد |
| pEP4 E02S EN2K | Addgene | 20925 | EN2K ، عوامل إعادة البرمجة Oct4 + Sox2 ، Nanog + Klf4 |
| pEP4 E02S ET2K | Addgene | 20927 | ET2K ، عوامل إعادة البرمجة Oct4 + Sox2 ، SV40LT + Klf4 |
| pCEP4-M2L | Addgene | 20926 | M2L ، عوامل إعادة البرمجة c-Myc + LIN28 |
| NanoDrop 2000c UV-Vis مقياس الطيف | الحراري فيشر | ND-2000C | الطيف الضوئي |
| نيون & ريج ؛ نظام التعداء | MPK5000 | Thermo-Fisher | ، المكونات: ماصة نيون - ماصة تعداء جهاز نيون - جهاز تعداء |
| Neon & reg ؛ نظام التعداء 10 & micro; مجموعة المواد | Kit Thermo-Fisher | MPK1025 | لنظام تعداء النيون ، تحتوي على: طرف نيون - طرف التعداء أنبوب نيون - أنبوب التعداء العازلة R - عازلة إعادة التعليق العازلة E - العازلة الإلكتروليتية |
| Stemolecule & trade ؛ محسن جزيء صغير من زبدات الصوديوم | StemGent | 04-0005 | لإعادة برمجة |
| تقنيات الخلايا الجذعية TeSR-E8 | 05940 | E8 متوسط | |
| Vitronectin XF & trade ؛ | تقنيات الخلايا الجذعية | 07180 | VTN ، تركيز المخزون 250 وميكرو ؛ جم / مل ، يستخدم للطلاء عند 1 & ميكرو ؛ g / cm 2< / sup> في تخفيف vitronectin (CellAdhere) المخزن المؤقت |
| CellAdhere & trade ؛ تقنيات التخفيف العازلة | StemCell | 07183 | vitronectin dilution |
| buffer UltraPure & trade ؛ 0.5M EDTA ، درجة الحموضة 8.0 | Thermo-Fisher | 15575020 | تخفيفها مع PBS إلى 0.5 ملي مولار قبل استخدام |
| EVOS & reg ؛ نظام التصوير FL | نظام | مجهر | AMF4300 |
| CKX53 مجهر مقلوب | أوليمبوس | مجهر ثقافة الخلية التباين | |
| المرحلة بيرس والتجارة ؛ 16٪ الفورمالديهايد (ث / الحجم) ، الخالي من الميثانول | Thermo-Fisher | 28908 | مخفف إلى 4٪ مع PBS قبل الاستخدام ، يمكن تخزينه المخفف عند 2-8 درجة ؛ C لمدة أسبوع |
| Perm Buffer III | BD Biosciences | 558050 | عازلة نفاذية ، برد إلى -20 درجة ؛ C قبل استخدام |
| Mouse IgG1 ، & kappa ؛ التحكم في النمط المتماثل ، Alexa Fluor & reg ؛ 488 | BD Biosciences | 557782 | التحكم في النمط المتماثل ل Oct3 / 4A ، Nanog |
| Mouse IgG1 ، & kappa ؛ التحكم في النمط المتماثل ، Alexa Fluor & reg ؛ 647 | BD Biosciences | 557783 | التحكم في النمط المتماثل ل Sox2 |
| Mouse المضاد للإنسان Oct3 / 4 (الشكل الإسوي البشري A) ، Alexa Fluor & reg ؛ 488 | BD Biosciences | 561628 | |
| Mouse Anti-human Nanog ، Alexa Fluor & reg ؛ 488 | BD Biosciences | 560791 | |
| Mouse Anti-Human Sox-2 ، Alexa Fluor & reg ؛ 647 | BD Biosciences | 562139 | |
| الماوس IgGM ، & التحكم في النمط المتماثل ، Alexa Fluor & reg ؛ 488 | BD Biosciences | 401617 | التحكم في النمط المتماثل ل TRA-1-60 |
| Mouse IgGM ، & kappa ؛ التحكم في النمط المتماثل ، Alexa Fluor & reg ؛ 647 | BD Biosciences | 401618 | التحكم في النمط المتماثل ل TRA-1-81 |
| الفأر المضاد للإنسان TRA-1-60 ، Alexa Fluor & reg ؛ 488 | BD Biosciences | 330613 | |
| ماوس مضاد للإنسان TRA-1-81 ، Alexa Fluor & reg ؛ 647 | BD Biosciences | 330705 | |
| Mouse IgG1 ، & kappa ؛ التحكم في النمط المتماثل ، Alexa Fluor & reg ؛ 488 | BD Biosciences | 400129 | التحكم في النمط المتماثل ل SSEA-1 |
| Mouse IgG3 ، & kappa ؛ التحكم في النمط المتماثل ، Alexa Fluor & reg ؛ 647 | BD Biosciences | 401321 | التحكم في النمط المتشاوي ل SSEA-4 |
| Mouse anti-human SSEA-1 ، Alexa Fluor & reg ؛ 488 | BD Biosciences | 323010 | |
| فأر مضاد للإنسان SSEA-4 ، Alexa Fluor & reg ؛ 647 | BD Biosciences | 330407 | |
| Affinipure F (ab') 2 جزء من الماعز المضاد للفأر IgG + IgM ، Alexa Fluor & reg ؛ 488 | Jackson Immunoresearch | 115-606-068 | استخدم عند تخفيف 1: 600 أو قم بتحسين |
| Affinipure F (ab') 2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG + IgM ، Alexa Fluor & reg ؛ 647 | Jackson Immunoresearch | 115-546-068 | استخدم عند تخفيف 1: 600 أو تحسين |
| مخزون DAPI | Thermo-Fisher Scientific | D21490 | 10 ملي مولار ، وتخفيف إضافي إلى 1: 12.000 لحل العمل |
| Corning & reg ؛ Matrigel & reg; انخفاض عامل النمو ، | غشاء القاعدة 356231 كورنينج | الأحمر (BMM) | |
| الفئران البيج ، أنثى | تاكونيك | CBSCBG-F | |
| RNeasy Plus Mini Kit (50) | طقم عزل الحمض | النووي الريبي Qiagen | 74134 |
| قوارير T-25 ، | Thermo-Fisher | 156367 | |
| T-75 المعالجة بزراعة | Thermo-Fisher | 156499 | |
| Nunc & trade; طبق ثقافة الأنسجة | Thermo-Fisher | 12-567-650 | طبق زراعة الأنسجة 10 سم |
| 6 ألواح آبار ، غرفة | Thermo-Fisher | 140675 | |
| Neubauer المعالجة بزراعة الأنسجة (مقياس الدم | VWR | 15170-173 | |
| Mr. Frosty & trade ؛ حاوية تجميد | Thermo-Fisher | 5100-0001 | حاوية التجميد |
| أنابيب FACS ، أنبوب اختبار البوليسترين القاع المستدير ، 5 مل | كورنينج | 352058 | 5 مل أنابيب البوليسترين |
| أنابيب إيبندورف ، 1.5 مل | Thermo-Fisher | 05-402-96 | 1.5 مل أنابيب الطرد المركزي الدقيقة |
| أنابيب PCR ، 200 وميكرو ؛ ل | Thermo-Fisher | 14-222-262 | |
| ، من 100 إلى 1250 وميكرو ؛ ل | Thermo-Fisher | 02-707-407 | ماصة ضيقة التجويف 1 مل |
| ، من 5 إلى 300 وميكرو ؛ ل | Thermo-Fisher | 02-707-410 | |
| أطراف ماصة ، 0.1 إلى 10 & micro ؛ ل | Thermo-Fisher | 02-707-437 | |
| أطراف ماصة عريضة التجويف ، 1000 وميكرو ؛ ل | VWR | 89049-166 | التجويف 1 مل نصائح |
| زجاجية ماصات باستور | ثيرمو فيشر | 13-678-20A | |
| إيثانول ، 200 دليل | على Thermo-Fisher | 04-355-451 | |
| خلاط دوامة | VWR | 10153-842 | |
| غطاء زجاجي ذو حجرة ، 8 آبار ، زجاج بورسليكات 1.5 مم | Thermo-Fisher | 155409 | زجاجي ذو قاع زجاجي من الدرجة الكونفوكية |
| 22G إبر | VWR | 82002-366 | |
| محاقن الأنسولين | Thermo-Fisher | 22-253-260 | |
| محلول الفورمالين ، محايد مخزن مؤقت ، 10٪ | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | تثبيت الأورام المسخية المزروعة |
| Illumina HT-12 v4 Expression BeachChip | Illumina | BD-103-0204 | المصفوفة الدقيقة للتعبير ، بدعم من PluriTest ، تم إيقافها من قبل الشركة المصنعة |
| PrimeView Human Genome U219 Array Plate | Thermo-Fisher | 901605 تعبير المصفوفة الدقيقة (العلامة التجارية Affymetrix سابقا) ، قريبا سيتم دعمها من قبل PluriTest | |
| GeneChip & trade ؛ الجينوم البشري U133 Plus 2.0 Array | Thermo-Fisher | 902482 | تعبير المصفوفة الدقيقة (العلامة التجارية Affymetrix سابقا) ، بدعم من CellNet ، قريبا سيتم دعمه بواسطة PluriTest |
| PluriTest & reg ؛ | معهد | كوريل www.pluritest.org ، خدمة مجانية لتقييم المعلوماتية الحيوية لتعدد القدرات ، يقبل بيانات المصفوفات الدقيقة - * ملفات .idat من منصة HT-12 v4 ، قريبا لدعم بيانات U133 و U219 microarray وتسلسل الحمض النووي | |
| الريبي CellNet | جونز هوبكنز | cellnet.hms.harvard.edu ، خدمة مجانية لتحديد المعلوماتية الحيوية لنوع الخلية ، بما في ذلك الخلايا الجذعية plutipotent ، بناء على بيانات المصفوفات الدقيقة U133 - * ملفات .cel ، قريبا لدعم الحمض النووي الريبي تسلسل البيانات |
المراجع
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Yu, J., et al. Induced Pluripotent Stem Cell Lines Derived from Human Somatic Cell....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
