مقالة منهجية

إعادة برمجة الابتدائي السائل السلوى وغشاء الخلايا بلوريبوتينسي في ظروف خالية من كرة

DOI:

10.3791/56003

⸱

نوفمبر 27, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Mitchell Cancer Institute, University of South Alabama, 2College of Medicine, University of South Alabama, 3Institute for Regenerative Medicine, University of Zurich, 4Department of Dermatology, University Hospital Zurich, 5Center for Applied Biotechnology and Molecular Medicine (CABMM), University of Zurich - Irchel Campus

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويصف هذا البروتوكول إعادة برمجة الابتدائي السلي السائل وغشاء الخلايا الجذعية الوسيطة في الخلايا الجذعية المستحثة pluripotent استخدام نهج ابيسومال غير دمج في ظروف محددة بالكامل كيميائيا. وترد تفاصيل إجراءات استخراج والثقافة، وإعادة برمجة، وتوصيف الخلايا الجذعية المستحثة pluripotent الناتجة بطرق صارمة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

حصلت العلاج ذاتي يستند إلى الخلية على خطوة أقرب إلى الواقع مع الأخذ بالخلايا الجذعية المستحثة pluripotent. الخلايا الجذعية الجنينية، مثل السائل السلوى وغشاء الخلايا الجذعية الوسيطة، تمثل نوعا فريداً من خلايا غير متمايزة بالوعد في هندسة الأنسجة وإعادة برمجة في اللجنة التوجيهية للتدخلات المستقبلية في طب الأطفال والخلايا الجذعية المصرفية. يصف البروتوكول المعروضة هنا إجراء أمثل لاستخراج واستزراع الابتدائي السلي السائل وغشاء الخلايا الجذعية الوسيطة وتوليد ابيسومال الناجمين عن الخلايا الجذعية pluripotent من هذه الخلايا في ثقافة محددة بالكامل كيميائيا شروط استخدام فيترونيكتين الماشوب البشري والمتوسطة E8. ويرد أيضا وصف خطوط جديدة بتطبيق أساليب صارمة – التدفق الخلوي والتصوير [كنفوكل]، وتشكيل تيراتوما والتنميط النسخي –. الأسطر التي تم إنشاؤها حديثا تعبر عن علامات للخلايا الجذعية الجنينية – Oct3/4A، نانج، Sox2، وهيئة تنظيم الاتصالات-1-60، وهيئة تنظيم الاتصالات-1-81، سا-4 – بينما يجري سلبية بالنسبة لعلامة سا-1. خطوط الخلايا الجذعية تشكل تيراتوماس في الفئران بيج مشمولان في 6-8 أسابيع وتيراتوماس تحتوي على أنسجة تمثيلية من جميع الطبقات الجرثومية الثلاث. التنميط النسخي للخطوط بتقديم البيانات ميكرواري التعبير العالمي إلى خوارزمية تقييم بلوريبوتينسي بيوينفورماتيك تعتبر جميع خطوط pluripotent وذلك، أن هذا النهج بديل جذاب للتجارب الحيوانية. يمكن بسهولة استخدام الخطوط التوجيهية الجديدة في المصب التجارب التي تنطوي على الاستفادة المثلى من التمايز وهندسة الأنسجة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تكنولوجيا الخلايا الجذعية المستحثة pluripotent (اللجنة التوجيهية) يرتفع عن المخدرات والمرض والنمذجة التنموية، وعلاجات استبدال خلية المحتملة فحص السمية1،،من23. العلاج البديلة نظرياً يمكن أن يتحقق عن طريق حقن الخلايا، في المختبر متباينة زرع الأنسجة (مثل بقع القلب)، أو تسترشد التجديد عن طريق هندسة الأنسجة. السائل السلوى (أفسك) وغشاء الخلايا الجذعية (أمسك) مصدر ممتاز لخلايا لهذه التدخلات أما مباشرة4،5،،من67 أو كمحتوى خلية بداية لإعادة برمجة في بلوريبوتينسي8،،من910،،من1112.

استخدام نهج أوائل نظم الاستزراع غير معرف أو إعادة برمجة الأساليب التي تتطلب إدماج يستتبع الجينوم بنيات9،10،،من1112. دراسة حديثة تستخدم وسيلة خالية من كرة، حتى ولو تم استخدام مصفوفة مرفق غشاء أقل محددة (بم)، لإنشاء اللجنة التوجيهية من الخلايا الظهارية السائل السلوى. ومع ذلك، لم تدرج المقايسة تشكيل تيراتوما في الدراسة جنبا إلى جنب مع ثروة من البيانات الجزيئية وفي المختبر. تم العثور على الخلايا الظهارية السائل السلوى يكون من كفاءة إعادة برمجة أعلى 8-fold تقريبا بالمقارنة مع الخلايا الليفية الولدان13. في دراسة أخرى، وجد أيضا الخلايا الجذعية الوسيطة من السائل السلوى أن تعاد برمجتها في اللجنة التوجيهية بكثير أعلى كفاءة12.

يمكن أن تكون متباينة في أنسجة ممثل كل الطبقات الجرثومية 3 الخلايا الجذعية Pluripotent وهكذا تنطوي على إمكانات أوسع. طب الأطفال المرضى يمكن أن تستفيد من حصاد وإعادة برمجة، وهندسة الأنسجة بالخلايا الجذعية السائل السلوى ذاتي بريناتالي والخلايا الجذعية غشاء السلي الولادة. وعلاوة على ذلك، يمكن نظرياً المعونة المستوى المنخفض نسبيا للتفريق بين الخلايا الجذعية الجنينية (أقل من الخلايا الجذعية البالغة14،15) في التصدي لاستبقاء لوحظ تحيز جينية من الخلايا المصدر في اللجنة التوجيهية16.

نقدم هنا بروتوكولا لإعادة برمجة السائل السلوى وغشاء الخلايا الجذعية إلى بلوريبوتينسي في تعريف كيميائيا خالية من كرة متوسطة E8 في المؤتلف فيترونيكتين17 (VTN) باستخدام البلازميدات ابيسومال18. والميزة الرئيسية لخلايا السائل والغشاء السلي كمصدر للخلايا لإعادة برمجة يكمن في توافرها قبل والولادة وبالتالي هذا النهج سيفيد أساسا للبحث في هندسة الأنسجة طب الأطفال.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البروتوكول يتبع المبادئ التوجيهية المؤسسية للجنة الأخلاقيات البحثية البشرية. تم الحصول على موافقة خطية من المريض لاستخدام السائل السلوى للبحوث.

هذا البروتوكول يتبع سياسات رعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة لجامعة جنوب ألاباما.

1-العزلة والثقافة من الخلايا الجذعية الوسيطة السلي الابتدائية

  1. طلاء خلايا السائل السلوى
    1. الحصول على الحد أدنى من 2.5 مل سائل السلوى حصاد عملية بزل طبيب.
      ملاحظة: يجب أن يتم التعامل مع كافة الخلايا الحية والأنسجة بمجلس وزراء زراعة أنسجة معقمة ويجب استخدام معدات الوقاية الشخصية المناسبة. مطلوب الإلمام بالثقافة الخلية الأساسية وتقنية العقيمة.
    2. تعد المتوسطة ثقافة الخلية (أفمك) السائل والغشاء السلي: متوسطة القاعدية EBM-2، 15% مصل بقرى الجنين (FBS)، 20 نانوغرام/مل من بفجف، 25 نانوغرام/مليلتر من مماثلة، 10 نانوغرام/مل لمنتدى إدارة الإنترنت. لثقافة خلايا الجذعية الأولية غشاء السلي السائل فضلا عن السلوى، ينبغي أن تستكمل في المتوسط مع الحل مضاد حيوي فطري.
    3. في اليوم 0، مزيج 2.5 مل سائل السلوى مع 3.5 مل AFMC الثقافة المتوسطة ولوحة في قارورة T25. احتضان في 37 درجة مئوية و 5% CO2 لمالا يقل عن 48 ساعة دون عائق قبل التحقق من وجود المستعمرات.
    4. في يوم 5، ينبغي أن تكون مستعمرات الخلايا ملتصقة الحالية. روك بلطف قارورة لإزاحة الخلايا التي لم لا تماما التمسك بالقاع والحطام والفراغ-أسبيراتي الخليط السائل المتوسطة/السلي المستهلك استخدام ماصة باستور. استبدال مع 5 مل من جديد أفمك المتوسطة.
    5. الثقافة لمدة 5 أيام أخرى. تغيير المتوسطة كل يوم كما هو موضح في الخطوة 1.1.4.
  2. عزل الخلايا الجذعية الوسيطة الأولى من amnion البشرية
    1. الحصول على مشيمة وقت ممكن بعد الولادة، وخلال 24 ساعة على أكثر تقدير، تحقيق أقصى قدر من النزاهة الخلوية. قص شريحة2 سم 9 من amnion وإزالة تجلط الدم وتغسل في أنبوب الطرد مركزي 50 مل مع 30 مل من برنامج تلفزيوني وتستكمل مع الحل مضاد حيوي فطري.
    2. فرم الأغشية باستخدام زوج من المشارط للقطع في طبق استنبات الأنسجة معقمة 10 سم بشكل جيد. سوف يتحقق هضم الأغشية واستخراج الخلايا باستخدام نظام تفكك نسيج. اتبع البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
      ملاحظة: أدق قطعة من الأنسجة بعد تنميق، شُفي ارتفاع أرقام الخلية بعد الهضم.
    3. نقل كتلة الأنسجة غشاء المفروم باستخدام شفرات مشرط في أنبوب تفكك النسيج واحد وتخلط مع مل 4.7 في المتوسط RPMI 1640. خلط في تفكك الإنزيمات (انظر الجدول للمواد).
    4. جبل الأنابيب على ديسوسياتور الأنسجة وتشغيل برنامج "h_tumor_01". احتضان هذه الأنابيب عند 37 درجة مئوية على منصة هزاز لمدة 30 دقيقة.
    5. كذلك تمييع المعلقات مع 35 مل من RPMI 1640 وتنطبق على مصفاة ميكرومتر 70 وضع عبر أنبوب الطرد مركزي جمع 50 مل.
    6. أجهزة الطرد المركزي 5 دقائق في ز 200 x في درجة حرارة الغرفة، تجاهل المادة طافية، ريسوسبيند بيليه في 5 مل من RPMI 1640، عد الخلايا باستخدام هيماسيتوميتير، ولوحة في كثافة 10,000 الخلايا/سم2 إلى سفن زراعة الأنسجة تعامل مع طازجة أعد أفمك المتوسطة وتستكمل مع الحل مضاد حيوي فطري.
      ملاحظة: في حالة غير مكتملة الهضم، قطع صغيرة من الأنسجة ستكون حاضرة وسوف تكون الخلايا المفردة النادرة. زيادة ونقصان لأسفل مرة أخرى ولوحة بيليه كلها في قارورة T75 واحد.
  3. الثقافة الأولية أفسك وأمسك
    1. قضى المستعمرات المرور من أفسك/أمسك بفراغ يسفط استخدام ماصة باستور المتوسط وإضافة 2 مل إنزيم الخلية المفرزة إلى قارورة. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 5-8 دقائق.
    2. اضغط على قارورة للمساعدة في إزاحة الخلايا ومزيج التعليق مع حجم متساوية من متوسطة أفمك (الملحق مضاد حيوي فطري لا ضرورة من هذه النقطة). الطرد المركزي في 200 غ 4-5 الحد الأدنى إزالة المادة طافية باستخدام أما زجاج ماصة باستير أو ببساطة عن طريق عكس الأنبوب ويصب عليه في حاوية نفايات.
    3. نفض الغبار الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي لتفريق بيليه في تعليق خلية مفردة في إسقاط المتبقي من السائل وتخلط مع أفمك المتوسطة للطلاء. لوحة في قوارير تي في بكثافة بين 2500 و 5,000 الخلايا/سم2.
    4. تغير متوسط كل يوم. الثقافة لا خطوط الخلايا بعد مرور 6. لإعادة برمجة الأغراض، تستخدم كانخفاض مرور قدر الإمكان.
    5. إعداد الأرصدة المجمدة أفسك وأمسك كتجميد المتوسطة باستخدام النسخ الاحتياطية. حصاد الثقافات تستخدم خلية مفرزة إنزيم، أجهزة الطرد المركزي في 200 غ عن 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    6. إزالة المادة طافية باستخدام ماصة باستور ونفض الغبار الجزء السفلي من أنبوب لجعلها مفردة الخلايا في بيليه. ريسوسبيند في المتوسط التجميد الكامل في كثافة 1 × 106/mL وقاسمه في كريوفيالس. تخزين في حاوية تجميد بين عشية وضحاها في-80 درجة مئوية. ثم نقل إلى النتروجين السائل للتخزين على المدى الطويل.

2-إعادة برمجة في بلوريبوتينسي

  1. الحصول على البلازميدات إعادة برمجة
    1. شراء والبلازميدات إعادة برمجة من خلال مستودع بلازميد غير هادفة للربح. ويلزم "اتفاق نقل المواد".
    2. تحويل الخلايا المختصة كولاي البلازميدات وعزل البلازميدات استخدام مجموعة أدوات استخراج بلازميد تجارية. اتبع إرشادات الشركة المصنعة.
    3. قياس تركيز بلازميد الحمض النووي باستخدام جهاز المطياف الضوئي. وتهدف لتركيز بلازميد الناتجة عال، من الناحية المثالية حوالي 1 ميكروغرام/ميليلتر لتجنب إضعاف العينة أثناء تعداء.
    4. قياس تركيزات والبلازميدات الفردية باستخدام الأشعة فوق البنفسجية--جهاز المطياف الضوئي وقاسمه منهم على حدة.
    5. مزيج معا ميكروغرام 3 و 3 ميكروغرام و 2 ميكروغرام من EN2K و ET2K و M2L البلازميدات، على التوالي. هذا هو الحل بلازميد إعادة برمجة. مقدار بلازميد الحل ما يكفي ترانسفيكت 1 × 106 خلايا. إعداد عدة مثل مختبرين.
    6. تخزين جميع مختبرين في-80 درجة مئوية.
  2. إعداد لوحات الثقافة المستهدفة
    1. معطف واحد لوحة 6-جيدا مع فيترونيكتين – إضافة 1 مل من المخزن المؤقت لتمييع فيترونيكتين في كل بئر وخلط في 40 ميكروليتر VTN الأسهم الحل (1 ميكروغرام/سم2). تترك في درجة حرارة الغرفة (RT) أو في الحضانة عند 37 درجة مئوية ح 1.
    2. فراغ-أسبيراتي الحل باستخدام ماصة باستور واستبدال مع 2 مل متوسطة أفمك في كل بئر. تخزين في 37 درجة مئوية حتى يتم الخلايا تكون مطلي.
      ملاحظة: هامة: AFMC الوسيلة المستخدمة في هذه الخطوة يجب أن لا تحتوي على أية حلول المضادات الحيوية أو فطري.
  3. الحصاد مثقف الابتدائي أفسك/أمسك
    ملاحظة: قم بتوسيع أفسك/أمسك في الثقافة ما يكفي لجعل الأرصدة المجمدة في عدد مرور منخفضة وتكريس قارورة T-75 واحدة لإعادة برمجة. منذ قليلة كما تكفي 100,000 الخلايا لتجربة، وتهدف إلى جمع حوالي 500,000 الخلايا للتعويض عن الخسائر، وإذا كانت الأمثل لمعلمات تعداء أو ظروف ثقافة مختلفة لفحصها.
    1. في أقرب وقت ممكن في ممر منخفض، حصاد أفسك/أمسك استخدام الخلية المفرزة إنزيم ميكس كما هو موضح في الخطوة 1.3.1 إلى 1.3.2. بعد أن تم فصل الخلايا، تابع إلى الخطوة التالية.
    2. ريسوسبيند بيليه في 1 مل من برنامج تلفزيوني ومزيج جيد لغسل مكونات المصل. عد الخلايا باستخدام هيماسيتوميتير. ضبط كثافة الخلية إلى 100,000 مليلتر من برنامج تلفزيوني وقاسمه إلى 1.5 مل ميكروسينتريفوجي الأنابيب. وهذا ما يضمن إلا أدنى وقت اتصال بين الخلايا والمخزن المؤقت المستخدم تعداء.
    3. ضع أنبوب ميكروسينتريفوجي على رأس مل 5 أنابيب البوليستيرين (كمحولات، سوف تسمح للطرد المركزي في دوار سوينغ عادية) وأجهزة الطرد المركزي في 200 x ز لمدة 4 دقائق في درجة حرارة الغرفة. عكس هذه الأنابيب وتجاهل المادة طافية في حاوية نفايات. لا تستخدم دوار زاوية ثابتة.
    4. إجراء خطوة إضافية استخدام الطرد المركزي في 200 x ز لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة. سيسمح هذا بقية السائل من جدران أنبوب لتجميع في الجزء السفلي. نضح بعناية كل ذلك باستخدام ماصة 200 ميليلتر.
  4. تعداء مع إعادة برمجة والبلازميدات
    1. لإعادة برمجة التجارب، نظام تعداء (انظر الجدول للمواد) ستستخدم لتقديم والبلازميدات إعادة برمجة في الخلايا. وضع أنابيب تعداء واستثارة المخزن المؤقت، نصائح تعداء والعازلة كهربائياً في مجلس الوزراء زراعة الأنسجة. الكواشف طقم يتم الاحتفاظ في الرايت حتى يتم فتحها، ثم يتم تخزينها في 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: نحن نستخدم إصدار الطقم 10 ميليلتر.
    2. تحريك إغلاق الجهاز تعداء بحيث يمكن أن توضع محطة أنبوب به مباشرة إلى مجلس الوزراء. ملء أنبوب تعداء واحد مع 3 مل من المخزن المؤقت الالكتروليتى وجبل الأنبوب في المحطة التي دفعها طوال الطريق داخل الفتحة.
    3. تأخذ بلازميد إعادة برمجة مختبرين الحل أعد الخطوة 2.1.5 خارج مخزن-80 درجة مئوية والسماح لها بالذوبان في RT في ثقافة مجلس الوزراء.
    4. على الجهاز تعداء، حدد المعلمات تعداء التالية: 950 الخامس، 40 مرض التصلب العصبي المتعدد، ونبض 1.
    5. ريسوسبيند بيليه الذي يحتوي على خلايا 100,000 في 10 ميليلتر استثارة العازلة. العمل بسرعة من هذه النقطة في المخزن المؤقت لاستثارة السامة قليلاً ووقت تعرض لزيادة النتائج في بقاء خلية أقل بشكل ملحوظ.
    6. خلط في 1/10 من إعادة برمجة بلازميد الحل (حل الكوة مستعد لما مجموعة 1 × 106 خلايا).
    7. جبل تلميح تعداء على ماصة تعداء.
    8. نضح تعليق خلية في تلميح تعداء بعناية، تجنب تكوين فقاعات الهواء. إذا هي لاحظت فقاعات، طرد التعليق وكرر التطلع. وسوف تعوق فقاعات الهواء تعداء.
    9. إدراج أنبوب تعداء ماصة تعداء واضغط الزر "ابدأ" على شاشة الجهاز تعداء. انتظر شاشة رسالة إعلام بنجاح تعداء وإزالة الماصة من الأنبوب فورا.
    10. طرد التعليق في 1 جيدا من لوحة 6-جيدا الهدف أعد في القسم 2-2. خلط في الأجل المتوسط من المجاورة شكل جيد وتوزيع التعليق على قدم المساواة في آبار على حد سواء (كثافة الخلية الناتجة ستكون 50,000/جيد).
    11. كرر تعداء لجميع ميكروسينتريفوجي الأنابيب التي تحتوي على أفسك/أمسك على حدة. ضع اللوحة في الحضانة عند 37 درجة مئوية و 5% أول أكسيد الكربون2.
  5. ثقافة ترانسفيكتيد أفسك/أمسك
    1. الثقافة transfected الخلايا لمدة 2-5 أيام. قم بالتبديل إلى إعادة برمجة المتوسطة تتألف من E8 تستكمل مع 100 ميكرون من بوتيرات الصوديوم في اليوم 3.
      ملاحظة: يمكن أن يؤديها مرور الثانوية لتجنب فرط مصدر أفسك/أمسك. بيد باساجينج سيتم تعطيل الخيار لحساب كفاءة إعادة برمجة بشكل صحيح إذا كانت هذه المعلمة للفائدة.
    2. تغيير المتوسطة إعادة برمجة كل يوم لكل يوم لمدة 10 أيام. تغيير في المتوسط كل يوم من يوم 10 على.
  6. الانتقاء اليدوي من المستعمرات ريبروجراميد الكامل للتوسع في الاستنساخ
    1. تظهر المستعمرات أعيدت برمجتها تماما حول يوم 14. السماح للمستعمرات توسيع حجمها وتصبح مدمجة. يمكن يدوياً اختار وتحويلها إلى لوحات جديدة لها في أقرب وقت يوم 15-16.
    2. ح 1 قبل إجراء الانتقاء، معطف لوحات 24-جيدا مع 8 ميليلتر من VTN في 300 ميليلتر من المخزن المؤقت لتمييع فيترونيكتين كل بئر (1 ميكروغرام/سم2) واحتضان RT أو 37 درجة مئوية. استبدال الحل مع المتوسطة E8 دون بوتيرات الصوديوم.
    3. حدد المستعمرات ذات حجم كاف (من الناحية المثالية ما يزيد على 400 ميكرومتر في القطر) في ثقافة عقيمة مجلس الوزراء. ويمكن استخدام مجهر تباين المرحلة أو ستيريوميكروسكوبي.
    4. الانتقاء، سيتم استخدام مجهر تصوير شاشات الكريستال السائل وضعها في مجلس الوزراء منذ رصد يلغي الحاجة إلى أوكولارس. تعقيم مرحلة مجهر مع الإيثانول 70%.
    5. استخدام مجهر ثقافة خلية مرحلة عادية-على النقيض، حدد وضع علامة وملاحظة عدد المستعمرات انتقاء. هذا أمر مهم للتأكد من عدم إضاعة الوقت خلال عملية الانتقاء الفعلي لهذه العملية.
    6. شغل عدد من أنابيب PCR التي مساوية أو أكبر من عدد المستعمرات انتقاء مع 30 ميليلتر من 0.5 ملم حمض الإيثيلين (يدتا) في برنامج تلفزيوني. سيتم وضع المستعمرات داخل هذه الأنابيب للتفكك الجزئي قبل الطلاء.
    7. خطة لاختيار 5 مستعمرات في وقت من لوحات باستخدام ماصة 10 ميليلتر تعيين إلى 2 ميليلتر. عقد طرف الماصة بزاوية عند حافة مستعمرة بعناية وعلى نحو تدريجي كشط مستعمرة كله قبالة السطح. نضح مستعمرة كاملة في تلميح ماصة على الفور ونقلها إلى أحد أنابيب PCR مستعدة مع يدتا.
    8. كرر مع المستعمرات 4 المتبقية. تبني على RT لمدة 4-6 دقائق.
    9. بيبيت تعليق صعودا وهبوطاً برفق باستخدام تلميح ماصة أكبر لتقسيم هذه المستعمرة إلى كتل أصغر حجماً. تجنب إنشاء تعليق خلية مفردة.
    10. لوحة التعليق مباشرة إلى هدفا جيدا لصفيحة 24-كذلك أعد الخطوة 2.6.2. كرر مع المستعمرات المتبقية.
    11. كرر الخطوات 2.6.6 خلال 2.6.10 إذا المستعمرات أكثر من 5 انتقاء ولكن عدم اختيار المستعمرات أكثر من 5 في وقت واحد. احتضان CO 37 درجة مئوية و 5%2.
  7. التوسع في الاستنساخ ونضج للجنة التوجيهية
    1. السماح للمستعمرات أن تنمو وتصبح مدمجة. 3-6 أيام تكفي. تغيير ثقافة المتوسط يوميا. استخدم بين 400 ميليلتر و 1 مل من المتوسطة E8 استناداً إلى كثافة الخلية.
    2. وسيوسع الآبار لصفيحة 24-جيدا مع كثافة مستعمرة كافية في لوحات 6-جيدا. ح 1 قبل باساجينج، معطف لوحات 6-جيدا مع VTN (كما هو الحال في خطوة 2.2.1). قم باستبدال الحل في البئر مع 2 مل متوسطة E8 كل بئر.
    3. نضح المتوسطة المستهلك من الآبار المصدر باستخدام ماصة 1 مل واستبدال مع 300 ميليلتر من 0.5 مم أدتا غسل. نضح فورا باستخدام تلميح ماصة نفس واستبدال مع 300 ميليلتر من 0.5 مم يدتا مرة أخرى، ثم احتضانها في RT لأدنى 5 نضح جميع السائل باستخدام ماصة 1 مل.
    4. تعيين ماصة 1 مل إلى القدرة وجبل تلميح 1 مل على صعيد تحمل عليه نضح المتوسطة E8 من الهدف في التلميح. يغسل ثقافة اللجنة التوجيهية المصدر مع تيار الوسط.
    5. نقل التعليق في الهدف جيدا وبيبيت صعودا وهبوطاً عدة مرات لتفريق مستعمرات في كتل من الخلايا 20-50. تأكد من أنها تحصل على توزع بالتساوي في البئر هزاز لطيف وتهز اللوحة واحتضان في 37 درجة مئوية و 5% CO2.
    6. تغيير في المتوسط يوميا ومرور كل 3 إلى 4 أيام. يمكن وضع علامة تحت مجهر تباين المرحلة أي مستعمرات التفريق وإزالتها باستخدام تلميح ماصة في ثقافة مجلس الوزراء. وهذا يسمح للنشر الانتقائي لثقافة عالية الجودة الصرفة اللجنة التوجيهية.
    7. ح 1 قبل باساجينج، معطف آبار صفيحة 6-جيدا مع VTN كما هو الحال في خطوة 2.2.1. قم باستبدال الحل مع 2 مل متوسطة E8 كل بئر.
    8. باساجينج الروتيني شبيه الأولى باساجينج القيام به باستخدام 0.5 مم يدتا (الخطوات 2.7.2 ل 2.7.5). استبدال المستهلك المتوسط في بئر واحدة للوحة 6-جيدا مع 1 مل أدتا غسل وتجاهل.
    9. أضف 1 مل يدتا واحتضان في RT لمدة 5-7 دقائق للتفكك الجزئي. تحسين وقت الحضانة إذا اللازمة، مع التأكد من تعليق حول 20-50-الخلية إلى كتل يتم إنتاج. تجنب التفكك في الخلايا المفردة.
    10. تجاهل الحل يدتا ونضح 1 مل المتوسط E8 استخدام ماصة 1 مل من الهدف في تلميح ماصة واسعة-تتحمل.
    11. يغسل ثقافة المصدر اللجنة التوجيهية مع تيار الوسط E8 مرارا وتكرارا حتى صدر جزء المرجوة من ذلك من على سطح الأرض ونقل إلى الهدف جيدا. هذا الجزء يمثل نسبة سبليت (مثلاً، 1/8 الثقافة يمكن نقلها لنسبة 1:8.)
    12. مرور كل 3-4 أيام. السماح للخطوط التوجيهية ناضجة باستزراع لهم للممرات 15 على الأقل قبل استخدامها في التجارب النهائية

3. وصف وتأكيد بلوريبوتينسي

ملاحظة: تشير إلى الملفات التكميلية للحصول على تفاصيل حول التدفق الخلوي والفحص المجهري [كنفوكل].

  1. فحص تكوين تيراتوما
    1. لتحديد قدرة اللجنة التوجيهية أن يميز في أنسجة تمثيلية من جميع الطبقات الجرثومية الثلاث بمقايسة تشكيل تيراتوما، اتبع سياسات مؤسسية بشأن الرعاية الحيوانية واستخدامها، التخطيط للمستقبل لإتاحة الوقت لإيداع البروتوكول المناسب الوثائق. تشكيل تيراتوما في الفئران سوف يستغرق ما بين 6-10 أسابيع.
    2. ثقافة 4 آبار للوحة 6-جيدا كل سطر اللجنة التوجيهية لمدة 4 أيام. العدد التقريبي للخلايا تحقن في الجناح واحدة على فأرة الحاسوب من 0.5 إلى 1 × 106 خلايا. اختياري: إضافية جيدا يمكن أن تكون مكرسة لتحديد عدد خلايا ممثل في بئر عن طريق تفكك خلية مفردة مع إنزيم خلية مفرزة والعد.
    3. حساب حجم الخليط E8/بم سيتم تعليق كتل اللجنة التوجيهية في: كلا الجناحين بالماوس يتم حقنها، كل منها 150 ميليلتر من تعليق أجمة. الفئران الثلاثة كافية لاختبار تيراتوما تشكيل اللجنة التوجيهية سطر واحد. وتشمل ميليلتر إضافية 150 كل إبرة في حجم الناتج تعويض الخسارة في التخزين الميت. يتم استخدام إبرة 1 كل الماوس. فمن مجموع حجم 3 * (150 ميليلتر * 2 + 150 ميليلتر) = ميليلتر 1350
    4. ننأى المستعمرات اللجنة التوجيهية مع يدتا جزئيا كما لو كانوا يريدون أن باساجيد، كما هو موضح في الخطوات 2.7.8 ل 2.7.10. من المهم أن تنفصل إلى كتل المستعمرات ولا يفصل في الخلايا المفردة.
    5. يغسل قبالة المستعمرات اللجنة التوجيهية مع ميليلتر 675 المتوسطة E8 (نصف حجم المحسوبة من الخطوة 3.3.3)، استخدام تلميح تحمل واسعة. نقل تعليق أجمة في أنبوب البوليستيرين 5 مل. ضع على الجليد.
    6. وتجمع بين ميليلتر 675 من بم. ستبقى على تعليق الناتجة على الجليد حتى الحقن.
    7. تخدير الفئران شل لهم باستخدام إيسوفلوراني. هذا ينبغي أن يؤديها أو تسترشد بالموظفين المهرة فيفاريوم.
    8. دوامة البوليستيرين 5 مل الأنبوبة بإيجاز ونضح تعليق أجمة (450 ميليلتر للماوس) في محقن الأنسولين واحدة مزودة بإبرة ز 22. ضخ 150 ميليلتر من تعليق خلية تحت الجلد. هذا المجلد يحتوي على حوالي 1 × 106 خلايا (راجع الخطوة 3.1.2).
    9. حقن الفئران 3 كل سطر اللجنة التوجيهية. اتباع ممارسات رعاية الحيوان السليم لجميع الإجراءات.
    10. متابعة الحالة الصحية للفئران يوميا.
    11. عندما تيراتوماس الوصول إلى قطر نقطة نهاية من 1.5 إلى 2 سم، euthanize الفئران و explant teratomas وتخزينها في محلول الفورمالين لتثبيت الأنسجة ح 24.
    12. إحضار teratomas الثابتة إلى منشأة أساسية علم الأنسجة الهيماتوكسيلين ويوزين تلطيخ (H & E). وسوف الصف أخصائي وجود أنسجة من جميع الطبقات الجرثومية الثلاث.
      ملاحظة كاريوتيبينج: اللجنة التوجيهية يعيش الثقافات يجب أن تشحن إلى المتخصصة المختبرات الخلوية الوراثية لاختبار السلامة تناذر. من المستحسن إجراء هذا الاختبار كل الممرات 5.
  2. التنميط النسخي
    1. ثقافة ويلز 2 من لوحة 6-جيدا لمدة 3-4 أيام للحصول على عينة من الحمض النووي الريبي واحدة. استخدم فقط ثقافات عالية الجودة، يمكن معالجة التلوث طفيفة مع التفريق بين الخلايا بإلغاء تثبيتها باستخدام تلميح بيبيت.
    2. عزل الحمض النووي الريبي من الثقافات اللجنة التوجيهية باستخدام مجموعة أدوات متوفرة تجارياً يتبع البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة. شحن العينات إلى منشأة متخصصة أساسية الجينوم.
    3. الحصول على ملفات النسخي العالمية للخطوط التوجيهية باستخدام [ميكروارس] (انظر الجدول للمواد للخيارات المعتمدة) أو تسلسل الحمض النووي الريبي.
    4. إرسال ملفات "*.idat" من أجل تقييم بيوينفورماتيك من بلوريبوتينسي عن طريق وصلة إنترنت في معهد كوريل. وبدلاً من ذلك، يقدم "*.cel" الملفات لتحديد بيوينفورماتيك من نوع من الخلايا، بما في ذلك الخلايا الجذعية pluripotent، من خلال واجهة على شبكة إنترنت في جامعة جونز هوبكنز. انظر الجدول للمواد لمزيد من التفاصيل عن أنواع البيانات قبول فحوصات bioinformatic الفردية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم الحصول على موافقة خطية مستنيرة من المرضى قبل الحصاد السائل السلوى لأغراض الاختبار وتكريس قاسمة صغيرة من السائل للبحوث الوراثية. مطلوب لا موافقة لاستخدام الغشاء السلوى في البحوث كما المشيمة تمثل النفايات الطبية. الخلايا الجذعية السائل والغشاء السلي عرض خصائص الوسيطة نموذجية، وشكليا خلاياها على شكل عمود الدوران ومرحلة مشرقة. عند إعادة برمجة، الخلايا يخضع الوسيطة إلى الظهارية (MET) الانتقال والحصول على مورفولوجيا تشبه حصاة كبيرة ومنظمة المكانية من المستعمرات، التي تشير إلى خصائص الظهارية....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المرحلة الأولى من إنشاء اللجنة التوجيهية من الخلايا الجذعية الجنينية ينطوي على استخراج الخلايا المصدر من الأنسجة الجنينية، والثقافة، والتوسع، وإدخال والبلازميدات إعادة برمجة ابيسومال. هذه المرحلة هو متبوعاً بنقطة ثقافة حوالي 14-18 يوما قبل أن يمكن توسيع المستعمرات الأولى أعيدت برمجتها تماما. المرحلة النهائية نضوج المستنسخين اللجنة التوجيهية. استخراج الأولية للخلايا الجذعية غشاء السلي يتحقق عن طريق هضم الميكانيكية والانزيميه مجتمعة amnion. ووجدنا أن فترة حضانة من 30 دقيقة أسفرت عن أكبر عدد من الخلايا المستخرجة مع بقاء أعل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذا العمل كان يدعمها في فوندز Medizinische Forschung في جامعة زيوريخ، فورشونجسكريديت من جامعة زيوريخ، وديكينستون NMSCh تحت 10.216 الزمالات و 12.176، المجتمع السويسري للقلب، "العلم الوطني السويسري" مؤسسة في إطار المنحة [320030-122273] و [310030-143992]، البرنامج الإطاري السابع، صمام الحياة، اللجنة الأوروبية في إطار منحة [242008]، ومؤسسة مايينفيش أولغا، مؤسسة امدو، بدء المنحة 2012 من مستشفى جامعة زيورخ، و التمويل الداخلي لمعهد السرطان ميتشل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
طقم تفكك الورم ، نظامMiltenyi Biotec130-095-929البشري ، مجموعة الكاشف ، يشمل أنابيب تفكك الأنسجة وإنزيمات تفكك الأنسجة
اللطيفةMACS DissociatorMiltenyi Biotec130-093-235نظام تفكك الأنسجة ، الفصل
Thermo Scientific & trade ؛ شاندون & تجارة; مشرط يمكن التخلص منه رقم 10 ، معقم ، ملفوف بشكل فردي ، 5.75 (14.6 سم)ثيرمو-فيشر3120032
70 وميكرو ؛ مصافي الخلايا mCorning10054-456
RPMI 1640 متوسطةThermo-Fisher32404014 
منصة هزازVWR40000-300
50 مل أنابيب الطرد المركزيThermo-Fisher339652
15 مل أنابيب الطرد المركزيThermo-Fisher339650
EBM-2 الوسط القاعديLonzaCC-3156الوسط القاعدي لوسط AFMC
FGF 2 الإنسان (معبرا عنه بالإشريكية القولونية ، غير الجليكوزيلات)Prospec BioCYT-218bFGF، مكمل ل AFMC المتوسطة
EGF Human ، PichiaProspec BioCYT-332   ؛EGF ، مكمل غذائي لوسط AFMC
LR3 الأنسولين مثل عامل النمو -1 المؤتلف البشريProspec BioCYT-022IGF ، مكمل لمصل
الأبقار الجنيني المتوسط AFMC ، Thermo-Fisher المؤهل للخلايا الجذعية الجنينية10439024FBS
المضاد الحيوي المضاد للفطريات (100X)Thermo-Fisher15240062  ؛بالنسبة ل AFSC / AMSC الأولية ، بالنسبة ل AFSC / AMSC الروتينية ، لا ينبغي أن يكون ذلك ضروريا ، لا تستخدمه في وسط للخلايا المنقولة!
حل انفصال خلايا Accutaseتقنيات الخلايا الجذعية07920إنزيم انفصال الخلية
CryoStor & trade ؛ CS10StemCell Technologies07930وسط التجميد
الكامل PBS ، درجة الحموضة 7.4Thermo-Fisher Scientific10010023 
مجموعة EndoFree Plasmid Maxi Kit (10)Qiagen12362لعزل البلازميد
pEP4 E02S EN2KAddgene20925EN2K ، عوامل إعادة البرمجة Oct4 + Sox2 ، Nanog + Klf4
pEP4 E02S ET2KAddgene20927ET2K ، عوامل إعادة البرمجة Oct4 + Sox2 ، SV40LT + Klf4
pCEP4-M2LAddgene20926M2L ، عوامل إعادة البرمجة c-Myc + LIN28
NanoDrop 2000c UV-Vis مقياس الطيفالحراري فيشرND-2000Cالطيف الضوئي
نيون & ريج ؛ نظام التعداءMPK5000Thermo-Fisher، المكونات:
ماصة نيون - ماصة تعداء
جهاز نيون - جهاز تعداء
Neon & reg ؛ نظام التعداء 10 & micro; مجموعة الموادKit Thermo-FisherMPK1025لنظام تعداء النيون ، تحتوي على:
طرف نيون - طرف التعداء
أنبوب نيون - أنبوب التعداء
العازلة R - عازلة إعادة التعليق
العازلة E - العازلة الإلكتروليتية
Stemolecule & trade ؛ محسن جزيء صغير من زبدات الصوديومStemGent04-0005لإعادة برمجة
تقنيات الخلايا الجذعية TeSR-E805940E8 متوسط
Vitronectin XF & trade ؛تقنيات الخلايا الجذعية07180VTN ، تركيز المخزون 250 وميكرو ؛ جم / مل ، يستخدم للطلاء عند 1 & ميكرو ؛ g / cm 2< / sup> في تخفيف vitronectin (CellAdhere) المخزن المؤقت
CellAdhere & trade ؛ تقنيات التخفيف العازلةStemCell07183vitronectin dilution
buffer UltraPure & trade ؛ 0.5M EDTA ، درجة الحموضة 8.0Thermo-Fisher15575020تخفيفها مع PBS إلى 0.5 ملي مولار قبل استخدام
EVOS & reg ؛ نظام التصوير FLنظاممجهرAMF4300
CKX53 مجهر مقلوبأوليمبوسمجهر ثقافة الخلية التباين
المرحلة بيرس والتجارة ؛ 16٪ الفورمالديهايد (ث / الحجم) ، الخالي من الميثانولThermo-Fisher28908مخفف إلى 4٪ مع PBS قبل الاستخدام ، يمكن تخزينه المخفف عند 2-8 درجة ؛ C لمدة أسبوع
Perm Buffer IIIBD Biosciences558050عازلة نفاذية ، برد إلى -20 درجة ؛ C قبل استخدام
Mouse IgG1 ، & kappa ؛ التحكم في النمط المتماثل ، Alexa Fluor & reg ؛ 488BD Biosciences557782التحكم في النمط المتماثل ل Oct3 / 4A ، Nanog
Mouse IgG1 ، & kappa ؛ التحكم في النمط المتماثل ، Alexa Fluor & reg ؛ 647BD Biosciences557783التحكم في النمط المتماثل ل Sox2
Mouse المضاد للإنسان Oct3 / 4 (الشكل الإسوي البشري A) ، Alexa Fluor & reg ؛ 488BD Biosciences561628
Mouse Anti-human Nanog ، Alexa Fluor & reg ؛ 488BD Biosciences560791
Mouse Anti-Human Sox-2 ، Alexa Fluor & reg ؛ 647BD Biosciences562139
الماوس IgGM ، & التحكم في النمط المتماثل ، Alexa Fluor & reg ؛ 488BD Biosciences401617التحكم في النمط المتماثل ل TRA-1-60
Mouse IgGM ، & kappa ؛ التحكم في النمط المتماثل ، Alexa Fluor & reg ؛ 647BD Biosciences401618التحكم في النمط المتماثل ل TRA-1-81
الفأر المضاد للإنسان TRA-1-60 ، Alexa Fluor & reg ؛ 488BD Biosciences330613
ماوس مضاد للإنسان TRA-1-81 ، Alexa Fluor & reg ؛ 647BD Biosciences330705
Mouse IgG1 ، & kappa ؛ التحكم في النمط المتماثل ، Alexa Fluor & reg ؛ 488BD Biosciences400129التحكم في النمط المتماثل ل SSEA-1
Mouse IgG3 ، & kappa ؛ التحكم في النمط المتماثل ، Alexa Fluor & reg ؛ 647BD Biosciences401321التحكم في النمط المتشاوي ل SSEA-4
Mouse anti-human SSEA-1 ، Alexa Fluor & reg ؛ 488BD Biosciences323010
فأر مضاد للإنسان SSEA-4 ، Alexa Fluor & reg ؛ 647BD Biosciences330407
Affinipure F (ab') 2 جزء من الماعز المضاد للفأر IgG + IgM ، Alexa Fluor & reg ؛ 488Jackson Immunoresearch115-606-068استخدم عند تخفيف 1: 600 أو قم بتحسين
Affinipure F (ab') 2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG + IgM ، Alexa Fluor & reg ؛ 647Jackson Immunoresearch115-546-068استخدم عند تخفيف 1: 600 أو تحسين
مخزون DAPIThermo-Fisher ScientificD2149010 ملي مولار ، وتخفيف إضافي إلى 1: 12.000 لحل العمل
Corning & reg ؛ Matrigel & reg; انخفاض عامل النمو ،غشاء القاعدة 356231 كورنينجالأحمر (BMM)
الفئران البيج ، أنثىتاكونيكCBSCBG-F
RNeasy Plus Mini Kit (50)طقم عزل الحمضالنووي الريبي Qiagen74134
قوارير T-25 ،Thermo-Fisher156367
T-75 المعالجة بزراعةThermo-Fisher156499
Nunc & trade; طبق ثقافة الأنسجةThermo-Fisher12-567-650 طبق زراعة الأنسجة 10 سم
6 ألواح آبار ، غرفةThermo-Fisher140675
Neubauer المعالجة بزراعة الأنسجة (مقياس الدمVWR15170-173
Mr. Frosty & trade ؛ حاوية تجميدThermo-Fisher5100-0001 حاوية التجميد
أنابيب FACS ، أنبوب اختبار البوليسترين القاع المستدير ، 5 ملكورنينج3520585 مل أنابيب البوليسترين
أنابيب إيبندورف ، 1.5 ملThermo-Fisher05-402-961.5 مل أنابيب الطرد المركزي الدقيقة
أنابيب PCR ، 200 وميكرو ؛ لThermo-Fisher14-222-262
، من 100 إلى 1250 وميكرو ؛ لThermo-Fisher02-707-407ماصة ضيقة التجويف 1 مل
، من 5 إلى 300 وميكرو ؛ لThermo-Fisher02-707-410
أطراف ماصة ، 0.1 إلى 10 & micro ؛ لThermo-Fisher02-707-437
أطراف ماصة عريضة التجويف ، 1000 وميكرو ؛ لVWR89049-166التجويف 1 مل نصائح
زجاجية ماصات باستورثيرمو فيشر13-678-20A
إيثانول ، 200 دليلعلى Thermo-Fisher04-355-451
خلاط دوامةVWR10153-842
غطاء زجاجي ذو حجرة ، 8 آبار ، زجاج بورسليكات 1.5 ممThermo-Fisher155409زجاجي ذو قاع زجاجي من الدرجة الكونفوكية
22G إبرVWR82002-366
محاقن الأنسولينThermo-Fisher22-253-260
محلول الفورمالين ، محايد مخزن مؤقت ، 10٪Sigma-AldrichHT501128-4Lتثبيت الأورام المسخية المزروعة
Illumina HT-12 v4 Expression BeachChipIlluminaBD-103-0204المصفوفة الدقيقة للتعبير ، بدعم من PluriTest ، تم إيقافها من قبل الشركة المصنعة
PrimeView Human Genome U219 Array PlateThermo-Fisher901605 تعبير المصفوفة الدقيقة (العلامة التجارية Affymetrix سابقا) ، قريبا سيتم دعمها من قبل PluriTest
GeneChip & trade ؛ الجينوم البشري U133 Plus 2.0 ArrayThermo-Fisher902482تعبير المصفوفة الدقيقة (العلامة التجارية Affymetrix سابقا) ، بدعم من CellNet ، قريبا سيتم دعمه بواسطة PluriTest
PluriTest & reg ؛معهدكوريل www.pluritest.org ، خدمة مجانية لتقييم المعلوماتية الحيوية لتعدد القدرات ، يقبل بيانات المصفوفات الدقيقة - * ملفات .idat من منصة HT-12 v4 ، قريبا لدعم بيانات U133 و U219 microarray وتسلسل الحمض النووي
الريبي CellNetجونز هوبكنزcellnet.hms.harvard.edu ، خدمة مجانية لتحديد المعلوماتية الحيوية لنوع الخلية ، بما في ذلك الخلايا الجذعية plutipotent ، بناء على بيانات المصفوفات الدقيقة U133 - * ملفات .cel ، قريبا لدعم الحمض النووي الريبي تسلسل البيانات
تفكك الأنسجة الضوئي مقياس نظام التعداء الاستهلاكية L التصوير العلمي LCD واحد محلول مصفوفة الخالية من الفينول قوارير الأنسجة ، المعالجة بزراعة الأنسجة عد ) أطراف ماصة أطراف عريض جامعة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  2. Yu, J., et al. Induced Pluripotent Stem Cell Lines Derived from Human Somatic Cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
  3. Trounson, A., DeWitt, N. D. Pluripotent stem cells progressing to the clinic. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 17 (3), 194-200 (2016).
  4. Schmidt, D., et al. Prenatally fabricated autologous human living heart valves based on amniotic fluid derived progenitor cells as single cell source. Circulation. 116 (11 Suppl), I64-I70 (2007).
  5. Weber, B., Zeisberger, S. M., Hoerstrup, S. P. Prenatally harvested cells for cardiovascular tissue engineering: Fabrication of autologous implants prior to birth. Placenta. 32, S316-S319 (2011).
  6. Weber, B., et al. Prenatally engineered autologous amniotic fluid stem cell-based heart valves in the fetal circulation. Biomaterials. 33 (16), 4031-4043 (2012).
  7. Kehl, D., Weber, B., Hoerstrup, S. P. Bioengineered living cardiac and venous valve replacements: current status and future prospects. Cardiovasc. Pathol. 25 (4), 300-305 (2016).
  8. Slamecka, J., et al. Non-integrating episomal plasmid-based reprogramming of human amniotic fluid stem cells into induced pluripotent stem cells in chemically defined conditions. Cell Cycle. 15 (2), 234-249 (2016).
  9. Jiang, G., et al. Human Transgene-Free Amniotic-Fluid-Derived Induced Pluripotent Stem Cells for Autologous Cell Therapy. Stem Cells Dev. 23 (21), 2613-2625 (2014).
  10. Pipino, C., et al. Trisomy 21 mid-trimester amniotic fluid induced pluripotent stem cells maintain genetic signatures during reprogramming: implications for disease modeling and cryobanking. Cell. Reprogram. 16 (5), 331-344 (2014).
  11. Cai, J., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from umbilical cord matrix and amniotic membrane mesenchymal cells. J Biol. Chem. 285 (15), 11227-11234 (2010).
  12. Ge, X., et al. Human Amniotic Mesenchymal Stem Cell-Derived Induced Pluripotent Stem Cells May Generate a Universal Source of Cardiac Cells. Stem Cells Dev. 21 (15), 2798-2808 (2012).
  13. Drozd, A. M., Walczak, M. P., Piaskowski, S., Stoczynska-Fidelus, E., Rieske, P., Grzela, D. P. Generation of human iPSCs from cells of fibroblastic and epithelial origin by means of the oriP/EBNA-1 episomal reprogramming system. Stem Cell Res. Ther. 6 (1), (2015).
  14. Kang, N. -H., et al. Potential antitumor therapeutic strategies of human amniotic membrane and amniotic fluid-derived stem cells. Cancer Gene Ther. 19 (8), 517-522 (2012).
  15. Moschidou, D., et al. Valproic Acid Confers Functional Pluripotency to Human Amniotic Fluid Stem Cells in a Transgene-free Approach. Mol. Ther. 20 (10), 1953-1967 (2012).
  16. Kim, K., et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).
  17. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
  18. Yu, J., et al. Human Induced Pluripotent Stem Cells Free of Vector and Transgene Sequences. Science. 324 (5928), 797-801 (2009).
  19. Martí, M., et al. Characterization of pluripotent stem cells. Nat. Protoc. 8 (2), 223-253 (2013).
  20. Chan, E. M., et al. Live cell imaging distinguishes bona fide human iPS cells from partially reprogrammed cells. Nat. Biotechnol. 27 (11), 1033-1037 (2009).
  21. Adewumi, O., et al. Characterization of human embryonic stem cell lines by the International Stem Cell Initiative. Nat. Biotechnol. 25 (7), 803-816 (2007).
  22. Müller, F. -J., et al. A bioinformatic assay for pluripotency in human cells. Nature Methods. 8 (4), 315-317 (2011).
  23. Cahan, P., Li, H., Morris, S. A., Lummertz da Rocha, E., Daley, G. Q., Collins, J. J. CellNet: Network Biology Applied to Stem Cell Engineering. Cell. 158 (4), 903-915 (2014).
  24. Schopperle, W. M., DeWolf, W. C. The TRA-1-60 and TRA-1-81 Human Pluripotent Stem Cell Markers Are Expressed on Podocalyxin in Embryonal Carcinoma. STEM CELLS. 25 (3), 723-730 (2007).
  25. Ohnishi, K., et al. Premature Termination of Reprogramming In Vivo Leads to Cancer Development through Altered Epigenetic Regulation. Cell. 156 (4), 663-677 (2014).
  26. Schlaeger, T. M., et al. A comparison of non-integrating reprogramming methods. Nature Biotechnology. 33 (1), 58-63 (2014).
  27. Müller, F. -J., Goldmann, J., Löser, P., Loring, J. F. A call to standardize teratoma assays used to define human pluripotent cell lines. Cell Stem Cell. 6 (5), 412-414 (2010).
  28. Beers, J., et al. Passaging and colony expansion of human pluripotent stem cells by enzyme-free dissociation in chemically defined culture conditions. Nat. Protoc. 7 (11), 2029-2040 (2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

E8

مقالات ذات صلة