مقالة منهجية

النانومترية الحمض النووي كأداة مرنة لدراسة البوليمرات سيميفليكسيبلي

6.7K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/56056

⸱

أكتوبر 25, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Fraunhofer Institute for Cell Therapy and Immunology, 2Institute of Experimental Physics I, Universität Leipzig

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

سيميفليكسيبلي البوليمرات عرض الخصائص الميكانيكية الفريدة التي يتم تطبيقها على نطاق واسع بنظم المعيشة. ومع ذلك، تقتصر دراسات منهجية في البوليمرات البيولوجية نظراً لخصائص مثل صلابة البوليمر غير قابل للوصول. هذه المخطوطة يصف كيف يتم التحايل على هذا القيد بالأنابيب النانوية الحمض النووي للبرمجة، تمكين دراسات تجريبية عن أثر صلابة خيوط.

الملخص

ويمكن فهم الخواص الميكانيكية لهذه المسألة لينة معقدة، والمستندة إلى البوليمر، مثل الخلايا أو الشبكات بيوبوليمير، لا الإطار الكلاسيكي للبوليمرات المرنة ولا قضبان جامدة. خيوط الأساسية تظل ممدودة بسبب ما تيبس العمود الفقري غير التلاشي، الذي هو كمياً عن طريق طول استمرار (lp) وإنما أيضا عرضه للتقلبات الحرارية القوية. صلابة الانحناء محدود يؤدي إلى ميكانيكا الجماعية فريدة وغير عادية للشبكات الأكبر، مما يتيح تشكيل السقالات مستقرة في انخفاض حجم الكسور مع توفير أحجام كبيرة مش. هذا المبدأ الأساسي السائد في الطبيعة (مثلاً في الخلايا أو الأنسجة)، تقليل محتوى الجزيئي عالية ومما ييسر انتشارية أو النقل النشط. نظراً للآثار البيولوجية والتطبيقات التكنولوجية المحتملة في الهلاميات المائية متوافق حيويا، خضعت البوليمرات سيميفليكسيبلي دراسة كبيرة. بيد أن التحقيقات مفهومة ظلت صعبة نظراً لأنها تعتمد على البوليمرات الطبيعية، مثل خيوط الأكتين، التي غير الانضباطي بحرية. وعلى الرغم من هذه القيود، ونظرا لعدم وجود البوليمرات الاصطناعية وميكانيكيا الانضباطي، وسيميفليكسيبلي، وخيوط أكتين أنشئت كالنظام النموذجي الموحد. حد رئيسية أن الكمية الوسطى لف لا يمكن ضبطها بحرية لدراسة تأثيرها على هياكل السائبة العيانية. وتم حل هذا القيد باستخدام الأنابيب النانوية هيكلياً للبرمجة في الحمض النووي، تمكين التحكم تغيير صلابة خيوط. أنها تتشكل من خلال النماذج المستندة إلى البلاط، حيث هجن مجموعة منفصلة من خيوط مكملة جزئيا في بنية حلقة مع محيط منفصلة. نهايات لزجة، تمكين البلمرة فعالة إلى خيوط عدة ميكرون في الطول، وتتميز هذه الحلقات وعرض مماثل البلمرة حركية البوليمرات البيولوجية الطبيعية. سبب الميكانيكا القابلة للبرمجة، وهذه الأنابيب أدوات تنوعاً، رواية دراسة أثر لف في جزيء الواحد فضلا عن حجم الجزء الأكبر. وعلى النقيض من خيوط الأكتين، تظل مستقرة على مدى أسابيع، دون انحطاط ملحوظ، وتعاملها مع بسيط نسبيا.

المقدمة

بسبب السلوكيات المعقدة خصائصها الميكانيكية الفريدة التي يوفرها، البوليمرات سيميفليكسيبلي هي اللبنات الأساسية لمعيشة هذه المسألة. خلافا للبوليمرات المرنة، البوليمرات سيميفليكسيبلي تعتمد على تكوين ممدودة بسبب تصلب العمود الفقري غير التلاشي على حين لا تزال تبقى خاضعة للتقلبات الحرارية قوية1. وهكذا، لا يمكن تطبيق النماذج العشوائية البحتة على سلوكهم، كما هو الحال مع النقيض إلى النقيض تماما مرنة أو جامدة البوليمرات. ووضعت ما يسمى دودة مثل سلسلة طراز2،3،4 لقياس صلابة هذا عن طريق لف، الذي هو ثابت الانحلال في العلاقة الظل الظل على طول الشعيرة4. في حالة مماثلة لطول كفاف (lc) خيوط لف ، يعتبر البوليمر سيميفليكسيبلي1. مماثلة لأقطاب خيمة، تستقر ترتيباتها في الشبكات أو حزم النظام الجماعي بأكمله في انخفاض حجم الكسور، مما يؤدي إلى لزج مطاطي غير عادية خصائص5،،من67، 8،9. وهذه الهياكل توفير مرونة عالية بوجه عام مش أحجام10، الحفاظ على سلامة الميكانيكية بينما لا يزال تيسير انتشارية وعمليات النقل النشط. هذه الخاصية مناسبة خاصة للنظم البيولوجية مثل سيتوسكيليتون أو المصفوفة خارج الخلية، ولكن يتم استخدامه على نطاق واسع في الغذاء الهندسة1،،من1112.

تتجاوز أهميتها للمسألة المعيشية، من الأهمية بمكان دراسة شاملة الخصائص الفيزيائية لهذه الهياكل من أجل لديك الأدوات اللازمة لوضع مواد المحاكاة البيولوجية أو رواية الهلاميات المائية. وهذا يعني من حيث سيميفليكسيبلي البوليمرات، منهجية تحديد الخصائص الجماعية للشبكات الناتجة عن خصائص خيط واحد مثل لف ووضع الإطار النظري الوصفي. في دراسات رائدة، تأسست كنظام نموذجي للبوليمرات سيميفليكسيبلي أكتين بيوبوليمير الخلوية ويعتبر على نطاق واسع لا تزال المعيار الذهبي5،13،،من1415 , 16 , 17-دراسات شاملة غير محدودة مع هذا النظام نظراً لأنها ترتبط بالخصائص الملازمة لهذا البروتين. مختلف النهج النظري قد تهدف إلى بناء وصفاً للسلوكيات الميكانيكية غير عادية على مستوى واحد-خيوط وأدت إلى خاصة مختلفة توقعات التحجيم للاعتماد على معامل القص الهضبة مطاطا الخطي، ز 0 (أي "مرونة" من الشبكة)، وفيما يتعلق بتركيز (ج) و لف6،7،،من1314، 15،،من1819،20،21،،من2223. بينما زيادة تركيز متاحة في تجارب مع القائم على الأكتين أو غيرها من النظم النموذجية وفي حين كانت التنبؤات النظرية دقة التحقق من، 13،،من1624 القياس بالنسبة لف ظل 25، تجريبيا غير قابل للوصول. هذا، ومع ذلك، يشكل قيداً رئيسيا نظراً لف هو أيضا متغير مستقل هو تحديد كمية بوليمرات سيميفليكسيبلي.

مؤخرا تم حل هذا القيد المركزي، والطبيعية التي تفرضها ثابت lp من أكتين أو البوليمرات الأخرى المستمدة من بيولوجيا مثل الكولاجين عن طريق استخدام أنابيب الحمض النووي القائم على بلاط، التي الانضباطي في خواصها الميكانيكية 9 , 26 , 27 , 28-اختلافات طفيفة في أبنية الأنابيب (مثلاً، إعداد مختلفة من الحمض النووي المكونة لها فروع داخل الحلبة وحدة) تعطي قيم مميزة لامف، التي يمكن تقييمها عن طريق الفحص المجهري الأسفار، تحليل أنبوب تقلب واحد أو بتقييم التكوينات المنحنية من عدة أنابيب التقيد بها، كما وصف سابقا9،28. وكشفت هذه التحاليل أن تختلف قيمp lالسكان أنبوب مختلفة على أمر واحد أو أكثر من حجم، وأن أساليب التقييم المختلفة تسفر عن نتائج متسقة9،28.

المثير للدهشة، سجلت الشاملة مقياس خطي الهضبة مطاطا القص معامل ز0 فيما يتعلق بتركيز و لف لا يتمشى مع جميع المناهج النظرية السابقة 9، مما يدل على وجه الخصوص كثير أقوى من المتوقع الاعتماد لف. هذه النتائج تؤكد قيمة نظام نموذج جديد لدراسة خصائص البوليمرات سيميفليكسيبلي الوسطى. توظيف n-الحلزون الدنا أنابيب كبيرة ويوسع نطاق هذه التحقيقات. لا يمكن أن تختلف لف بحرية دون تغيير المواد الأساسية فحسب، بل الطبيعة القابلة للبرمجة للحمض النووي يمكن تمكين الفحص المنهجي لعناصر إضافية، مثل كروسلينكس أو عمليات التحويل الحركية. بالإضافة إلى ذلك، هذه الأنابيب القابلة للذوبان في الماء، وعلى عكس معظم البروتينات، مستقرة في درجة الحموضة كافية وظروف الأيونية لعدة أسابيع، دون تدهور يمكن كشفها9.

لتجميع هذه الأنابيب، يتم استخدام مجموعة منفصلة من النوكليوتيد الحمض النووي، كل منها يحتوي على هذين المجالين تتشارك تسلسلات قاعدة مكملة إلى شقين المجاورة (نظراً لتسلسل معين، لا يمكن أن تشكل حبلا واحد هياكل مثل دبابيس الشعر). تسلسلات مكملة هجن على نحو دوري، تشكيل الحلقات المغلقة، وتداخل نصف شرائح مزدوجة حلزونية ن مترابطة (الشكل 1A و ب). هذه شكل حلقات في قطر منفصلة (الشكل 1)، وعلى تكوين تداخل نصف يكشف نهايات لزجة المحوري مكملة لنهايات لزجة خاتم آخر. هذا بالإضافة إلى انتقائية لمطابقة النوكليوتيد المشغلات التراص الخواتم، مما يؤدي إلى البلمرة فعالة من أنابيب الحلزون الدنا الخيطية من حجم n (nHT). قياس أطوال كفاف بهم عادة عدة ميكرون في الطول، وتوزيعها على طول يماثل أكتين خيوط9،26،،من2728. ولقد ثبت للأنابيب النانوية الحمض النووي مماثلة أنهم في الواقع يحمل حركية البلمرة شبيهة بخيوط أكتين وميكروتوبوليسالفئة p = "xref" > 29. يمكن أن تختلف تبعاً لعدد n من خيوط الحمض النووي الفردية التي تشكل هيكل الحلقة الأساسية، كنترولبلي العمارة نHT، فضلا عن محيط به والقطر،. استخدام المزيد من خيوط الحمض النووي يزيد من محيط الخواتم/الأنابيب، وتحولات التغيير المعماري المقابلة الخواص الميكانيكية لأعلى قيمp l(الشكل 1)، تقابل صلابة أعلى. بمقياس mesoscopic، تترجم هذه القيمp lأكبر والتشكلات بنت أقل بسبب تصلب أعلى (الشكل 1 وه).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1-إعداد n HTs

ملاحظة: هنا، تشير n إلى عدد مختلف خيوط الحمض النووي واحد يشارك في تشكيل أنابيب الحلزون من حجم معين. قيم n = 8، ثمانية مختلف خيوط الحمض النووي واحد يشكلون عصابة وحدة.

  1. تسلسل "الحمض النووي الشراء" (درجة نقاء [هبلك] أو أعلى) من توليف الحمض النووي مناسبة الخدمة أو إجراء توليف عالية الجودة وتنقية (تسلسل نموذجية في الجدول 1).
    2. الخطوات
  2. النوكليوتيد ريسوسبيند المجففة بالتبريد في تنقية المياه ومتابعة استثارة مزيد النظر في دليل المقابلة من الشركة. ضبط الكمية المياه للحصول على تركيز نهائي من 200 مليميكرون.
  3. تحديد تركيزات الحمض النووي واحد فروع للتحقق من القيم التي يقدمها الموزع (مثلاً، عن طريق التحليل الطيفي تجاه الأشعة فوق البنفسجية في 260 nm) منذ stoichiometry الدقيق حاسم بالنسبة لعملية التجميع. حساب تركيز النوكليوتيد، آخذا في الاعتبار الوزن المولى محددة ومعامل الانقراض لكل واحد--الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي اليغنوكليوتيد.
    ملاحظة: قيم معامل الانقراض طبيعتها تختلف عن تسلسلات مختلفة وهي ذكرت في الوثائق المتعلقة بالحمض النووي التي تم شراؤها تجارياً. يمكن أيضا حساب وفقا لنموذج أقرب جاره باستخدام عدد من أدوات متاحة مجاناً على الإنترنت. الامتثال لنطاق والمطياف الخطي، النظر في إضعاف العينة المستخدمة لتحديد التركيز.
  4. ميكروبيبيتي، باستخدام مزيج الحمض النووي كل خيوط في الوقت نفسه تركيز في حاوية مناسبة ثيرموسيكلير (مثل أنبوب بكر 200 ميليلتر) النموذج المطلوب ن HTs (شروط المخزن المؤقت النهائي: 1xTE (10 مم يدتا تريس و 1 مم، درجة الحموضة 8) و 12.5 مم مجكل 2)-
    ملاحظة: عينات الحمض النووي النهائي ن HT تتكون من n-1 فروع، يو 1 − ش ن − 1، وواحدة تي ن طاق. يمكن أن تختلف التركيز كل حبلا من ميكرومولار في لأكثر من 10 ميكرومتر، تبعاً لاحتياجات المستخدم (مثلاً، < 1 ميكرومتر كل حبلا لتمييع اللاحقة لمراقبة خيوط مفردة أو تركيزات أعلى للنظر في ميكانيكا شبكة كثيفة).
  5. هجن ن HTs في ثيرموسيكلير (تمسخ لمدة 10 دقائق عند 90 درجة مئوية، مع انخفاض سريع لاحقة إلى 65 درجة مئوية؛ درجة الحرارة بطيئة الانخفاض من 65 درجة مئوية إلى 55 درجة مئوية، مع إقران قاعدة مكملة في خطوات درجة الحرارة 20 ك-0.50 لمدة 30 دقيقة كل منها؛ وهبوط سريع من 55 درجة مئوية إلى 20 درجة مئوية)؛ انظر الشكل 2 أ.
    ملاحظة: يمكن أن تطول الخطوات الانخفاض البطيء من 65 درجة مئوية لزيادة طول أنبوب متوسط؛ إلا أن الانخفاض السريع لاحقاً إلى 20 درجة مئوية أمر حاسم لتجنب تجميع أنابيب مبلمرة.
  6. تخزين المهجن ن HTs لمدة تصل إلى 3 أسابيع عند 4 درجة مئوية دون تدهور لا يمكن اكتشافها.
    ملاحظة: للأسفار يتم تهجين مجهرية، المسمى HTs ن (جزئيا) محل U1 مع تعديل U1-Cy3 (الجدول 1). لوقت أطول للمراقبة، يستحسن إضافة وكلاء مكافحة التبييض المتبعة.
  7. بعناية تمييع عينة للتركيز النهائي المطلوب (مثلاً، 4 ميكرون للشبكات أو 20 نانومتر للملاحظات خيط واحد) باستخدام المخزن المؤقت الذي عينة، إذا لزم الأمر. للتقليل من مصادر الخطأ الممكنة، تجميع عينات في تركيز النهائية المرجوة.

2. القص ريولوجيا

  1. اختيار مناسب الهندسة (لوحة لوحة أو لوحة مخروط) رهيوميتير القص الديناميكي. لاستخدام كميات صغيرة (أي، أدناه 200 ميليلتر)، هندسة مخروط-لوحة-
  2. تحميل العينة في رهيوميتير القص الديناميكي.
  3. تخميل واجهة الهواء والماء من العينة والبيئة باستخدام الخطوات التالية لمنع الآثار التبخر.
    1. المحيطي العينة مع 2.5 مل حمام المخزن المؤقت عينة-
    2. إضافة السطح فقط دون تركيز مذيل.
    3. استخدام المحاقن هاملتون لتطويق العينة مع دهن تجنب الاتصال المباشر عينة مع الهواء-
  4. ختم الدائرة عينة مع قبعة مزودة بالاسفنج الرطب، وإذا كان ذلك ممكناً، مع حمام مياه إضافية (ليس على اتصال العينة) لمواصلة قمع التبخر.
  5. بدء القياس باستخدام البرمجيات الخاصة رهيوميتير في درجة حرارة الغرفة؛ وبدلاً من ذلك، إجراء قياس درجات حرارة مختلفة، مثل 37 درجة مئوية (إذا كانت هناك حاجة إلى الظروف الفسيولوجية).
    ملاحظة: تبريد العينة غالباً ما يرافق التكثيف لبخار الماء من الجو المحيط، بينما تدفئة ويؤدي إلى زيادة التبخر. كلا آثار حسيب تغيير تركيز العينة، حيث ينبغي أن تجري جميع القياسات في سلسلة في درجة حرارة ثابتة.
  6. السماح العينة حجته على ح 2 في درجة حرارة الغرفة. قد رصد تطور الزمن مع اكتساح وقت (بيانات واحدة نقطة في الدقيقة الواحدة؛ وسلالة γ = 5%؛ التردد f = 1 هرتز).
  7. قياس الخواص الميكانيكية مع بروتوكولات الاختبار المطلوب. تبدأ بسلسلة من عمليات التمشيط التردد (f-الاحتلالات) لأنها تترك العينة سليمة والسماح لمزيد من القياسات.
    ملاحظة: بالإضافة إلى ذلك، قصيرة وينبغي إجراء عمليات التمشيط بقبل وبعد قياسات أطول (مثل طويلة والاحتلالات مع بدقة أعلى من ذلك بكثير) للتحقق من أن العينة لم يتغير طوال البروتوكول القياس الكامل.
    1. إجراء قصيرة واكتساح (مثلاً، γ = 5%؛ f = 0.01 هرتز إلى 30 هرتز؛ بيانات 5 نقاط في العقد الواحد)-
      2. أداء
    2. طويلة واكتساح (مثلاً، γ = 5%؛ f = 0.001 هرتز إلى 30 هرتز؛ 21 نقاط البيانات في العقد الواحد)؛ نظام التردد المنخفض ويمكن إهماله إذا كان ليس من الضروري الحد من قياس الوقت-
    3. أداء قصيرة واكتساح.
    4. أداء γ-اكتساح (مثلاً، f = 1 هرتز؛ γ = 0.0125% إلى 100%؛ نقاط البيانات 20 في العقد الواحد)-
      ملاحظة: استخدم قصيرة واكتساح أولاً، كما أنها لا تتفق عادة مع السابقة والاحتلالات لأن الشبكات عادة تمزق أثناء الاجتياح γ أو فصل من اللوحات. بدلاً من ذلك، استخدام منحنى γ (مثلاً = 0.025 s -1, t = 60 s)؛ ومع ذلك، عادة ما تتطلب السلالم تغيير وضع السيارات، وحتى اللاحقة قصيرة وسوف تكون مزورة الاحتلالات.
  8. بن و/أو سلسة البيانات الخام مع نواة ضبابي.

3-ساعدت fluorescence "تحليل للحمض النووي الصلب"

  1. مختبرين 8 إعداد من 12 ميليلتر لكل عينة باستخدام 1-4 ميكرون الحمض النووي كل حبلا و 12.5 مم مجكل 2 في 1 × المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات و 1 س جل الحمض النووي وصمة عار من س 10,000 [دمس] الأسهم. جعل عنصر تحكم سلبية مع لا الحمض النووي، ولكنها تشمل وصمة عار جل الحمض النووي-
  2. نقل مختبرين لصفيحة PCR الوقت الحقيقي وختم مع الفيلم لاصقة (مثل، لوحة رد 96-جيدا)-
    ملاحظة: سوف تتبخر درجات الحرارة العالية المستخدمة في الحرارية الصلب البروتوكولات العينات. وبالتالي، تأكد من أن الآبار هي مختومة محكم مع الفيلم لاصقة للحيلولة دون زيادة التبخر وتركيز المياه، لا سيما خلال التجارب الطويلة الأجل-
  3. الطرد المركزي اللوحة في 100 غ س ل 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لإزالة فقاعات الغاز؛ وإذا كان توسيع فقاعات الغاز، لا يمكن تحليل الآبار.
  4. تحميل لوحة مختومة إلى نظام PCR كمي في الوقت الحقيقي-
  5. تشغيل برنامج انلينغ. تؤذي الحمض النووي عند 90 درجة مئوية للحد الأدنى 10 انخفاض درجة الحرارة بسرعة إلى 72 درجة مئوية. ثم تنخفض درجة الحرارة ببطء من 0.5 درجة مئوية كل 30 دقيقة. بعد الإشارة التهاوي، التعجيل بمنحنى درجة الحرارة-
    ملاحظة: بما فيه الكفاية 72 درجة مئوية أعلى درجة حرارة التهجين الحقيقية؛ وهكذا، يتم تسجيل الإشارات عبر نطاق واسع من درجات حرارة مناسبة لتحديد نطاق درجة الحرارة اللازمة.
  6. تأكد من أن غطاء cycler ارتفاع درجات الحرارة إلى مالا يقل عن 100 درجة مئوية لمنع التكثيف من تبخر العينة على الفيلم لاصقة.
  7. خلال الجمعية، تثير هذه العينات مع ليزر أيون أرجون في 488 نانومتر والكشف عن الأسفار في 550 نيوتن متر عند استخدام وصمة عار جل حمض النووي (أو طيفيا مماثلة). لسائر الأصباغ، اختر مجموعة إثارة/انبعاثات مناسبة. قياس الإشارات fluorescence قدر الإمكان لزيادة الإجمالي جودة الإشارة باستخدام الكاميرا المدمجة.
    ملاحظة: هنا، تم أخذ قياسات كل 9 س.
  8. إذا طبقت ذوبان مسبقاً والصلب البرامج، استخدام البرامج المتوفرة لتحليل البيانات. إذا لم يكن كذلك، طرح القيمة الوسطية السابقة من القيمة الوسطية لكل خطوة درجة الحرارة للحصول على التغير النسبي لإشارة الفلورسنت.

4. فؤاد التصوير

  1. تنشق ميكا (مثلاً، ميكا " V1 ") بإرفاق شريط لاصق المتاحة تجارياً وتمزيق ذلك؛ وينبغي إزالة الطبقة العلوية من ميكا.
  2. ميكروبيبيتي، باستخدام إيداع سابق التشكيل ن HT بملغ 2 + الذي يحتوي على المخزن المؤقت للطي على ميكا ملصوق طازجة والسماح لها بتسوية للحد الأدنى 10
  3. تدور العينات في فترات قصيرة 3-s في 2,000 س ز على طاولة صغيرة للطرد مركزي لإزالة السائل المتبقية. لا يزال ينبغي أن ترفق عدة ن HTs السطح ميكا.
  4. استخدام تلميح ناتئ مع صلابة عالية (مثلاً، 54 نانومتر -1)، وتحديد ما تردد صدى مع البرنامج فؤاد الداخلية-
  5. سجل التشكيل الجانبي الارتفاع مع فؤاد في الهواء في التنصت على وضع أسعار منخفضة المسح الضوئي (مثلاً، 1 خط/s) لتجنب إلحاق الضرر بها أو تشريد ن HTs.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

الجمعية العامة للأنابيب النانوية الحمض النووي عن طريق منحدر درجة حرارة (الشكل 2) وسيلة موثوق بها للغاية لتشكيل هذه البوليمرات سيميفليكسيبلي الاصطناعية. هذه البوليمرات لها خصائص مماثلة لنظيراتها التي تحدث بشكل طبيعي، مثل خيوط الأكتين، ولكنها توفر إطارا تجريبية أوسع بكثير نظراً لخواصها الميكانيكية يمكن أن كنترولبلي غيرت9،27 . مثل البوليمرات البيولوجية، أنها يمكن ترتيبها في الشبكات (...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

للحصول على الشبكات بشكل صحيح المشكلة، تجميع الأنابيب النانوية الحمض النووي خطوة حاسمة. الأخطاء التي تحدث أثناء عملية التوليف تأثيراً سلبيا على نوعية الأنبوبة؛ لذلك، من المستحسن أن يستخدم [هبلك] أو عملية أكثر صرامة لتنقية النوكليوتيد. منذ تشكيل منفصلة بدلاً من تجميع الأنابيب النانوية الحمض النووي، فضلا عن توزيعها طول، يعتمد على ستويتشيوميتري اكويمولار من النوكليوتيد ن التأسيسية ضمن المجموعة، من الضروري أن يستحسن تركيزات من الخيوط التي تم شراؤها، منذ نظراً للقيم يمكن أن تختلف إلى حد كبير من تركيز الفعلية. وهذا يمك...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

نعترف بالتمويل عن طريق DFG (1116/17-1) ومدرسة لايبزيغ للعلوم الطبيعية "بويلدمونا" (GSC 185). تم دعم هذا العمل من خلال مشروع اجتذاب فراونهوفر 601 683. ت. ﻫ. تعترف بتمويل من "الصندوق الاجتماعي الأوروبي" (كلية العلوم التربوية-100077106).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
AFM الكابولي ACTAAppNano
AFM - NanoWizard 3JPK Instruments
كاميرا CCDAndoriXon DV887
DMSOSigma-AldrichD2650
قليل النوكليوتيدات Biomers.netللحصول على تسلسلات انظر الجدول 1
النوكليوتيدات المسماة DNA Cy3Biomers.netللتسلسل ، انظر الجدول 1
EDTASigma-AldrichE-9884
Epi-fluorescence micro-scopeLeicaDM-IRB
MgCl2< / sub>Sigma-AldrichM-8266
Mica "V1" ، 12 مم دائريPlano GmbH50-12
MicroAmp & reg; لوحة تفاعل بصرية سريعة 96 بئرThermo Fisher Scientific Inc.4346907
Microamp® فيلم لاصق بصريThermo Fisher Scientific Inc.4306311
NanoDrop 1000 مقياس الطيفالضوئي Thermo Fisher Scientific Inc.
100x موضوعيLeica5506168
المياه النقيةMerk Millipore - Milli-Q & amp أنابيب Elix
Sapphire PCRGreiner Bio-One683271
TProfessional Standard PCR ThermocyclerCore Life Sciences Inc.070- معيار
7900HT نظام PCR سريع في الوقت الحقيقيللأنظمة الحيوية التطبيقية4351405
مقياس الريومترTA InstrumentsARES
SYBR & reg ؛ جرين I هلام الحمض النووي وصمة عارThermo Fisher Scientific Inc.S7567
تريسسيجما ألدريتشT4661
تريتون X-100سيجما ألدريتشX-100يمنع تبخر العينة في واجهة الهواء والماء
قليل

المراجع

  1. Huber, F., et al. Emergent complexity of the cytoskeleton: from single filaments to tissue. Adv Phys. 62 (1), 1-112 (2013).
  2. Kratky, O., Porod, G. Röntgenuntersuchung gelöster Fadenmoleküle. Recl Trav Chim Pays-Bas. 68 (12), 1106-1122 (1949).
  3. Saitô, N., Takahashi, K., Yunoki, Y. The Statistical Mechanical Theory of Stiff Chains. J Phys Soc Jpn. 22 (1), 219-226 (1967).
  4. Doi, M., Edwards, S. F. The Theory of Polymer Dynamics. , Oxford University Press. Oxford, UK. (1986).
  5. Mueller, O., Gaub, H. E., Baermann, M., Sackmann, E. Viscoelastic moduli of sterically and chemically cross-linked actin networks in the dilute to semidilute regime: measurements by oscillating disk rheometer. Macromolecules. 24 (11), 3111-3120 (1991).
  6. MacKintosh, F. C., Käs, J., Janmey, P. A. Elasticity of semiflexible biopolymer networks. Phys Rev Lett. 75 (24), 4425-4428 (1995).
  7. Gardel, M. L. Elastic Behavior of Cross-Linked and Bundled Actin Networks. Science. 304 (5675), 1301-1305 (2004).
  8. Sonn-Segev, A., Bernheim-Groswasser, A., Diamant, H., Roichman, Y. Viscoelastic Response of a Complex Fluid at Intermediate Distances. Phys Rev Lett. 112 (8), (2014).
  9. Schuldt, C., et al. Tuning Synthetic Semiflexible Networks by Bending Stiffness. Phys Rev Lett. 117 (19), (2016).
  10. Käs, J., et al. F-actin, a model polymer for semiflexible chains in dilute, semidilute, and liquid crystalline solutions. Biophys J. 70 (2), 609-625 (1996).
  11. Ross-Murphy, S. B. Structure-property relationships in food biopolymer gels and solutions. J Rheol. 39 (6), 1451-1463 (1995).
  12. Fletcher, D. A., Mullins, R. D. Cell mechanics and the cytoskeleton. Nature. 463 (7280), 485-492 (2010).
  13. Hinner, B., Tempel, M., Sackmann, E., Kroy, K., Frey, E. Entanglement, Elasticity, and Viscous Relaxation of Actin Solutions. Phys Rev Lett. 81 (12), 2614-2617 (1998).
  14. Palmer, A., Mason, T. G., Xu, J., Kuo, S. C., Wirtz, D. Diffusing Wave Spectroscopy Microrheology of Actin Filament Networks. Biophys J. 76 (2), 1063-1071 (1999).
  15. Gardel, M. L., Valentine, M. T., Crocker, J. C., Bausch, A. R., Weitz, D. A. Microrheology of Entangled F-Actin Solutions. Phys Rev Lett. 91 (15), (2003).
  16. Liu, J., et al. Microrheology Probes Length Scale Dependent Rheology. Phys Rev Lett. 96 (11), (2006).
  17. Golde, T., Schuldt, C., Schnauß, J., Strehle, D., Glaser, M., Käs, J. Fluorescent beads disintegrate actin networks. Phys Rev E. 88 (4), (2013).
  18. Isambert, H., Maggs, A. C. Dynamics and Rheology of Actin Solutions. Macromolecules. 29 (3), 1036-1040 (1996).
  19. Käs, J., Strey, H., Sackmann, E. Direct imaging of reptation for semiflexible actin filaments. Nature. 368 (6468), 226-229 (1994).
  20. Schmidt, C. F., Baermann, M., Isenberg, G., Sackmann, E. Chain dynamics, mesh size, and diffusive transport in networks of polymerized actin: a quasielastic light scattering and microfluorescence study. Macromolecules. 22 (9), 3638-3649 (1989).
  21. Kroy, K., Frey, E. Force-Extension Relation and Plateau Modulus for Wormlike Chains. Phys Rev Lett. 77 (2), 306-309 (1996).
  22. Morse, D. C. Tube diameter in tightly entangled solutions of semiflexible polymers. Phys Rev E. 63 (3), (2001).
  23. Broedersz, C. P., MacKintosh, F. C. Modeling semiflexible polymer networks. Rev Mod Phys. 86 (3), 995-1036 (2014).
  24. Tassieri, M., Evans, R. M. L., Barbu-Tudoran, L., Khaname, G. N., Trinick, J., Waigh, T. A. Dynamics of Semiflexible Polymer Solutions in the Highly Entangled Regime. Phys Rev Lett. 101 (19), (2008).
  25. Hinsch, H., Frey, E. Non-Affine Shear Modulus in Entangled Networks of Semiflexible Polymers. arXiv:0907.1875[cond-mat]. , Available from: https://arxiv.org/abs/0907.1875 (2009).
  26. Yin, P., et al. Programming DNA Tube Circumferences. Science. 321 (5890), 824-826 (2008).
  27. Glaser, M., et al. Self-assembly of hierarchically ordered structures in DNA nanotube systems. New J Phys. 18 (5), 055001(2016).
  28. Schiffels, D., Liedl, T., Fygenson, D. K. Nanoscale Structure and Microscale Stiffness of DNA Nanotubes. ACS Nano. 7 (8), 6700-6710 (2013).
  29. Hariadi, R. F., Yurke, B., Winfree, E. Thermodynamics and kinetics of DNA nanotube polymerization from single-filament measurements. Chem Sci. 6 (4), 2252-2267 (2015).
  30. de Gennes, P. G. Reptation of a Polymer Chain in the Presence of Fixed Obstacles. J Chem Phys. 55 (2), 572-579 (1971).
  31. Huss, V. A. R., Festl, H., Schleifer, K. H. Studies on the spectrophotometric determination of DNA hybridization from renaturation rates. Syst Appl Microbio. 4 (2), 184-192 (1983).
  32. Breslauer, K. J., Frank, R., Blöcker, H., Marky, L. A. Predicting DNA duplex stability from the base sequence. Proc Natl Acad Sci U S A. 83 (11), 3746-3750 (1986).
  33. You, Y., Tataurov, A. V., Owczarzy, R. Measuring thermodynamic details of DNA hybridization using fluorescence. Biopolymers. 95 (7), 472-486 (2011).
  34. Zipper, H. Investigations on DNA intercalation and surface binding by SYBR Green I, its structure determination and methodological implications. Nucleic Acids Res. 32 (12), e103-e103 (2004).
  35. Sobczak, J. -P. J., Martin, T. G., Gerling, T., Dietz, H. Rapid Folding of DNA into Nanoscale Shapes at Constant Temperature. Science. 338 (6113), 1458-1461 (2012).
  36. Snodin, B. E. K., Romano, F., Rovigatti, L., Ouldridge, T. E., Louis, A. A., Doye, J. P. K. Direct Simulation of the Self-Assembly of a Small DNA Origami. ACS Nano. 10 (2), 1724-1737 (2016).
  37. Das, R. K., Gocheva, V., Hammink, R., Zouani, O. F., Rowan, A. E. Stress-stiffening-mediated stem-cell commitment switch in soft responsive hydrogels. Nat Mater. 15 (3), 318-325 (2015).
  38. Sharma, A., et al. Strain-controlled criticality governs the nonlinear mechanics of fibre networks. Nat Phys. 12 (6), 584-587 (2016).
  39. Lieleg, O., Claessens, M. M. A. E., Bausch, A. R. Structure and dynamics of cross-linked actin networks. Soft Matter. 6 (2), 218-225 (2010).
  40. Claessens, M. M. A. E., Semmrich, C., Ramos, L., Bausch, A. R. Helical twist controls the thickness of F-actin bundles. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (26), 8819-8822 (2008).
  41. Claessens, M. M. A. E., Bathe, M., Frey, E., Bausch, A. R. Actin-binding proteins sensitively mediate F-actin bundle stiffness. Nat Mater. 5 (9), 748-753 (2006).
  42. Schnauß, J., Händler, T., Käs, J. Semiflexible Biopolymers in Bundled Arrangements. Polymers. 8 (8), 274(2016).
  43. Heussinger, C., Schüller, F., Frey, E. Statics and dynamics of the wormlike bundle model. Phys Rev E. 81 (2), (2010).
  44. Schnauß, J., et al. Transition from a Linear to a Harmonic Potential in Collective Dynamics of a Multifilament Actin Bundle. Phys Rev Lett. 116 (10), (2016).
  45. Strehle, D., et al. Transiently crosslinked F-actin bundles. Eur Biophys J. 40 (1), 93-101 (2011).
  46. Backouche, F., Haviv, L., Groswasser, D., Bernheim-Groswasser, A. Active gels: dynamics of patterning and self-organization. Phys Biol. 3 (4), 264-273 (2006).
  47. Surrey, T. Physical Properties Determining Self-Organization of Motors and Microtubules. Science. 292 (5519), 1167-1171 (2001).
  48. Nedelec, F. J., Surrey, T., Maggs, A. C., Leibler, S. Self-organization of microtubules and motors. Nature. 389 (6648), 305-308 (1997).
  49. Smith, D., et al. Molecular Motor-Induced Instabilities and Cross Linkers Determine Biopolymer Organization. Biophys J. 93 (12), 4445-4452 (2007).
  50. Huber, F., Strehle, D., Schnauß, J., Käs, J. Formation of regularly spaced networks as a general feature of actin bundle condensation by entropic forces. New J Phys. 17 (4), 043029(2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة