يمكننا وصف بروتوكول للتصور للرقابة الأنسولين في الجزيرات سليمة باستخدام فلورين، بروتين فلوري أخضر حساسة لدرجة الحموضة. الجزر الصغيرة المعزولة مصابون بترميز فلورين بالإضافة إلى البضائع حويصلة neuropeptide Y إتش. وهذا يسمح للكشف عن أحداث الانصهار الحبيبية الأنسولين بالفحص المجهري [كنفوكل].
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
[كنفوكل] التصوير من Neuropeptide Y-فلورين: تقنية لتصور الأنسولين الحبيبية للرقابة في الجزيرات سليمة مورين والبشرية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
إفراز الأنسولين يلعب دوراً مركزياً في التوازن الجلوكوز في ظل الظروف الفسيولوجية العادية، فضلا عن المرض. النهج الحالي لدراسة الرقابة الحبيبية الأنسولين أما استخدام الكهربية أو مجهرية بالإضافة إلى التعبير عن الصحفيين الفلورسنت. ولكن معظم هذه التقنيات قد تم الأمثل لخطوط الخلايا الاستنساخ أو تتطلب الناي جزيرات البنكرياس. وفي المقابل، يسمح الطريقة المعروضة هنا للوقت الحقيقي التصور للأنسولين الحبيبية للرقابة في جزيرات البنكرياس سليمة. في هذا البروتوكول، يصف لنا أولاً العدوى الفيروسية من جزيرات البنكرياس المعزول مع إتش ترميز حساسة لدرجة الحموضة أخضر نيون بروتين (التجارة والنقل)، فلورين، بالإضافة إلى neuropeptide Y (نبي). وثانيا، يصف لنا [كنفوكل] التصوير من الجزيرات خمسة أيام بعد العدوى الفيروسية وكيفية مراقبة إفراز الأنسولين الحبيبية. بإيجاز، توضع على ساترة في دائرة تصوير للجزر المصابة وتصويرها تحت مجهر [كنفوكل] تستقيم المسح الضوئي الليزر بينما يجري perfused باستمرار مع الحل خارج الخلية التي تحتوي على المنبهات المختلفة. [كنفوكل] الصور التي تغطي 50 ميكرون من جزيرة ليلى تكتسب كالوقت الفاصل بين التسجيلات باستخدام ماسح ضوئي سريع رنانة. يمكن أن يتبع انصهار حبيبات الأنسولين مع غشاء البلازما على مر الزمن. هذا الإجراء يسمح لاختبار بطارية محفزات في تجربة واحدة أيضا ومتوافق مع الماوس والجزيرات البشرية، ويمكن أن تكون جنبا إلى جنب مع الأصباغ المختلفة لتصوير الوظيفية (مثلاً، غشاء الأصباغ الكالسيوم المحتملة أو سيتوسوليك).
المقدمة
يتم إنتاج الأنسولين خلايا بيتا من البنكرياس جزيرة ليلى ومنظم رئيسي الجلوكوز الأيض1. الموت أو خلل وظيفي لخلايا بيتا يخل بالتوازن السكر ويؤدي إلى مرض السكري2. هي معبأة الأنسولين في الحبيبات الكثيفة الأساسية التي يتم إصدارها في Ca2 +-تعتمد طريقة3. توضيح كيف ينظم الرقابة الحبيبية الأنسولين ضروري للفهم الكامل لما يحدد إفراز الأنسولين، ويفتح آفاقاً جديدة لتحديد أهداف علاجية جديدة لعلاج مرض السكري.
وتم درس الرقابة الأنسولين على نطاق واسع استخدام نهج الكهربية، مثل الغشاء السعة القياسات، والنهج المجهرية في تركيبة مع جزيئات الفلورسنت. غشاء السعة قياسات الأزمنة جيدة وتس....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
لجنة الأخلاقيات الحيوان من جامعة ميامي قد وافقت جميع التجارب-
1. الفيروسي العدوى سليمة معزولة الإنسان أو الماوس جزيرات البنكرياس
- ثقافة الجزيرة: إعداد وسائل الإعلام ثقافة جزيرة ليلى: كونوت طبية أبحاث المختبرات (كمرل) 1066، 10% (v/v) FBS ومم 2 لتر-الجلوتامين.
يتم الحصول على جزيرات البنكرياس
- الإنسان من "برنامج توزيع جزيرة متكاملة" (نيدك، المعاهد الوطنية للصحة). لدى وصوله، نقل الجزيرات (~ 500 جزيرة مكافئات) إلى 35 ملم غير-زراعة الأنسجة تعامل أطباق بيتري مع 2 مل كمرل ثقافة الإعلام عند 37 درجة مئوية، 5/95% CO 2 &/O 2 ل 24 ساعة قبل العدوى الفيروسية.
- الماوس جزيرات البنكرياس يمكن عزل عقب البروتوك....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
العمل كله من الأسلوب الذي يظهر في الشكل 1. بإيجاز، يمكن المصابين إتش ترميز نبي-فلورين الماوس أو الجزر البشرية وتصويرها، بعد أيام قليلة في الثقافة، تحت مجهر [كنفوكل]. حبيبات تلتحم مع غشاء البلازما وفتح، يلاحظ زيادة في الأسفار ويمكن قياسها كمياً (الشكل 1). لتحديد ما إذا كان نبي-فلورين في الواقع أداة مناسبة لرصد ديناميات الحبيبية للأنسولين، كانت الجزر المصابة إيمونوستينيد مع الأجسام المضادة ضد التجارة والنقل، وجزيرة ليلى مختلف الهرم.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
ويصف هذه المخطوطة تقنية التي يمكن استخدامها لتصور الرقابة حبيبات الأنسولين في خلايا بيتا في جزيرات البنكرياس سليمة بالفحص المجهري [كنفوكل]. فإنه يستخدم فلورين نبي كمراسل الفلورسنت المستنسخة في إتش للتأكد من كفاءة تعداء عالية.
ورغم أن الأسلوب كفاءة عالية في أيدينا، قد تتطلب بعض التعديلات التي تعتمد أساسا على معلمتين من معلمات: 1) نوعية إعداد جزيرة ليلى، وعيار 2) المخزون الفيروسية مع الاستغلال الأمثل لظروف الإصابة. قبل العدوى الفيروسية للجزر الصغيرة، السماح بإعداد جزيرة ليلى للتعافي من الإجهاد ا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ويعلن الكتاب لديهم لا تضارب المصالح المالية.
شكر وتقدير
يشكر المؤلفون مارسيا بولينا من حديد الاختزال المباشر التصوير المرافق الأساسية للحصول على مساعدة مع المجاهر. وأيد هذا العمل المعاهد الوطنية للصحة منح 1K01DK111757-01 (جا)، F31668418 (ملم)، R01 DK111538، R33 ES025673 و R56 DK084321 (AC).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| مجهر متحد البؤر للمسح بالليزر المستقيم | Leica Microsystems ، Wetzlar ، ألمانيا | TCS-SP5 | يتضمن LAS AF ، برنامج الحصول على الصور |
| غرفة التصوير | Warner | RC-26 | |
| غرفة التصوير | Warner Instruments | PH-1 | |
| 22 × 40 أغطية زجاجية Daiggerbrand | G15972H | ||
| Vacuum شحم السيليكون | Sigma | Z273554-1EA | |
| نظام التروية متعدد القنوات | Warner Instruments | VC-8 | |
| سخان حل مضمن واحد | Warner | Instruments SH-27B | |
| جهاز التحكم في درجة الحرارة | Warner | Instruments TC-324C | |
| مضخة شفط تمعجية | Pharmacia | P-1 | |
| 35 مم طبق بتري ، زراعة غير الأنسجة المعالجة | VWR | 10861-586 | |
| CMRL متوسط ، لا الجلوتامين | ThermoFisher | 11530037 | |
| FBS ، معطل بالحرارة | ThermoFisher | 16140071 | |
| L-Glutamine 200 ملي مولار | ThermoFisher | 25030081 | |
| 5 M محلول كلوريد الصوديوم | Sigma | S5150 | |
| 3M KCl حل | Sigma | 60135 | |
| 1 M CaCl 2 < / sub>solution | Sigma | 21115 | |
| 1 M MgCl 2 < / sub>solution | Sigma | M1028 | |
| مصل الأبقار الألبومين | Sigma | A2153 | |
| 1 M محلول HEPES | Sigma | H0887 | |
| مرشح فراغ | VWR | 431098 | |
| D-Glucose | Sigma | G8270 | |
| بولي د-ليسين هيدروبروميد | سيجما ألدريتش | P6407 | |
| Di-8-ANNEP | ThermoFisher | D3167 | |
| 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma | I5879 | |
| Forskolin | Sigma | F3917 |
المراجع
- Roder, P. V., Wong, X., Hong, W., Han, W. Molecular regulation of insulin granule biogenesis and exocytosis. Biochem J. 473 (18), 2737-2756 (2016).
- Rutter, G. A., Pullen, T. J., Hodson, D. J., Martinez-Sanchez, A. Pancreatic beta-cell identity, glucose sensing and the cont....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
![[كنفوكل] التصوير من Neuropeptide Y-فلورين: تقنية لتصور الأنسولين الحبيبية للرقابة في الجزيرات سليمة مورين والبشرية](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F56089.jpg&w=3840&q=75)