يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

زرع شوان الخلايا داخل قنوات PVDF-ترف سد الفئران بحف الحبل الشوكي جذوعها لتعزيز التجديد إكسون عبر الفجوة

6.7K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/56077

⸱

نوفمبر 3, 2017

 ,  ,  , 
1The Miami Project to Cure Paralysis, University of Miami Miller School of Medicine, 2Department of Materials Science and Engineering, New Jersey Institute of Technology, 3Department of Biomedical Engineering, New Jersey Institute of Technology, 4Department of Cell Biology, University of Miami Miller School of Medicine, 5Department of Neurological Surgery, University of Miami Miller School of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

توضح هذه المقالة تقنية لإدراج قناة جوفاء بين جذوعها الحبل الشوكي بعد ترانسيكتيون كاملة والتعبئة مع خلايا شوان (SCs) ومصفوفة الغشاء القابلة للحقن من أجل سد وتشجيع التجديد إكسون عبر الفجوة.

الملخص

بين النماذج المختلفة لإصابات النخاع الشوكي في الفئران، ومعظم الأحيان يستخدم نموذج كدمة لأنه هو النوع الأكثر شيوعاً لإصابة الحبل الشوكي البشرية. نموذج ترانسيكشن كاملة، على الرغم من أن الصلة لا سريرياً كنموذج كدمة، هو الأسلوب الأكثر صرامة لتقييم التجدد إكسون. في نموذج كدمة، من الصعب تمييز المجددة من محاور عصبية ظهرت أو إخباري بسبب وجود المتبقية الأنسجة بعد الإصابة. في طراز ترانسيكشن كاملة، أسلوب الجسور اللازمة سد هذه الفجوة وإنشاء الاستمرارية من روسترال إلى جذوعها والذيلية لتقييم مدى فعالية العلاجات. عملية جراحية يمكن الاعتماد عليها في سد ضروري لاختبار مقاييس النتائج عن طريق الحد من التفاوت بسبب الطريقة الجراحية. وتستخدم البروتوكولات المذكورة هنا لإعداد شوان الخلايا (SCs) وقنوات قبل الزرع، ترانسيكشن كاملة في النخاع الشوكي على مستوى الصدر 8 (T8)، إدراج القناة، وزرع المنبوذة في القناة. ويستخدم هذا النهج أيضا في الموقع التبلور لمصفوفة الغشاء عن طريق الحقن مع زرع اتفاقية استكهولم أن يسمح النمو إكسون محسنة عبر واجهات روسترال ووالذيليه مع أنسجة المضيف.

المقدمة

إصلاح إصابات النخاع الشوكي هو مشكلة معقدة وصعبة تتطلب استراتيجية علاج التوافقي تشمل، على سبيل المثال، استخدام الخلايا ومادة بيولوجية لتوفير المكروية مواتية لوظيفة الخلايا المزروعة ومحور عصبي التجديد في الموقع الإصابة. هيميسيكشن1،2،3،4،5،،من67،،من89 وكامل ترانسيكشن10 ،11،،من1213،14،15،16،،من1718،19 20، ،،من2122 نماذج تستخدم بشكل متكرر لتقييم آثار العلاجات الجسور على أساس مادة بيولوجية. الاستفادة من استخدام نموذج هيميسيكشن أنه يوفر المزيد من الاستقرار لبناء الجسور بالمقارنة مع ترانسيكشن كاملة. ومع ذلك، في نماذج هيميسيكشن، وأنه يصعب إثبات التجدد إكسون كنتيجة للأسلوب العلاجي التطبيقية بسبب الوجود أنسجة إخباري. الطراز ترانسيكتيون كاملة هو الأسلوب الأكثر صرامة لإثبات إكسون التجدد.

تمت دراسة مختلف المواد الطبيعية والاصطناعية للاستخدام كجل القابلة لحقن، وهلام شكلت قبل وضعها في كدمة أو نماذج هيميسيكتيون، أو كقناة منظم في هيميسيكتيون أو إكمال نماذج ترانسيكتيون (مفصلة في ملاحظات23 , 24 , 25)-التبلور في عين المكان لأن خليط الحقن مصفوفة/SC ينشئ واجهة أكثر تساهﻻ بين الزرع والحبل المضيف لعبور إكسون26،27 مقارنة بزراعة ما قبل تبلور مصفوفة/SC 5 , 18 , 19 , 28- في الموقع التبلور يسمح المصفوفة كفاف حول الواجهات المضيف غير النظامية بينما قناة أكثر جمودا ومنظم أو هلام شكلت قبل أقل تعمل لا يمكن. غالباً ما توفر قناة منظم الاستقرار التوجيه وزرع الاتصال على عكس مصفوفة عن طريق حقن. البروتوكولات المقدمة هنا وصف إجراء العمليات جراحية التي يستفيد من مصفوفة غشاء عن طريق حقن (مثلاً، ماتريجيل، انظر الجدول للمواد المشار إليها كمصفوفة الحقن هنا) وقناة منظم إلى تقييم التجدد إكسون في نموذج إصابة الحبل الشوكي الأكثر صرامة.

اليكتروسبون بولي-فينيليدينيديفلوريدي-تريفلوروثيليني (PVDF-ترف) تستخدم قنوات أجوف الليفي المنحازة في نهجنا التجريبية. PVDF-ترف هو بوليمر كهرضغطية يولد شحنة عابرة عندما ميكانيكيا مشوه وقد ثبت أن تعزيز تجديد التمديد ومحور عصبي نورت في المختبر29،30 و في فيفو 31-اليكتروسبينينج هو أسلوب تصنيع سقالة مشتركة التي يمكن أن تنتج سرعة السقالات الليفي موثوق بها باستخدام مجموعة متنوعة من البوليمرات مع خصائص يمكن السيطرة عليها مثل محاذاة الألياف والألياف القطر، وسمك السقالة ل العصبية وغيرها من التطبيقات32،،من3334.

وقد أثبتت دراسات عديدة من الفئران المنبوذة التي زرعها في مواقع إصابات النخاع الشوكي العلاج فعالية5،9،،من1819،20،21 ،26. يتم زرع هذه محصن للأنسجة المحيطة بالآفة وتقليل حجم تجويف الآفة وتعزيز التجدد إكسون في موقع الآفة/زرع وميليناتيون من محاور عصبية المجددة. يمكن زرعها المنبوذة البشرية أوتولوجوسلي، وميزة مقارنة بمعظم الأخرى العصبية المتصلة الخلايا24. بعد خزعة الأعصاب المحيطية، يمكن عزل الطوائف المنبوذة وتنقيته وسوف تنتشر على المبلغ المطلوب لزرعها في البشر. زرع SC ذاتي لمرضى إصابة الحبل الشوكي وقد ثبت أن تكون آمنة في إيران35،36،،من3738،39،الصين40، 41،الولايات المتحدة42. تعرف الطوائف المنبوذة لإفراز العديد من عوامل نيوروتروفيك والمصفوفة خارج الخلية البروتينات الهامة لنمو إكسون وتلعب دوراً أساسيا في تجديد إكسون بعد إصابة الأعصاب المحيطية. أن هدفنا هنا هو لوصف الأساليب التي يمكن التحقيق في التصاميم ممرا لتحسين نتائج زرع اتفاقية استكهولم في نموذج ترانسيكشن حبل الشوكي الفئران كاملة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

يتم إيواء الإناث الكبار فيشر الفئران (180-200 غ وزن الجسم) وفقا للمبادئ التوجيهية للمعاهد الوطنية للصحة ووزارة الزراعة. "العناية بالحيوان" واستخدام اللجنة (إياكوك) من جامعة ميامي المؤسسية وافق جميع الإجراءات الحيوان.

1-"إعداد" ما قبل الزرع

  1. إعداد قناة. قطع
    1. ممرا إلى 5 ملم في الطول باستخدام شفرة #10 تحت مجهر تشريح.
      ملاحظة: القطر الداخلي للقناة ما بين 2.4-2.7 مم؛ القطر الخارجي ما بين 2.5-2.8 م.
    2. أمثال قناة بلطف على طول الجانب الطولي ( الشكل 1A). قص أربعة شقوق صغيرة عن 0.4 مم طويل ومالا يقل عن 1 مم من الفتحات لقناة وحوالي 1 ملم عن بعضها البعض باستخدام حافة مستقيمة Vannas المقص ( الشكل 1B).
      1. تتكشف القناة ( الشكل 1)، وقطع بين شقوق اثنين على طول الجانب نفسه إنشاء إطارين جنبا إلى جنب ( الشكل 1). التأكد من أن windows يمكن فتحها وإغلاقها بشكل صحيح على طول الجانب غير المصقول.
    3. تعقيم القنوات في الإيثانول 75% لمدة 25 دقيقة في طبق بتري 10 سم. شطف قنوات مرة واحدة لمدة دقيقة 4 مع 1 × الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) ونقل القنوات مع الملقط العقيمة إلى طبق بتري 10 سم جديدة. شطف قنوات مرتين مع 1 x برنامج تلفزيوني لمدة 25 دقيقة.
      4. تخزين
    4. في القنوات في برنامج تلفزيوني 1 x حتى جراحة.
      ملاحظة: يمكن تعقيم قنوات كثيرة في وقت واحد. تخزين القنوات في أنابيب الطرد المركزي منفصلة معقم 1.5 مل لإبقائهم العقيمة.
  2. أخضر نيون البروتين (التجارة والنقل)-إعداد خلية شوان (SC)
    1. إعداد الثقافات SC المنقي من أعصاب الكبار فيشر الإناث الدانية الفئران كما هو موضح سابقا 43. عند الانتهاء من هذه الخطوة، لوحة المنبوذة في بولي-L-يسين (PLL)-مغلفة بأطباق بيتري 10 سم والحفاظ عليها في المتوسط D10/3 م؛ يتم تعريف هذه الطوائف المنبوذة كمرور 0-
      ملاحظة: D10/3 م المتوسطة يتكون من ما يلي: 10% الجنيني البقري المصل (FBS)، 1% البنسلين-ستربتوميسين (القلم/بكتيريا)، 20 ميكروغرام/مل النخامية استخراج، 2 ميكرومتر فورسكولين، 2.5 نانومتر هيريجولين في دولبيكو ' s تعديل النسر ' s المتوسطة (دميم)-
    2. تغذية مع الطازجة D10/3 م المتوسطة (7 مل/10-سم طبق بيتري) كل 3 إلى 4 أيام-
    3. SC انقسام الثقافة بمجرد أن تصل إلى التقاء 70-80%.
      1. إزالة المتوسطة والشطف مرتين مع هانك ' s متوازنة الحل الملح (حبس) دون الكالسيوم أو المغنيسيوم.
      2. إضافة 5 مل من 0.25% التربسين/أدتا إلى كل طبق بيتري 10 سم، واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).
      3. إضافة 5 مل من D10 المتوسطة (10% FBS و 1% القلم/بكتيريا في دميم) في أنبوب 50 مل الطرد مركزي لتحييد التربسين.
        4. الحل
      4. بلطف بيبيت التربسين/أدتا إلى بيتري الطبق عدة مرات لفصل الطوائف المنبوذة. إزالة تعليق خلية من الطبق ووضعه في أنبوب الطرد المركزي إعدادها في الخطوة السابقة. شطف الطبق مع 5 مل متوسطة D10 ووضعه في أنبوب الطرد المركزي إلى أقصى حد الخلية الحصاد.
      5. الطرد المركزي الخلايا في 370 x ز لمدة 5 دقائق في 4 س جيم إزالة المادة طافية وريسوسبيند الخلايا في المتوسط D10/3 م 4 مل لكل انقسام طبق بيتري.
      6. الاستغناء عن 1 مل من تعليق اتفاقية استكهولم و 6 مل من المتوسطة D10/3 م إلى طبق بتري 10 سم؛ وسيؤدي إلى انقسام طبق بيتري كل 4 أطباق بيتري. يتم تعريف هذه الطوائف المنبوذة كمرور 1-
      7. ريبلينيش مع الطازجة D10/3 م المتوسطة اليوم بعد الطلاء وكل 3-4 أيام بعد الطلاء.
      8. مرة واحدة الطوائف المنبوذة التوصل إلى التقاء 70-80%، كرر الخطوات 1.2.3.1 إلى 1.2.3.6. المنبوذة الآن في مرور 2-
    4. ترانسدوسي المنبوذة مجرد التوصل إلى التقاء 50%، مع ناقل لينتيفيرال ترميز بروتينات فلورية خضراء في D10/3 م المتوسطة بين عشية وضحاها في عدد وافر عدوى 30 كما تم وصفه سابقا 44 ، 45 .
    5. تغذية مع الطازجة D10/3 م المتوسطة في اليوم التالي وكل 3-4 أيام بعد الطلاء.
      6. كرر الخطوات من 1.2.3.1 إلى 1.2.3.5
    6. مجرد بروتينات فلورية خضراء-الطوائف المنبوذة التوصل إلى التقاء 70-80%، لكن ريسوسبيند بروتينات فلورية خضراء-الطوائف المنبوذة في 6 مل متوسطة D10 بدلاً من ذلك. الاستغناء عن 15 ميليلتر من تعليق بروتينات فلورية خضراء-اتفاقية استكهولم في أنبوب الطرد مركزي 1.5 مل وإضافة 15 ميليلتر من محلول تريبان الأزرق 0.4%. نفض الغبار على أنبوب الطرد المركزي بلطف والاستغناء عن 10 ميليلتر من المخلوط إلى غرفة للشريحة خلية العد.
      1. مكان الانزلاق إلى عداد الآلي خلية وتحديد كثافة الخلية.
    7. الطرد المركزي الخلايا في 370 x ز لمدة 5 دقائق في 4 س جيم إزالة المادة طافية، ريسوسبيند مع 1.5 مل من تجميد المتوسطة لكل 3 × 10 6 بروتينات فلورية خضراء-المنبوذة. Dispense 1.5 مل تعليق بروتينات فلورية خضراء-اتفاقية استكهولم إلى القنينة المبردة، والتجميد في-80 س ج لمالا يقل عن 24 ساعة قبل أن ينتقل إلى النتروجين السائل للتخزين.
      ملاحظة: تجميد المتوسطة: 25% FBS و 8% ثنائي ميثيل سلفوكسيد في دميم.
    8. "ذوبان الجليد" بروتينات فلورية خضراء-المنبوذة قبل الجراحة بأسبوع واحد.
      1. إضافة 10 مل D10 المتوسطة في أنبوب الطرد مركزي 50 مل.
      2. ذوبان الجليد قنينة من بروتينات فلورية خضراء مجمدة-الطوائف المنبوذة في حوض ماء في 37 س ج حتى جزئيا مذاب.
        3. إزالة تعليق بروتينات فلورية خضراء-اتفاقية استكهولم من القنينة المبردة
      3. ووضعه في أنبوب الطرد المركزي 50 مل أعد في 1.2.8.1. بلطف بيبيت الحل أعلى وأسفل مرارا وتكرارا-
      4. الطرد المركزي الخلايا في 370 x ز لمدة 5 دقائق في 4 س جيم إزالة المادة طافية وريسوسبيند الخلايا في المتوسط D10/3 م 4 مل لكل قنينة مذاب.
      5. الاستغناء عن 2 مل من تعليق بروتينات فلورية خضراء-SC و 5 مل من المتوسطة D10/3 م إلى طبق بتري 10 سم؛ وينبغي أن يؤدي كل قنينة 2 بيتري الأطباق. بروتينات فلورية خضراء-الطوائف المنبوذة تم تعريفها كمرور 3-
        ملاحظة: طبق بيتري 10 سم عادة غلات حوالي 8 × 10 6 بروتينات فلورية خضراء-اللجان الدائمة بعد أسبوع واحد-
    9. في اليوم لعملية جراحية، كرر الخطوة 1.2.6. استخدام كثافة الخلايا المحسوبة في الخطوة 1.2.10-
      10. أنابيب
    10. مختبرين Dispense 3 × 10 6 بروتينات فلورية خضراء-الطوائف المنبوذة في أجهزة الطرد المركزي معقم 1.5 مل استناداً إلى كثافة الخلية المحسوبة من الخطوة 1.2.9. الطرد المركزي مختبرين بروتينات فلورية خضراء-اتفاقية استكهولم في 370 x ز لمدة 5 دقائق في 4 س ج وإزالة المادة طافية. إضافة 1 مل متوسطة DMEM/F12 لكل قاسمة وأجهزة الطرد المركزي في 370 x غ.
      ملاحظة: كل الحيوان يتلقى بروتينات فلورية خضراء 3 × 10 6-يستخدم المنبوذة. المتوسطة مع المصل مع بروتينات فلورية خضراء-المنبوذة حتى هذه الخطوة.
    11. بروتينات فلورية خضراء-المنبوذة الحفاظ على الجليد حتى وقت الزرع.

2. إكمال ترانسيكتيون في الصدر المستوى 8 (T8)

  1. إعداد الحيوانات لجراحة
    1. أنيسثيتيزي فيشر الإناث الفئران (180-200 غ) مع حقن داخل الكيتامين (60 مغ/كغ من وزن الجسم) وإكسيلازيني (5 مغ/كغ من وزن الجسم). رصد عمق التخدير قبل المتابعة إلى الخطوة التالية عن طريق التحقق من أخمص القدمين معسر والعين الردود وامض.
    2. الجزء الخلفي الفئران مع ماكينة كهربائية للحلاقة ومسح الجلد مع الإيثانول 70%. تطبيق مواد التشحيم العيون لكلتا العينين. نقل الحيوان إلى طاولة الجراحة على وسادة تدفئة للحفاظ على درجة حرارة الجسم في حوالي 37 س جيم مكان الحيوان على لفة حتى الفقرات سهلة الوصول.
      ملاحظة: يمكن إجراء لفة من منشفة ورقية أو 2 في x2 في شاش أنه يمكن تعقيمها. ينصح لفات أكبر عندما يحتاج T7-T9 تزرع شقة أعلى لفة.
  2. T7 للصفيحة T9
    1. تحديد موقع التاريخي للعمليات الشائكة T9-T11.
      ملاحظة: الفجوات بين T9 T10 و T11 صغيرة بالمقارنة مع قطاعات أخرى وأناn المنطقة. بعد وضع الفئران في لفة، T9-T11 الشائكة العمليات سوف يشعر وكأنه عثرة ثلاثي صغيرة عن طريق الجلد.
    2. جعل شق خط الوسط 4 إلى 5 سم من الجلد باستخدام شفرة #10 من T4 إلى T11. إجراء شق صغير في طبقة الدهون السطحية مع مقص منحنى مع نهايات حادة تفتيت الدهون.
      ملاحظة: يمكن استخدام أنواع أخرى من الصكوك لفصل الدهون ولكن مقص منحنى مع نهايات حادة تمكين الأسلوب الأكثر فعالية والأقل الغازية لفصل الدهون.
    3. تحديد موقع T7 T9 الشائكة العمليات باستخدام الجزء الخلفي الشفرة #10. عقد العضلات في حول T4 مع الملقط حادة وجعل شق العضلة على طول كل جانب من الفقرات من T6-T10. جعل الخفض قريبة من فقرات ممكن لجعل افتتاح نظيفة ويسبب الضرر الحد الأدنى للحيوان.
    4. عزل كل الفردية الشائكة العملية من T7 T9 بقطع العضلات والأربطة بين T6 و T7 T7 و T8 T8 T9، و T9 T10 مع شفرة #10-
      5. استخدم
    5. رونجيور لإزالة أي العضلات والأربطة في عن من T7 إلى T9. إزالة العضلات والأربطة جانبياً ممكن حتى الفجوات بين عمليات عرضية من T7 إلى T9 مرئية.
    6. إزالة العملية الشائكة T9 مع رونجيور. تعقد هذه العملية الشائكة T8 مع الملقط حادة ورفع بلطف رفع الصفيحة T9 في فتحه صغيرة بين عمليتي T9 T10-
    7. إزالة الصفيحة بدءاً من فتح وتحريك روسترالي مع رونجيور في T9. إزالة الصفيحة أفقياً بقدر الإمكان؛ الجذور الظهرية يجب أن تكون مرئية بعد الصفيحة.
    8. بمجرد إزالة الصفيحة، كرر العملية ل T8 و T7.
      ملاحظة: أثناء الاستئصال، استخدم سبيرز الاستيعاب لإزالة الدم مع مواصلة الصفيحة. في حالة حدوث نزيف الزائدة، ضع الأسفنج مضغوط في موقع النزيف وإضافة المحلول الملحي للمساعدة في تخثر الدم.
  3. ترانسيكشن في T8
    1. مكان ضام حول T7 إلى T9. حالما تتم إزالة كافة عن، تأكد من أن الفجوات بين عمليات عرضية مرئية، لا سيما في T8. كما فحص العظام على طول جانبي بين T7 إلى T9 ضمان لا توجد أية شظايا العظام بارزة إلى الخارج-
      ملاحظة: هذه الفجوة في T8 مهم لأداء ترانسيكشن كاملة. يجب إزالة فقرات على الطول للإدراج ممرا أسهل.
      2. قطع
    2. في الظهرية وجذور ventral أعلاه وأدناه باستخدام T8 الزاوية مقص الربيع. إضافة المحلول الملحي للحبل الشوكي والانتظار للدم إلى جلطة.
      ملاحظة: هذه الخطوة مهمة للإدراج السليم قناة.
      3. ضع المقص ربيع الزاوية أعلاه الحبل الشوكي في الفجوات بين عمليات عرضية في T8
    3. وجعل قطع واحدة تماما قطع الحبل الشوكي. ضع قطعة صغيرة من الرغوة مضغوط إلى 2-2.5 ملم الفجوة الناتجة عن ذلك وإضافة المحلول الملحي إلى المنطقة فورا.

3. الإدراج قناة

  1. أثناء انتظار جذوعها قطع الحبل للوصول إلى الأرقاء، إخراج قناة من برنامج تلفزيوني 1 x. قطع مثلثات الاستيعاب إلى قطع طويلة رقيقة ووضعها في قناة لإزالة الزائدة في برنامج تلفزيوني. تحقق من أن windows قبل قطع مفتوحة.
  2. إزالة الملوحة واستخدام قطع طويلة رقيقة من مثلثات امتصاص الدم. رفع جذوعها اثنين من النخاع الشوكي باستخدام ميكروسباتولا لضمان فصل جيدة. بلطف رفع السيجارة روسترال مع ميكروسباتولا وزلة القناة على عقب السيجارة مع النوافذ التي تواجه النفس. ضمان أن يتم إدراج السيجارة كاملة وليس هناك أي النزيف الزائد إلى القناة-
  3. برفق أرفع السيجارة والذيلية وزلة على الطرف الآخر من القناة على عقب السيجارة. تأكد من أن يتم إدراج السيجارة كاملة والنوافذ على سطح الظهرية ( الشكل 2A).

4. خلية شوان/"المصفوفة عن طريق الحقن" (انظر الجدول للمواد) إعداد وحقن

  1. أثناء انتظار قطعت الحبل السري للوصول إلى الأرقاء، إزالة المتوسط أعلاه بيليه بروتينات فلورية خضراء-اتفاقية استكهولم (إعداد في الخطوة 1، 2). ريسوسبيند بروتينات فلورية خضراء-الطوائف المنبوذة في 10 ميليلتر من البرد DMEM/F12. إضافة 10 ميليلتر من جل الحقن الباردة إلى تعليق خلية ومزيج جيد من قبل تكرار بيبيتينج. تبقى خليط بروتينات فلورية خضراء-SC/DMEM/F12/حقن مصفوفة على الجليد حتى يتم إكمال الإدراج ممرا.
  2. بعد التأكد من أن windows في الظهرية السطحية ويتم فتح ( الشكل 2A)، ضخ 20 ميليلتر من خليط مصفوفة التجارة والنقل-SC/DMEM/F12/حقن في قناة عن طريق واحدة من windows قبل قطع 46 استخدام وصمة عار غربية تحميل تلميح وميكروبيبيتي. إذا كان يجب أن أوفيرفيل الخليط مصفوفة SC/DMEM/F12/حقن ممرا، إزالة الزائدة مع مثلثات الاستيعاب. إغلاق الإطارات بعد الحقن؛ خياطة ليست هناك حاجة ( الشكل 2)-

5. الجرح بالإغلاق والرعاية بعد العملية الجراحية

طبقات
  1. خياطة العضلات والدهون الطبقات السطحية. تنظيف الجلد مع الإيثانول 70% وتدبيسه آنذاك (مثلاً، استخدام مقاطع الجرح) إغلاق الجلد. إبقاء الحيوانات في حاضنة حرارياً تنظيم حتى أنهم يستعيد وعيه. نقل الحيوانات إلى الأقفاص. تزويد المياه بأنبوب تغذية منذ فترة طويلة ووضع حبيبات الغذاء على الفراش ليسهل الوصول إليها.
  2. إدارة البوبرينورفين (0.1 مغ/كغ من وزن الجسم) مرتين في يوم لمدة 3 أيام تحت الجلد تبدأ فورا بعد الجراحة للحد من الألم. حقن تحت الجلد مرة واحدة يوميا لمدة 7 أيام مباشرة بعد عملية جراحية لمنع والحد من العدوى مع الجنتامايسين (5 ملغ/كغ من وزن الجسم). حقن 10 مل من لاكتاتيد قارعو الأجراس الحل تحت الجلد مرتين يوميا لمدة 7 أيام لترطيب.
    3. أكياس
  3. فارغة يدوياً مرتين في يوم حتى المثانة تعمل العودة. في حالة حدوث التهاب المثانة، ثم إدارة المالحة 10 مل تحت الجلد حتى البول يصبح واضحا. إذا لم يكن هناك أي تحسن في اليومين الماضيين، حقن مع الجنتامايسين (5 ملغ/كغ من وزن الجسم، مرة واحدة يوميا) تحت الجلد حتى يصبح من الواضح البول.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

والهدف من استخدام هذا الأسلوب الجراحي هو لتقييم استخدام قناة تنظيماً ومصفوفة الحقن التي يعظم دالة اتفاقية استكهولم بعد زرع في الحبال الشوكي بحف المكتملة. ثلاثة أسابيع بعد زرع الأعضاء، هي perfused الحيوانات مع بارافورمالدهيد 4% والأعمدة الشوكي صارخ تشريح وإصلاحها في مثبت نفسه لآخر 24 ساعة. ثم يتم تشريح النخاع الشوكي وتوضع العينات لأقسام كريوستات السهمي إلى حل سكروز 30% كريوبروتيكشن. يتم وضع المقاطع العرضية سميكة 1 ملم معزولة من منتصف الجسر اتفاقية استكهولم لمجموعة أخرى من تشريح الشوكي الحب...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

أن الخطوة الأكثر أهمية في خلق نموذج ترانسيكشن فعال هو قطع الحبل الشوكي في التخفيضات واحد أو اثنين. 2-2.5 ملم فجوة بين جذوعها الحبل الشوكي روسترال ووالذيليه أن يكون حاضرا في الموقع ترانسيكشن. ثلاثة أسباب هذه فجوة لا تظهر الأكثر احتمالاً هي الجذور الظهرية/البطني (1) لم يتم إزالتها بشكل صحيح، ولم تتم إزالة (2) دوراً البطني على نحو كاف، و/أو الحيوان (3) عدم تمركز بشكل صحيح على لفة يوضع تحت لها.

القيام بإدراج قناة فعالة بين جذوعها: ينبغي أن يكون متلائما مع القطر (1) من القناة للأنواع المحددة والعمر...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

نود أن نشكر النواقل الفيروسية والحيوان النوى في "مشروع ميامي" "علاج شلل" المنتجة لينتي-التجارة والنقل-الفيروس وتوفير الرعاية الحيوانية، على التوالي، وعلم الأنسجة و "أساسيات التصوير" لاستخدام كريوستات، مجهر [كنفوكل]، و مجهر فلوري مع "محقق ستيريو". تم توفير التمويل بوزارة الدفاع (W81XWH-14-1-0482)، نيندس (09923) وجبهة الخلاص الوطني (هيئة الهجرة واللاجئين-1006510). بانج M.B. هو "كريستين ه لين الموقر أستاذ لعلم الأعصاب".

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
قوارير مبردةThermoFisher Scientific5000-0020
طبق بتري 10 سمVWR25382-428
وسط النسر المعدل من Dulbecco: خليط المغذيات F-12ThermoFisher Scientific11039-021"DMEM / F12" في البروتوكول.
البنسلين الستربتومايسينThermoFisher Scientific15140-122"القلم / البكتيريا" في البروتكويل.
مصل الأبقار الجنينيHycloneSH300-70-03"FBS" في البروتوكول.
مستخلص الغدة النخاميةالتقنيات الطبية الحيويةBT-215
فورسكولينسيجما ألدريتشF6886
هيريغولينR& D Systems396-HB / CF
بولي L-lysineSigma-AldrichP2636"PLL" في البروتوكول.
Dulbecco متوسطThermoFisher Scientific11965-092"DMEM" في البروتوكول.
محلول الملح المتوازن من هانكThermoFisher Scientific14170-112"HBSS" في البروتوكول.
Tryspin-EDTAThermoFisher Scientific15400-054
أنثى فأر فيشر (160-180 جم)مقص Envigo
Vannas ، مستقيمFST15018-10
KetamineVedco Inc5098976106100 مجم / مل
XylazineLloyd IncAnaSed20 مجم / مل
GentamycinAPP PharmaceuticalsNDC 63323-010-02يمكن أن تكون أي علامة تجارية من اختيارها.
SpatulaFST10089-11أي علامة تجارية من اختيارها.
مقص منحني بنهاية حادةFST14017-18يمكن أن يكون أي علامة تجارية من اختيارها.
ملقط حادFST11006-12يمكن أن يكون أي علامة تجارية من اختيارك.
يمكن أن يكون رونجورFST16121-14أي علامة تجارية من اختيارك.
مقص زنبركي بزاويةFST15006-09يمكن أن يكون أي علامة تجارية من اختيارك.
يمكن أن تكون مثلثات الامتصاصFST18105-03أي علامة تجارية من اختيارها.
GelfoamHenry Schein9083300"رغوة مضغوطة" في البروتوكول.
# 10 شفراتSklar06-3010يمكن أن تكون أي علامة تجارية من اختيارها.
MatrigelCorning354234"المصفوفة القابلة للحقن" في البروتوكول.
الجسم المضاد للبروتين الفلورسنت للدجاج المضاد للبروتين الفلوري الأخضرMilliporeAB16901
Mouse RT97 الأجسام المضادة للورم الهجينDSHBRT97
الأرانب المضادة للخيوط العصبية EncorBiotechnology، IncPRCA-NF-H
الأرنب متعدد النسيلة المضاد للبروتين الحمضي الليفي الدبقي الأجسام المضادةDakoZ033401
Alexa Fluor 488 الماعز المضاد للدجاج IgG (H + L)ThermoFisher ScientificA-11039
Alexa Fluor 546 الماعز المضاد للأرانب IgG (H + L)ThermoFisher ScientificA-11035
Alexa Fluor 647 الماعز المضاد للأرانب IgG (H + L)ThermoFisher ScientificA-21244
Alexa Fluor 647 الماعز المضاد للفأر IgG (H + L)ThermoFisher ScientificA-21236
المجهر متحد البؤرنيكونclsi
تعديل من النسر يمكن أن تكون Micro

المراجع

  1. King, V. R., Alovskaya, A., Wei, D. Y., Brown, R. A., Priestley, J. V. The use of injectable forms of fibrin and fibronectin to support axonal ingrowth after spinal cord injury. Biomaterials. 31 (15), 4447-4456 (2010).
  2. Liu, T., Houle, J. D., Xu, J., Chan, B. P., Chew, S. Y. Nanofibrous collagen nerve conduits for spinal cord repair. Tissue Eng Part A. 18 (9-10), 1057-1066 (2012).
  3. Novikova, L. N., Pettersson, J., Brohlin, M., Wiberg, M., Novikov, L. N. Biodegradable poly-beta-hydroxybutyrate scaffold seeded with Schwann cells to promote spinal cord repair. Biomaterials. 29 (9), 1198-1206 (2008).
  4. Bamber, N. I., Li, H., Aebischer, P., Xu, X. M. Fetal spinal cord tissue in mini-guidance channels promotes longitudinal axonal growth after grafting into hemisected adult rat spinal cords. Neural Plast. 6 (4), 103-121 (1999).
  5. Xu, X. M., Zhang, S. X., Li, H., Aebischer, P., Bunge, M. B. Regrowth of axons into the distal spinal cord through a Schwann-cell-seeded mini-channel implanted into hemisected adult rat spinal cord. Eur J Neurosci. 11 (5), 1723-1740 (1999).
  6. Bamber, N. I., et al. Neurotrophins BDNF and NT-3 promote axonal re-entry into the distal host spinal cord through Schwann cell-seeded mini-channels. European Journal of Neuroscience. 13 (2), 257-268 (2001).
  7. Iannotti, C., et al. Glial cell line-derived neurotrophic factor-enriched bridging transplants promote propriospinal axonal regeneration and enhance myelination after spinal cord injury. Exp Neurol. 183 (2), 379-393 (2003).
  8. Deng, L. X., et al. GDNF modifies reactive astrogliosis allowing robust axonal regeneration through Schwann cell-seeded guidance channels after spinal cord injury. Exp Neurol. 229 (2), 238-250 (2011).
  9. Deng, L. X., et al. A Novel Growth-Promoting Pathway Formed by GDNF-Overexpressing Schwann Cells Promotes Propriospinal Axonal Regeneration, Synapse Formation, and Partial Recovery of Function after Spinal Cord Injury. J Neurosci. 33 (13), 5655-5667 (2013).
  10. Chen, X., et al. Bone marrow stromal cells-loaded chitosan conduits promote repair of complete transection injury in rat spinal cord. J Mater Sci Mater Med. 22 (10), 2347-2356 (2011).
  11. Hurtado, A., et al. Robust CNS regeneration after complete spinal cord transection using aligned poly-L-lactic acid microfibers. Biomaterials. 32 (26), 6068-6079 (2011).
  12. Cheng, H., Huang, Y. C., Chang, P. T., Huang, Y. Y. Laminin-incorporated nerve conduits made by plasma treatment for repairing spinal cord injury. Biochem Biophys Res Commun. 357 (4), 938-944 (2007).
  13. Fan, J., et al. Neural regrowth induced by PLGA nerve conduits and neurotrophin-3 in rats with complete spinal cord transection. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 97 (2), 271-277 (2011).
  14. Lietz, M., et al. Physical and biological performance of a novel block copolymer nerve guide. Biotechnol Bioeng. 93 (1), 99-109 (2006).
  15. Novikova, L. N., Novikov, L. N., Kellerth, J. O. Biopolymers and biodegradable smart implants for tissue regeneration after spinal cord injury. Curr Opin Neurol. 16 (6), 711-715 (2003).
  16. Tang, S., et al. The effects of controlled release of neurotrophin-3 from PCLA Scaffolds on the survival and neuronal differentiation of transplanted neural stem cells in a rat spinal cord injury model. PLoS One. 9 (9), e107517(2014).
  17. Yao, L., et al. Improved axonal regeneration of transected spinal cord mediated by multichannel collagen conduits functionalized with neurotrophin-3 gene. Gene Ther. , (2013).
  18. Xu, X. M., Guénard, V., Kleitman, N., Bunge, M. B. Axonal regeneration into Schwann cell-seeded guidance channels grafted into transected adult rat spinal cord. J Comp Neurol. 351 (1), 145-160 (1995).
  19. Xu, X. M., Chen, A., Guenard, V., Kleitman, N., Bunge, M. B. Bridging Schwann cell transplants promote axonal regeneration from both the rostral and caudal stumps of transected adult rat spinal cord. J Neurocytol. 26 (1), 1-16 (1997).
  20. Takami, T., et al. Schwann cell but not olfactory ensheathing glia transplants improve hindlimb locomotor performance in the moderately contused adult rat thoracic spinal cord. J Neurosci. 22 (15), 6670-6681 (2002).
  21. Bunge, M. B., Wood, P. M. Handbook of Clinical Neurology. 109, 523-540 (2012).
  22. Fortun, J., Hill, C. E., Bunge, M. B. Combinatorial strategies with Schwann cell transplantation to improve repair of the injured spinal cord. Neurosci Lett. 456 (3), 124-132 (2009).
  23. Haggerty, A. E., Oudega, M. Biomaterials for spinal cord repair. Neurosci Bull. , (2013).
  24. Nomura, H., Tator, C. H., Shoichet, M. S. Bioengineered strategies for spinal cord repair. J Neurotrauma. 23 (3-4), 496-507 (2006).
  25. Straley, K. S., Foo, C. W. P., Heilshorn, S. C. Biomaterial Design Strategies for the Treatment of Spinal Cord Injuries. J Neurotrauma. 27 (1), 1-19 (2010).
  26. Williams, R. R., Henao, M., Pearse, D. D., Bunge, M. B. Permissive Schwann cell graft/spinal cord interfaces for axon regeneration. Cell Transplant. 24 (1), 115-131 (2015).
  27. Williams, R. R., Pearse, D. D., Tresco, P. A., Bunge, M. B. The assessment of adeno-associated vectors as potential intrinsic treatments for brainstem axon regeneration. J Gene Med. 14 (1), 20-34 (2012).
  28. Xu, X. M., Guenard, V., Kleitman, N., Aebischer, P., Bunge, M. B. A combination of BDNF and NT-3 promotes supraspinal axonal regeneration into Schwann cell grafts in adult rat thoracic spinal cord. Exp Neurol. 134 (2), 261-272 (1995).
  29. Lee, Y. S., Arinzeh, T. L. The influence of piezoelectric scaffolds on neural differentiation of human neural stem/progenitor cells. Tissue Eng Part A. 18 (19-20), 2063-2072 (2012).
  30. Lee, Y. S., Collins, G., Arinzeh, T. L. Neurite extension of primary neurons on electrospun piezoelectric scaffolds. Acta Biomater. 7 (11), 3877-3886 (2011).
  31. Lee, Y. S., Wu, S., Arinzeh, T. L., Bunge, M. B. Enhanced noradrenergic axon regeneration into schwann cell-filled PVDF-TrFE conduits after complete spinal cord transection. Biotechnol Bioeng. 114 (2), 444-456 (2017).
  32. Haider, A., Haider, S., Kang, I. -K. A comprehensive review summarizing the effect of electrospinning parameters and potential applications of nanofibers in biomedical and biotechnology. Arab J Chem. , (2015).
  33. Hassiba, A. J., et al. Review of recent research on biomedical applications of electrospun polymer nanofibers for improved wound healing. Nanomedicine (Lond). 11 (6), 715-737 (2016).
  34. Lee, Y. -S., Livingston Arinzeh, T. Electrospun Nanofibrous Materials for Neural Tissue Engineering. Polymers. 3 (1), 413-426 (2011).
  35. Oraee-Yazdani, S., et al. Co-transplantation of autologous bone marrow mesenchymal stem cells and Schwann cells through cerebral spinal fluid for the treatment of patients with chronic spinal cord injury: safety and possible outcome. Spinal Cord. 54 (2), 102-109 (2016).
  36. Saberi, H., et al. Safety of intramedullary Schwann cell transplantation for postrehabilitation spinal cord injuries: 2-year follow-up of 33 cases. J Neurosurg Spine. 15 (5), 515-525 (2011).
  37. Saberi, H., et al. Treatment of chronic thoracic spinal cord injury patients with autologous Schwann cell transplantation: an interim report on safety considerations and possible outcomes. Neurosci Lett. 443 (1), 46-50 (2008).
  38. Yazdani, S. O., et al. A comparison between neurally induced bone marrow derived mesenchymal stem cells and olfactory ensheathing glial cells to repair spinal cord injuries in rat. Tissue Cell. 44 (4), 205-213 (2012).
  39. Zhou, X. H., et al. Transplantation of autologous activated Schwann cells in the treatment of spinal cord injury: six cases, more than five years of follow-up. Cell Transplant. 21, Suppl 1. S39-S47 (2012).
  40. Chen, L., et al. A prospective randomized double-blind clinical trial using a combination of olfactory ensheathing cells and Schwann cells for the treatment of chronic complete spinal cord injuries. Cell Transplant. 23, Suppl 1. S35-S44 (2014).
  41. Guest, J., Santamaria, A. J., Benavides, F. D. Clinical translation of autologous Schwann cell transplantation for the treatment of spinal cord injury. Curr Opin Organ Transplant. 18 (6), 682-689 (2013).
  42. Bunge, M. B., Monje, P. V., Khan, A., Wood, P. M. Progress in Brain Research. , Elsevier. (2017).
  43. Meijs, M. F., et al. Basic fibroblast growth factor promotes neuronal survival but not behavioral recovery in the transected and Schwann cell implanted rat thoracic spinal cord. J Neurotrauma. 21 (10), 1415-1430 (2004).
  44. Blits, B., et al. Lentiviral vector-mediated transduction of neural progenitor cells before implantation into injured spinal cord and brain to detect their migration, deliver neurotrophic factors and repair tissue. Restor Neurol Neurosci. 23 (5-6), 313-324 (2005).
  45. Follenzi, A., Naldini, L. HIV-based vectors. Preparation and use. Methods Mol Med. 69, 259-274 (2002).
  46. Fouad, K., et al. Combining Schwann cell bridges and olfactory-ensheathing glia grafts with chondroitinase promotes locomotor recovery after complete transection of the spinal cord. J Neurosci. 25 (2), 1169-1178 (2005).
  47. Bates, M. L., Puzis, R., Bunge, M. B. Animal Models of Movement Disorders: Volume II. Lane, E. L., Dunnett, S. B. , Humana Press. 381-399 (2011).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

قطع النخاع الشوكيزراعة خلايا شوانزرع القنواتنموذج القطع الكاملإجراء استئصال الصفيحة الفقريةهلام مصفوفة قابل للحقنخلايا شوان GFPقناة PVDF-TrFEالتصوير الفلوري البؤري
زرع شوان الخلايا داخل قنوات PVDF-ترف سد الفئران بحف الحبل الشوكي جذوعها لتعزيز التجديد إكسون عبر الفجوة
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.