يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

[كنفوكل] التصوير من Neuropeptide Y-فلورين: تقنية لتصور الأنسولين الحبيبية للرقابة في الجزيرات سليمة مورين والبشرية

8.5K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/56089

⸱

سبتمبر 13, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, University of Miami, 2Department of Medicine, University of Toronto

في هذه المقالة

ملخص

يمكننا وصف بروتوكول للتصور للرقابة الأنسولين في الجزيرات سليمة باستخدام فلورين، بروتين فلوري أخضر حساسة لدرجة الحموضة. الجزر الصغيرة المعزولة مصابون بترميز فلورين بالإضافة إلى البضائع حويصلة neuropeptide Y إتش. وهذا يسمح للكشف عن أحداث الانصهار الحبيبية الأنسولين بالفحص المجهري [كنفوكل].

الملخص

إفراز الأنسولين يلعب دوراً مركزياً في التوازن الجلوكوز في ظل الظروف الفسيولوجية العادية، فضلا عن المرض. النهج الحالي لدراسة الرقابة الحبيبية الأنسولين أما استخدام الكهربية أو مجهرية بالإضافة إلى التعبير عن الصحفيين الفلورسنت. ولكن معظم هذه التقنيات قد تم الأمثل لخطوط الخلايا الاستنساخ أو تتطلب الناي جزيرات البنكرياس. وفي المقابل، يسمح الطريقة المعروضة هنا للوقت الحقيقي التصور للأنسولين الحبيبية للرقابة في جزيرات البنكرياس سليمة. في هذا البروتوكول، يصف لنا أولاً العدوى الفيروسية من جزيرات البنكرياس المعزول مع إتش ترميز حساسة لدرجة الحموضة أخضر نيون بروتين (التجارة والنقل)، فلورين، بالإضافة إلى neuropeptide Y (نبي). وثانيا، يصف لنا [كنفوكل] التصوير من الجزيرات خمسة أيام بعد العدوى الفيروسية وكيفية مراقبة إفراز الأنسولين الحبيبية. بإيجاز، توضع على ساترة في دائرة تصوير للجزر المصابة وتصويرها تحت مجهر [كنفوكل] تستقيم المسح الضوئي الليزر بينما يجري perfused باستمرار مع الحل خارج الخلية التي تحتوي على المنبهات المختلفة. [كنفوكل] الصور التي تغطي 50 ميكرون من جزيرة ليلى تكتسب كالوقت الفاصل بين التسجيلات باستخدام ماسح ضوئي سريع رنانة. يمكن أن يتبع انصهار حبيبات الأنسولين مع غشاء البلازما على مر الزمن. هذا الإجراء يسمح لاختبار بطارية محفزات في تجربة واحدة أيضا ومتوافق مع الماوس والجزيرات البشرية، ويمكن أن تكون جنبا إلى جنب مع الأصباغ المختلفة لتصوير الوظيفية (مثلاً، غشاء الأصباغ الكالسيوم المحتملة أو سيتوسوليك).

المقدمة

يتم إنتاج الأنسولين خلايا بيتا من البنكرياس جزيرة ليلى ومنظم رئيسي الجلوكوز الأيض1. الموت أو خلل وظيفي لخلايا بيتا يخل بالتوازن السكر ويؤدي إلى مرض السكري2. هي معبأة الأنسولين في الحبيبات الكثيفة الأساسية التي يتم إصدارها في Ca2 +-تعتمد طريقة3. توضيح كيف ينظم الرقابة الحبيبية الأنسولين ضروري للفهم الكامل لما يحدد إفراز الأنسولين، ويفتح آفاقاً جديدة لتحديد أهداف علاجية جديدة لعلاج مرض السكري.

وتم درس الرقابة الأنسولين على نطاق واسع استخدام نهج الكهربية، مثل الغشاء السعة القياسات، والنهج المجهرية في تركيبة مع جزيئات الفلورسنت. غشاء السعة قياسات الأزمنة جيدة وتسمح تسجيلات خلية مفردة. بيد التغيرات في السعة يعكس صافي التغيير السطحي في الخلية ولا التقاط الأحداث الفردية الانصهار أو التمييز بين الانصهار الحبيبية الأنسولين من الحويصلات الافرازية غير الأنسولين الأخرى3. الطرق المجهرية، مثل انعكاس الداخلية اثنين-فوتون أو مجموع الأسفار (TIRF) مجهرية في تركيبة مع تحقيقات الفلورسنت والبروتينات البضائع حويصلة، توفر تفاصيل إضافية. هذه التقنيات التقاط أحداث اكسوسيتوتيك واحد، وأيضا في مراحل ما قبل وما بعد اكسوسيتوتيك، ويمكن استخدامها لدراسة أنماط اكسوسيتوتيك في السكان من الخلايا3.

الفلورسنت الصحفيين يمكن أن تكون من ثلاثة أنواع: 1) خارج الخلية أو 2) هيولى 3) حويصلية. 1) الصحافيين خارج الخلية هي تتبع القطبية (مثلاً، ديكسترانس، سولفورهوداميني ب (SRB)، إبليس الأصفر، بيرنيني) التي يمكن تقديمها من خلال الوسط خارج الخلية4. استخدام تتبع القطبية يسمح لتحقيق المسام الانصهار في عدد أن خلايا ويلتقط الهياكل بين الخلايا المختلفة مثل الأوعية الدموية. بيد أنها لا تبلغ عن السلوك البضائع حويصلة. 2) هيولى الصحفيين هي تحقيقات الفلورسنت بالإضافة إلى البروتينات المرتبطة بالغشاء الذي يواجه السيتوبلازم، وهي تشارك في الالتحام والرقابة. وتشمل الأمثلة أعضاء نالقابلة للذوبان-اثيلماليميدي-يراعي عامل مرفق البروتين مستقبلات (الفخ) الأسرة التي استخدمت بنجاح في علم الأعصاب لدراسة العصبي الإصدار5. هذه البروتينات متعددة الشركاء ملزمة وليست الحبيبية الأنسولين المحددة. 3) حويصلية الصحفيين هي الفلورية المسابير تنصهر فيها البضائع حويصلية البروتينات التي تسمح لتحقيق سلوك حويصلة الخاصة بالبضائع. البروتينات الحبيبية الأنسولين بضائع محددة تشمل الأنسولين، ج-الببتيد وجزيرة ببتيد اميلويد ونبي بينها6،7. نبي موجودة فقط في الأنسولين الذي يحتوي على حبيبات، ويطلق يشترك مع الأنسولين، يجعلها شريكا ممتازا ل مراسل نيون8.

انصهار مختلف البروتينات الفلورية إلى نبي قد استخدمت سابقا لدراسة الجوانب المختلفة للرقابة في خلايا الغدد الصم العصبية، مثل شرط محدد سينابتوتاجمين إيسوفورمس9،10 وكيف يعتمد الوقت-الدورة التدريبية للإفراج على cytoskeleton أكتين وعلى الميوسين الثاني11،12. في هذه الدراسة، اخترنا فلورين كمراسل الفلورسنت، وهي بروتينات فلورية خضراء معدلة التي غير الفلورية على درجة الحموضة الحمضية داخل الأساسية كثيفة ولكن يصبح الزاهية الفلورسنت عند التعرض ل درجة الحموضة خارج الخلية محايدة13حبيبات. حبيبات الأنسولين ناضجة بدرجة حموضة حمضية أدناه 5.5. مرة واحدة الحبيبية الصمامات بغشاء البلازما ويفتح، يتعرض حمولتها الهيدروجيني المحايدة خارج الخلية من 7.4، السماح باستخدام فلورين البروتينات حساسة لدرجة الحموضة كمراسل7،14.

نظراً لطبيعة حساسة pH فلورين والتعبير الانتقائي لنبي في حبيبات الأنسولين، يمكن استخدامها في بناء الانصهار نبي-فلورين لدراسة الخصائص المختلفة للأنسولين الحبيبية للرقابة. إنجاز بناء الانصهار الفيروسية يضمن تعداء عالية الكفاءة ويعمل على خلايا بيتا أولية أو خطوط الخلايا وكذلك على الجزر الصغيرة المعزولة. يمكن أيضا استخدام هذا الأسلوب كمبدأ توجيهي لدراسة الرقابة في أي نوع آخر من أنواع الخلايا مع الحويصلات المحتوية على نبي. فإنه يمكن أيضا أن يقترن مع أي نموذج الفأر وراثيا لدراسة آثار شروط معينة (كنوكدوونس، أوفيريكسبريشن، إلخ) على الرقابة. هذه التقنية قد استخدمت سابقا لوصف الأنماط المكانية والزمانية لإفراز الحبيبية الأنسولين في خلايا بيتا السكان في الجزر البشرية15.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

لجنة الأخلاقيات الحيوان من جامعة ميامي قد وافقت جميع التجارب-

1. الفيروسي العدوى سليمة معزولة الإنسان أو الماوس جزيرات البنكرياس

  1. ثقافة الجزيرة: إعداد وسائل الإعلام ثقافة جزيرة ليلى: كونوت طبية أبحاث المختبرات (كمرل) 1066، 10% (v/v) FBS ومم 2 لتر-الجلوتامين. يتم الحصول على جزيرات البنكرياس
    1. الإنسان من "برنامج توزيع جزيرة متكاملة" (نيدك، المعاهد الوطنية للصحة). لدى وصوله، نقل الجزيرات (~ 500 جزيرة مكافئات) إلى 35 ملم غير-زراعة الأنسجة تعامل أطباق بيتري مع 2 مل كمرل ثقافة الإعلام عند 37 درجة مئوية، 5/95% CO 2 &/O 2 ل 24 ساعة قبل العدوى الفيروسية.
    2. الماوس جزيرات البنكرياس يمكن عزل عقب البروتوكولات المحددة سابقا 16. بعد العزلة والثقافة ~ 200 جزيرة مكافئات في 35 ملم غير-زراعة الأنسجة تعامل أطباق بيتري مع 2 مل كمرل ثقافة الإعلام عند 37 درجة مئوية، 5/95% CO 2 &/O 2 ل 24 ساعة قبل العدوى الفيروسية.
      ملاحظة: تجنب استخدام الفئران المعدلة وراثيا مع الصحفيين بروتينات فلورية خضراء أو يفب أعرب في الجزر الصغيرة لتجنب التداخل الأسفار مع فلورين نبي.
  2. إعداد الفيروسات
    ملاحظة: الانصهار نبي-فلورين المستنسخة في ناقلات pcDNA3 10 وسوبكلونيد إلى متجه أدينوفيرال لإنتاج أدينوفيرال [إتش النمط المصلي المسيطر 5 (DE1/E3)] من إتش المؤتلف الشركة المصنعة. وكان الفيروس اليكووتيد والمخزنة في-80 درجة مئوية. الأسهم الفيروسية يتم توفيرها من قبل الشركة في التتر 10 12 إلى 10 13 الجسيمات الفيروسية (~ 10 3 × 10-3 × 10 11 [بفو]).
    1. للإصابة في المختبر جزيرة ليلى، باستخدام 10 6 بفو/mL، أدى تعدد تقريبي للإصابة (وزارة الداخلية) لحوالي 2 (انظر المناقشة للحصول على التفاصيل)
  3. العدوى الفيروسية من جزيرات البنكرياس
    تنبيه: العمل مع غدية يتطلب إجراءات السلامة البيولوجية المستوى 2 (BSL2) وإصدار الشهادات. تحقق مع موظف السلامة المؤسسية للتوجيه والتدريب على إجراءات BSL2.
    1. إعداد الإنسان/الماوس الجزر الصغيرة كما هو موضح أعلاه.
    2. إضافة 5-10 ميليلتر من الفيروسات الأسهم لكل طبق بتري 35 ملم تحتوي على الجزر الإنسان/الماوس في 2 مل وسائط الثقافة كمرل (مع 10% FBS ومم 2 لتر-الجلوتامين).
      ملاحظة: ضبط حجم الفيروس المستخدمة وفقا لعيار الفيروسية كما هو منصوص عليه بورقة البيانات الشركة.
    3. ثقافة الجزر في احتواء الفيروس وسائط الإعلام في 37 °C/5% CO 2 ل 24 h.
    4. بعد 24 ساعة، نضح الوسائط التي تحتوي على الفيروسات واستبدال مع 2 مل كمرل ثقافة وسائل الإعلام (مع 10% FBS ومم 2 لتر-الجلوتامين).
    5. الثقافة في الجزر لمدة 4-6 أيام في 37 °C/5% CO 2، الاستعاضة عن وسائل الإعلام كل 3 أيام-
    6. بعد 4-6 أيام لاستزراع، نتوقع حوالي 30% خلايا الجزيرة للإصابة. ثم يمكن استخدام الجزر لتجارب التصوير حية.

2. [كنفوكل] "التصوير من المصابين جزيرات"

ملاحظة: الرجوع إلى الجدول للمواد اللازمة للمواد والمعدات اللازمة للتصوير [كنفوكل]-

إعداد
  1. كاشف والإعداد التجريبية
    1. إعداد الحل خارج الخلية: إضافة 125 ملم كلوريد الصوديوم، 5.9 ملم بوكل، مم 2.56 كاكل 2، 1 مم مجكل 2، 25 مم هيبيس، 0.1% جيش صرب البوسنة، درجة الحموضة 7.4، عقيمة تصفيتها.
      ملاحظة: هذا المخزن المؤقت هو إعداد عادة دون الجلوكوز ويمكن تخزينها عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد. يتم إضافة السكر في اليوم من هذه التجربة للوصول إلى التركيز النهائي المطلوب.
      1. تحضير الجلوكوز القاعدي (3 مم) المتوسطة: إضافة ميليلتر 75 م 2 الجلوكوز المخزون إلى 50 مل من محلول خارج الخلية.
      2. المتوسطة هايبرجليسيميك (16 مم): إضافة ميليلتر 400 م 2 الجلوكوز المخزون إلى 50 مل من محلول خارج الخلية
    2. تمييع أي حافز إضافية (مثلاً، بوكل أو الادينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP)) في الحل خارج الخلية التي تحتوي على الجلوكوز 3 مم-
    3. قبل البدء تجربة، بريتريت كوفيرسليبس مع بولي-د-يسين بإضافة 30 ميليلتر من بولي-د-يسين الحل (1 ملغ/مل) إلى ساترة ح 1 ودقة الشطف مع ح 2 أولمبيك
      ملاحظة: يمكن تخزين كوفيرسليبس بولي-يسين المغلفة في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى 6 أشهر.
      4. نقل
    4. على الأقل 1 ساعة قبل هذه التجربة، باستخدام ماصة 1 مل، الجزر الصغيرة إلى طبق بتري 35 ملم تحتوي على الحل خارج الخلية مع الجلوكوز 3 مم. الاحتفاظ الجزر الصغيرة في 37 درجة مئوية و 5% CO 2-
      ملاحظة: إذا لزم الأمر، يمكن أن يكون المسمى غشاء البلازما في هذه الخطوة. لتسمية غشاء البلازما، إضافة 2 ميكرومتر دي-8-عنب صبغ للحل خارج الخلية مع الجلوكوز 3 مم. احتضان الجزيرات في صبغ الحل ح 1 في 37 °C/5% CO 2. يمكن أن تكون متحمس صبغ غشاء البلازما في 488 نانومتر والكشف على 620 نانومتر.
      5. إرفاق
    5. دقيقة قبل البدء تجربة، ساترة قاعة التصوير بختم أنه مع الشحوم سيليكون فراغ. إصلاح قاعة التصوير إلى منصة التصوير. استخدام ماصة، ضع الجزيرات 20-30 في منطقة بولي-د-يسين-يعامل ساترة وترك الجزيرات الانضمام إلى السطح ل 20 دقيقة
      ملاحظة: من المهم عدم السماح ساترة جاف تماما لتجنب الأضرار جزيرة ليلى.
    6. في حين الجزر هي التمسك ساترة، إعداد نظام التروية قبل الشطف جيدا أنه بالمياه. إضافة كل حل لقناة مختلفة: الجلوكوز 3 مم (القناة الأولى)، 16 مم الجلوكوز (القناة الثانية)، الجلوكوز 16 ملم مع 100 ميكرومتر 3-إيسوبوتيل-1-زانتين (إيبمكس) وفورسكولين 10 ميكرون (القناة الثالثة)، 25 مم بوكل في الجلوكوز 3 مم (قناة 4)، 10 ميكرون ATP في 3 مم (الجلوكوز قناة 5). إزالة جميع فقاعات من النظام بفتح كل قناة على حدة، والسماح تدفق الحل لبضع دقائق، ويجب التأكد من أن التدفق متسقة (0.5 مل/دقيقة) وهو عدم حدوث أي تسرب الأنابيب-
    7. الاتصال سخان حل واحد مضمنة إلى أنبوب منفذ نضح وضبط درجة حرارة المخزن المؤقت الفائضة إلى 37 درجة مئوية.
      8. إعداد
    8. مضخة شفط. إزالة كافة الفقاعات من النظام، والتأكد من أن التدفق يتمشى وهو عدم حدوث أي تسرب الأنابيب-
    9. مجرد الجزيرات التمسك بالسطح ساترة، بلطف تملأ قاعة التصوير مع الحل خارج الخلية التي تحتوي على الجلوكوز 3 مم. تجنب غسل الجزر بعيداً عن سطح ساترة-
    10. وضع منهاج التصوير مع الجزر على خشبة المسرح مجهر وتوصيله إلى نظام التروية ومضخة شفط.
    11. بدوره على التدفق واستمرار نتخلل الجزر مع الجيل الثالث 3g الحل خارج الخلية. النظام جاهز الآن لتصوير [كنفوكل]-
  2. [كنفوكل] تصوير
    1. تحديد موقع الجزر الصغيرة في مجال مجهر مع التكبير أقل. مرة واحدة تركز على الجزر الصغيرة، قم بالتبديل إلى أعلى تكبير الأهداف (مثلاً، والهدف غمر المياه X 63 (63 X/0.9 غ)).
    2. فتح الحصول على استخدام البرمجيات (جدول المواد)، وتنشيط وضع الماسح الضوئي رنانة.
    3. تحديد وضع التصوير إكسيزت وتكوين إعدادات اقتناء كما يلي:
      1. بدوره الأرجون ليزر والليزر 488 نانومتر خط وضبط السلطة الليزر إلى 50% للإثارة فلورين.
      2. جمع الانبعاثات في 505-555 نانومتر.
      3. اختر دقة 512 × 512 بكسل. اضغط " لايف " زر لبدء التصوير وضبط مستويات الربح (الربح نموذجي هو حوالي 600 V).
      4. تعيين بداية ونهاية z-المكدس: التركيز على رأس هذه الجزيرة الصغيرة، واختر " تبدأ " والانتقال إلى آخر الطائرة التي يمكن أن تركز وتختار " نهاية ". استخدام حجم z-خطوة 5 ميكرومتر. سيقوم البرنامج تلقائياً بحساب عدد الطائرات [كنفوكل]-
      5. تعيين الفاصل الزمني للحصول على كل كومة ض ما يقرب من 1.5-2 s واختر الخيار " اكتساب حتى توقف " للتصوير المستمر-
      6. اضغط " ابدأ " زر iniتياليزي.
    4. استخدام البروتوكولات التحفيز المختلفة لحمل الرقابة الحبيبية من بيرفوسينج الجزر مع المحفزات المطلوبة. بروتوكولات التحفيز يمكن تخصيصها لتناسب الغرض العلمي المنشود (انظر أدناه)-
  3. البروتوكولات التحفيز
    ملاحظة: في كل بروتوكول التحفيز، ابدأ بتسجيل مالا يقل عن 2 دقيقة من جزيرة ليلى خلفية النشاط أثناء التروية المستمرة مع الحل خارج الخلية التي تحتوي على الجلوكوز 3 مم. نتخلل بمثابة منبه للفترة الزمنية المطلوبة. يمكن تخصيص النظام للمنشطات، والمدة للتحفيز وكذلك مدة التسجيلات لتناسب الأغراض العلمية المطلوبة. تأكد من يغسل الجزر جيدا مع الحل خارج الخلية التي تحتوي على الجلوكوز 3 مم قبل البدء تحفيز جديدة. أدناه تجد البروتوكولات التحفيز العينة التي استخدمت لإثبات قدرات أسلوب.
    1. الحث مع كلوريد الأمونيوم (NH 4 Cl) كعنصر إيجابي فلورين الأس الهيدروجيني حساسية وكفاءة العدوى الفيروسية ( الشكل 3): الجلوكوز 3 مم (2 دقيقة) → 50 ملم NH 4 Cl (2 دقيقة) في الجلوكوز 3 مم → الجلوكوز 3 مم (2 دقيقة)
      ملاحظة: استبدال في NH 4 الحل Cl، كلوريد الصوديوم على أساس اكويمولار-
    2. الحث الأنسولين الحبيبية للرقابة عن طريق زيادة تركيز الجلوكوز ( رقم 5 و رقم 6): الجلوكوز 3 مم (2 دقيقة) → الجلوكوز 16 مم (15-30 دقيقة) → الجلوكوز 3 مم (2 دقيقة
      ملاحظة: من أجل مشاهدة عدة رشقات نارية من النشاط، نتخلل الجزيرات باستمرار مع الحل ز 16 على الأقل 15 دقيقة
      ملاحظة: من أجل زيادة الاتساق بين الاستجابات الافرازية 17، يمكن للمستخدمين إضافة عوامل رفع مخيم (100 ميكرومتر إيبمكس و 10 ميكرون فورسكولين) بحلول 16 الجيل الثالث والخاص على حد سواء. هذا لا يغير من أنماط الزمانية لإفراز الحبيبية. للاطلاع على التفاصيل انظر 15 و مناقشة-

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

العمل كله من الأسلوب الذي يظهر في الشكل 1. بإيجاز، يمكن المصابين إتش ترميز نبي-فلورين الماوس أو الجزر البشرية وتصويرها، بعد أيام قليلة في الثقافة، تحت مجهر [كنفوكل]. حبيبات تلتحم مع غشاء البلازما وفتح، يلاحظ زيادة في الأسفار ويمكن قياسها كمياً (الشكل 1). لتحديد ما إذا كان نبي-فلورين في الواقع أداة مناسبة لرصد ديناميات الحبيبية للأنسولين، كانت الجزر المصابة إيمونوستينيد مع الأجسام المضادة ضد التجارة والنقل، وجزيرة ليلى مختلف الهرم...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

ويصف هذه المخطوطة تقنية التي يمكن استخدامها لتصور الرقابة حبيبات الأنسولين في خلايا بيتا في جزيرات البنكرياس سليمة بالفحص المجهري [كنفوكل]. فإنه يستخدم فلورين نبي كمراسل الفلورسنت المستنسخة في إتش للتأكد من كفاءة تعداء عالية.

ورغم أن الأسلوب كفاءة عالية في أيدينا، قد تتطلب بعض التعديلات التي تعتمد أساسا على معلمتين من معلمات: 1) نوعية إعداد جزيرة ليلى، وعيار 2) المخزون الفيروسية مع الاستغلال الأمثل لظروف الإصابة. قبل العدوى الفيروسية للجزر الصغيرة، السماح بإعداد جزيرة ليلى للتعافي من الإجهاد ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ويعلن الكتاب لديهم لا تضارب المصالح المالية.

شكر وتقدير

يشكر المؤلفون مارسيا بولينا من حديد الاختزال المباشر التصوير المرافق الأساسية للحصول على مساعدة مع المجاهر. وأيد هذا العمل المعاهد الوطنية للصحة منح 1K01DK111757-01 (جا)، F31668418 (ملم)، R01 DK111538، R33 ES025673 و R56 DK084321 (AC).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مجهر متحد البؤر للمسح بالليزر المستقيمLeica Microsystems ، Wetzlar ، ألمانياTCS-SP5يتضمن LAS AF ، برنامج الحصول على الصور
غرفة التصويرWarnerRC-26
غرفة التصويرWarner InstrumentsPH-1
22 × 40 أغطية زجاجية DaiggerbrandG15972H
Vacuum شحم السيليكونSigmaZ273554-1EA
نظام التروية متعدد القنواتWarner InstrumentsVC-8
سخان حل مضمن واحدWarnerInstruments SH-27B
جهاز التحكم في درجة الحرارةWarnerInstruments TC-324C
مضخة شفط تمعجيةPharmaciaP-1
35 مم طبق بتري ، زراعة غير الأنسجة المعالجةVWR10861-586
CMRL متوسط ، لا الجلوتامينThermoFisher11530037
FBS ، معطل بالحرارةThermoFisher16140071
L-Glutamine 200 ملي مولارThermoFisher25030081
5 M محلول كلوريد الصوديومSigmaS5150
3M KCl حلSigma60135
1 M CaCl 2 < / sub>solutionSigma21115
1 M MgCl 2 < / sub>solutionSigmaM1028
مصل الأبقار الألبومينSigmaA2153
1 M محلول HEPESSigmaH0887
مرشح فراغVWR431098
D-GlucoseSigmaG8270
بولي د-ليسين هيدروبروميدسيجما ألدريتشP6407
Di-8-ANNEPThermoFisherD3167
3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)SigmaI5879
ForskolinSigmaF3917
أدوات منصة أدوات

المراجع

  1. Roder, P. V., Wong, X., Hong, W., Han, W. Molecular regulation of insulin granule biogenesis and exocytosis. Biochem J. 473 (18), 2737-2756 (2016).
  2. Rutter, G. A., Pullen, T. J., Hodson, D. J., Martinez-Sanchez, A. Pancreatic beta-cell identity, glucose sensing and the control of insulin secretion. Biochem J. 466 (2), 203-218 (2015).
  3. Rorsman, P., Renstrom, E. Insulin granule dynamics in pancreatic beta cells. Diabetologia. 46 (8), 1029-1045 (2003).
  4. Takahashi, N., Kishimoto, T., Nemoto, T., Kadowaki, T., Kasai, H. Fusion pore dynamics and insulin granule exocytosis in the pancreatic islet. Science. 297 (5585), 1349-1352 (2002).
  5. Ramirez, D. M., Khvotchev, M., Trauterman, B., Kavalali, E. T. Vti1a identifies a vesicle pool that preferentially recycles at rest and maintains spontaneous neurotransmission. Neuron. 73 (1), 121-134 (2012).
  6. Michael, D. J., Xiong, W., Geng, X., Drain, P., Chow, R. H. Human insulin vesicle dynamics during pulsatile secretion. Diabetes. 56 (5), 1277-1288 (2007).
  7. Ohara-Imaizumi, M., et al. Monitoring of exocytosis and endocytosis of insulin secretory granules in the pancreatic beta-cell line MIN6 using pH-sensitive green fluorescent protein (pHluorin) and confocal laser microscopy. Biochem J. 363 (Pt 1), 73-80 (2002).
  8. Whim, M. D. Pancreatic beta cells synthesize neuropeptide Y and can rapidly release peptide co-transmitters. PLoS One. 6 (4), e19478(2011).
  9. Tsuboi, T., Rutter, G. A. Multiple forms of "kiss-and-run" exocytosis revealed by evanescent wave microscopy. Curr Biol. 13 (7), 563-567 (2003).
  10. Zhu, D., et al. Synaptotagmin I and IX function redundantly in controlling fusion pore of large dense core vesicles. Biochem Biophys Res Commun. 361 (4), 922-927 (2007).
  11. Aoki, R., et al. Duration of fusion pore opening and the amount of hormone released are regulated by myosin II during kiss-and-run exocytosis. Biochem J. 429 (3), 497-504 (2010).
  12. Felmy, F. Modulation of cargo release from dense core granules by size and actin network. Traffic. 8 (8), 983-997 (2007).
  13. Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
  14. Gandasi, N. R., et al. Survey of Red Fluorescence Proteins as Markers for Secretory Granule Exocytosis. PLoS One. 10 (6), e0127801(2015).
  15. Almaca, J., et al. Spatial and temporal coordination of insulin granule exocytosis in intact human pancreatic islets. Diabetologia. 58 (12), 2810-2818 (2015).
  16. Do, O. H., Low, J. T., Thorn, P. Lepr(db) mouse model of type 2 diabetes: pancreatic islet isolation and live-cell 2-photon imaging of intact islets. J Vis Exp. (99), e52632(2015).
  17. Hanna, S. T., et al. Kiss-and-run exocytosis and fusion pores of secretory vesicles in human beta-cells. Pflugers Arch. 457 (6), 1343-1350 (2009).
  18. Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. A practical guide to rodent islet isolation and assessment. Biol Proced Online. 11, 3-31 (2009).
  19. Weber, M., et al. Adenoviral transfection of isolated pancreatic islets: a study of programmed cell death (apoptosis) and islet function. J Surg Res. 69 (1), 23-32 (1997).
  20. Michael, D. J., et al. Fluorescent cargo proteins in pancreatic beta-cells: design determines secretion kinetics at exocytosis. Biophys J. 87 (6), L03-L05 (2004).
  21. Serre-Beinier, V., et al. Cx36 makes channels coupling human pancreatic beta-cells, and correlates with insulin expression. Hum Mol Genet. 18 (3), 428-439 (2009).
  22. Rutter, G. A., Hodson, D. J. Beta cell connectivity in pancreatic islets: a type 2 diabetes target? Cell Mol Life Sci. 72 (3), 453-467 (2015).
  23. Shen, Y., Rosendale, M., Campbell, R. E., Perrais, D. pHuji, a pH-sensitive red fluorescent protein for imaging of exo- and endocytosis. J Cell Biol. 207 (3), 419-432 (2014).
  24. Speier, S., et al. Noninvasive in vivo imaging of pancreatic islet cell biology. Nat Med. 14 (5), 574-578 (2008).
  25. Low, J. T., et al. Insulin secretion from beta cells in intact mouse islets is targeted towards the vasculature. Diabetologia. 57 (8), 1655-1663 (2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

المجهر البؤريمراسل NPY-pHluorinجزر البنكرياسالعدوى الفيروسيةتحفيز الجلوكوزالتصوير بفاصل زمنيالإثارة الفلوريةالحصول على مجموعة صور Z-stackالتصوير الوظيفي
[كنفوكل] التصوير من Neuropeptide Y-فلورين: تقنية لتصور الأنسولين الحبيبية للرقابة في الجزيرات سليمة مورين والبشرية
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.