مقالة منهجية

في المختبر توصيف الخصائص الكهربية لألياف الزبائ Colonic في الفئران

DOI:

10.3791/56090

⸱

سبتمبر 27, 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Hongqiao International Institute of Medical Research, Tongren Hospital and Department of Physiology, Faculty of Basic Medical Sciences, Shanghai Jiaotong University School of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وظيفة حسية غير طبيعية وراء الألم الحشوي وغيرها من أعراض الأمراض الوظيفية والتهاب الأمعاء. ويرد هنا بروتوكولا لتسجيل الكهربية للأعصاب الزبائ colonic في استعداد كولوريكتوم الفئران السابقين فيفو .

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلل الوظيفي للأعصاب الحسية colonic متورط في الفسيولوجيا المرضية للعديد من الشروط المشتركة، بما في ذلك الأمراض الوظيفية والتهاب الأمعاء ومرض السكري. هنا، يمكننا وصف بروتوكول لتوصيف الخصائص الكهربية من أفيرينتس colonic في الفئران في المختبر . كولوريكتوم، مع العقدة الحوض سليمة (PG) المرفقة، يتم إزالة من الفئران؛ سوبيرفوسيد مع كاربوجيناتيد الحل كريبس في قاعة التسجيل؛ ومقني في نهايات عن طريق الفم والشرج للسماح بانتفاخ. يتم تعريف حزمة الأعصاب دقيقة النابعة من فريق البرمجة، ويتم تسجيل نشاط العصب الزبائ مولتيونيت قطب شفط باستخدام. يتسبب انتفاخ الجزء colonic زيادات تدريجية في تصريف مولتيونيت. ويجري تحليل عنصر الرئيسي التفريق عتبة المنخفضة والعالية-العتبة الألياف الزبائ دينامية واسعة المدى. يمكن دراسة حساسية أفيرينتس colonic الكيميائية من خلال إدارة المركبات اختبار حمام أو إينترالومينال. يمكن تعديل هذا البروتوكول للتطبيق على الأنواع الأخرى، مثل الفئران وخنازير غينيا، ودراسة الاختلافات في الخصائص الكهربية من أفيرينتس ما/هيبوجاستريك ولومبوساكرال/الحوض القولون تنازلي في العادي و الحالات المرضية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الجهاز الهضمي (GIT) هو معصب غنية بالاعصاب الزبائ الخارجية التي تنقل الإشارات الحسية من الأمعاء إلى الجهاز العصبي المركزي والتي تساهم في تفاعل القناة الهضمية في الدماغ. استثارة غيرت من هذه أفيرينتس الخارجية، وكذلك المعالجة المركزية غيرت المدخلات الزبائ، يكمن وراء الألم الحشوي وأعراض أخرى لظروف غي، بما في ذلك الأمراض الوظيفية والتهاب الأمعاء1. وينقل المعلومات الحسية من كولوريكتوم الدرجة الأولى من خلال ما/هيبوجاستريك و لومبوساكرال/الحوض الأعصاب (PN)2. كان هناك زيادة اهتمام بدراسة الخصائص الكهربية لهذه الألياف الزبائ الأولية في نماذج القوارض من المرض. ومع ذلك، في فيفو التسجيلات الكهربية من أفيرينتس colonic في القوارض تحديا تقنيا ويتطلب قدرا كبيرا من المهارات الجراحية. وبالإضافة إلى ذلك، قد التغييرات الفسيولوجية وحركة الأنسجة والمسكنات أيضا تؤثر على نشاط العصب وحساسية لاختبار المنشطات في فيفو. ولذلك، في السنوات الأخيرة، استخدمت عددا متزايداً من الدراسات في المختبر (السابقين فيفو) الاستعدادات من مختلف الأنواع، بما في ذلك الفئران، الجرذان وخنازير غينيا والبشر، لدراسة آليات توصيل الحسي في colonic أفيرينتس واستثارة غيرت في ظروف المرض. 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8

وأفيد أساسا نوعين من إعداد colonic السابقين فيفو :9،،من5إعداد "ورقة مسطحة"10 و3،4إعداد "الأنبوب". وكان بروتوكول فيديو لإعداد "ورقة مسطحة" كولوريكتوم موريني المنشورة سابقا11. في هذا البروتوكول، كولوريكتوم الماوس، مع PN) أو سبلانتشنيك الأعصاب القطنية (LSN) المرفقة، المقطوع وسوبيرفوسيد في غرفة لانسجة. كولوريكتوم هو قطع مفتوحة طوليا، ويتم توسيع الحزمة العصبية في حجرة تسجيل مملوءة بزيت البارافين. يتم تسجيل نشاط العصب استخدام قطب البلاتين الايريديوم أحادي القطب. يسمح البروتوكول للتعرف على مجالات تقبلا من ألياف الزبائ الفردية باستخدام التحفيز الكهربائي غير متحيزة. أنه يموضع تطبيق المحفزات الكيميائية، وكذلك تطبيق نماذج مختلفة من التحفيز الميكانيكية (مثل تنسيق المخاطية السبر وتمتد كفافى)، إلى النهايات العصبية الزبائ. لأنه يجب أن تمدد العصب إلى غرفة منفصلة من قاعة النسيج، من الأهمية بمكان للحفاظ على العصب المرفقة طويلة نسبيا؛ تشريح ناجحة للأعصاب يشكل تحديا لأولئك جديدة لهذه المنهجية. في الآونة الأخيرة، نشرت نلينس et al. بروتوكول فيديو للتسجيل في المختبر أفيرينتس المساريقي العلوي في jejunal مورين وشرائح colonic12. في هذا الإعداد "أنبوب"، يتم الاحتفاظ الجزء الغريزي مع مساريق المرفقة سليمة، وبالتالي السماح لانتفاخ متدرج ولومينال داخل وخارج إدارة المواد الكيميائية المختلفة. منذ العصب مساريق يتم تسجيلها باستخدام قطب كهربائي شفط، الذي يمكن وضعه قريبا من الأنسجة، يمكن تسجيل النشاط الزبائ حتى ولو العصب مساريق قصيرة نسبيا. إلا أن العصب مساريق يتكون من المختلطة السكان من ألياف الزبائ تحفيزه والعمود الفقري الذي يعصب الصائم أو ما هيبوجاستريك. أفيرينتس الحوض Lumbosacral يعصب كولوريكتوم، الذي لا يميز في هذا البروتوكول. نقدم هنا، بروتوكول مفصل لتسجيل الكهربية أفيرينتس colonic الفئران باستخدام إعداد كولوريكتوم "أنبوب" مع صفحة سليمة قد يسمح هذا الأسلوب لتوصيف الخصائص الوظيفية قطني سبلانتشنيك (هيبوجاستريك) والحوض أفيرينتس لومبوساكرال.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قد أقرها البروتوكول التجريبي ذكرت هنا "الحيوان الأخلاقية اللجنة من شانغهاي جياوتونغ كلية الطب بجامعة" (# SYXK2013-0050). التشريح كولوريكتوم مع العقدة سليمة والعصبية جذع يأخذ الحد أدنى من 15 دقيقة لشخص تماما من ذوي خبرة في هذا الأسلوب. ولذلك من الضروري للحفاظ الحيوانات ولكن على قيد الحياة تحت التخدير العميق حين إجراء تشريح، ضمان بقاء الأنسجة لتسجيل الكهربية اللاحقة-

1-إعداد الحل نضح واختبار المركبات

  1. ل 5 إعداد حل كريبس: 113 ملم كلوريد الصوديوم، 5.9 ملم بوكل، 1.2 مم نة 2 بو 4 و 1.2 مم MgSO 4، 25 مم ناكو 3، 1.2 مم كاكل 2 ، والجلوكوز 11.5 ملم. تشبع الحل مع 95% س 2 + 5% CO 2 الغاز المخلوط. قبل بارد ~ 500 مل من اﻷوكسيجين كريبس في الثلاجة.
  2. تحضير مختبرين للأسهم اختبار المركبات (كبخاخات 1 مم في الإيثانول وملم 10 5-هيدروكسيتريبتاميني (5-HT) في المحلول الملحي) حسب الحاجة. تمييع المخزون في كريبس (لتطبيق حمام) وفي المياه المالحة (للإدارة إينترالومينال) بتركيز نهائي مسبق فقط لاستخدام-

2. إعداد تسجيل القطب

  1. سحب أنابيب مسرى التسجيل من الزجاج القياسية دون خيوط داخلية (1.5 مم القطر الخارجي) استخدام ساحبة كهربائي تقليدية. ضبط إعدادات ساحبة للحرارة وسحب حيث يكون عرقوب أقطاب سحبت بين 20 و 25 مم-

3. جمع الأنسجة

  1. تخدير الفئران عميقا باستخدام الصوديوم بينتوباربيتال (80 ملغ/كغ، والقائمة).
  2. مع ضمان العقم، كشف التجويف البطني عن طريق إجراء شق خط الوسط في جدار البطن باستخدام مشرط. سحب مساريق والأنسجة الأخرى جانبا للكشف كولوريكتوم-
  3. وضع الحيوان تحت مجهر تشريح. من خلال تشريح دقيق، حدد موقع PG الأيسر وتحديد PN و LSN الانضمام إليها. قطع هذه الأعصاب بضعة ملليمترات بعيداً عن الصفحة
    ملاحظة: يكمن PG القرب من مفرق القولون والمستقيم. بشكل عام، 3-4 PN من الحبل الشوكي لومبوساكرال ومشروع LSN للتعبئة ( الشكل 1).
  4. قص عظم الارتفاق لفضح المستقيم. إزالة الأنسجة (أي، المثانة البولية، إلخ.) أعلاه كولوريكتوم؛ احرص على حالها في س.
  5. التضحية الفئران عن طريق الحقن الوريدي من جرعة زائدة من بينتوباربيتال. قطاع القولون حوالي 3 سم فوق الغرام وإزالة كولوريكتوم من الحيوان باستخدام الملقط.
    6. نقل
  6. كولوريكتوم إلى طبق بتري مليئة يبرد قبل كريبس الحل. قم بإزالة البراز بالتنظيف بلطف القولون. إزالة بقايا المثانة البولية والأنسجة الأخرى بعناية، دون المساس الصفحة

4. تشريح الأعصاب الزبائ Colonic

  1. مكان القولون في دائرة تسجيل (20 مل) ونتخلل الأنسجة بشكل مستمر مع كاربوجيناتيد الحل كريبس. تعيين معدل التروية في 15 مل/دقيقة
  2. كانولاتي كولوريكتوم في كلا من طرفي الفم والشرج. بدء ضخ إينترالومينال من القولون مع المحلول الملحي بمعدل 10 مل/ساعة في الفم باتجاه الشرج.
  3. موقع PG الرئيسية تحت مجهر تشريح. استخدام دبابيس الحشرات لفضح العقدة. مع تشريح دقيق، العثور على فرع جيد للأعصاب المنبثقة من العقدة ويركض نحو القولون ( الشكل 1). قطع العصب قريبة من العقدة.
    ملاحظة: يوضح الشكل 1 تسجيل من فرع عصب القاصي لصفحة يفترض أن يحتوي العصب على خليط ألياف الزبائ splanchnic الحوض وأسفل الظهر. وبدلاً من ذلك، يمكن إجراء تسجيل من PN و/أو LSN الدانية للصفحة
  4. قم بتشغيل تدفئة الحمام والحارة الحل كريبس للحفاظ على درجة حرارة الغرفة في 34 ± 0.5 درجة مئوية.

5. إعداد "مسرى شفط"

  1. تأخذ ماصة زجاجية سحبت مسبقاً (الخطوة 2) وأن تفقد تحت مجهر تشريح. كسر غيض مسرى مع زوج من الملقط حيث أنها متوافقة مع قطر العصب أن يسجل حجم.
  2. مجسم مشطوف الحواف التلميح بوضعه قريبا من توهج أخف.

6. تسجيل الكهربية

  1. الاتصال الكهربائي مشطوف الحواف لصاحب القطب. الاتصال حقنه 10 مل بالجانب المنفذ على حامل لتطبيق الضغط السلبي أو الإيجابي على مسرى.
  2. الاتصال الحامل هيدستاجي بيوامبليفير وجبل هيدستاجي على مناور.
  3. الانتقال الكهربائي لحمام الأنسجة وملء مسرى مع الحل كريبس بتطبيق الشفط لطيف حتى أنها تجري اتصالات الأسلاك الفضية حامل. ضع طرف قطب كهربائي قريب من نهاية قطع العصب وتطبيق ضغط سالب لامتصاص العصب إلى مسرى. تطبيق الضغط السلبي أكثر بحيث يتم سحبها إلى مسرى ~ 1 مم للعصب وأشكال ختم ضيق.
  4. بدوره على بيوامبليفير وتعيين عامل التصفية إلى 300 3,000 هرتز. رصد الإشارة على الذبذبات وتسجيل إشارة العصب (معدل أخذ العينات 20 كيلوهرتز) وإشارة الضغط intraluminal (معدل أخذ العينات 100 هرتز) باستخدام جهاز كمبيوتر مع تجهيز بيانات سبايك برامج.

7. اختبار حساسية الزبائ Colonic

  1. تطبيق منحدر انتفاخ القولون عن طريق إغلاق الصنبور الثلاثية في قنية منفذاً بينما غرس إينترالومينالي باستمرار. مراقبة الضغط إينترالومينال حتى يصل إلى 60 مم زئبق، في الوقت الذي فتح الصنبور الثلاثية في قنية استنزاف.
  2. كرر هذا الإجراء على فترات منتظمة من المخدرات تطبيق 15 دقيقة إضافية-أو إينترالومينالي لاختبار حساسية الأعصاب الزبائ الكيميائية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويمثل الشكل 1 التخطيطي الرسم التوضيحي للإعداد التجريبية لإعداد كولوريكتوم السابقين فيفو "أنبوب"، مع ممثل للصفحة تسجيل من العصبية القاصي يفترض أن يتضمن العصب خليط أفيرينتس سبلانتشنيك الحوض وأسفل الظهر. الأعصاب الزبائ colonic في الأعمال التحضيرية من الفئران العادية، وعادة ما يكون مستوى منخفض من النشاط العفوي غير النظامية. منحدر انتفاخ القولون الحث على زيادة تدريجية في معدل إطلاق النار (الشكل 1B). يتم تمثيل الخاصية ميتشانوس...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البروتوكول المعروضة هنا أسلوب تجريبي بسيط نسبيا لتقييم الخصائص الكهربية من أفيرينتس colonic من الفئران. البروتوكول (من تشريح الأنسجة بإعداد تسجيل العصب) عادة ما يستغرق حوالي 2 ساعة لإكمال. جمع الأنسجة (الخطوة 3) وإعداد مسرى الشفط (الخطوة 5) هي الخطوات الحاسمة. من الأهمية بمكان أن تكون قادراً على تحديد موقع فريق البرمجة و LSN PN والحرص على عدم الأضرار بالعقدة والأعصاب أثناء تشريح الأنسجة. ويجب كسر غيض ماصة زجاجية ومشطوف إلى حجم متوافق مع حزمة الأعصاب.

الإعداد قابلاً عادة لعدة ساعات، مما يسمح لل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب يعلن لا تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذا البروتوكول المنح البحثية "الوطنية العلوم الطبيعية مؤسسة في الصين" (#31171066, #81270464) ومركز العلوم الصينية-الألمانية (GZ919).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الصوديوم Pentobarbitalشنغهاي Westang Bio-TechB558
CapsaicinSigmaM2028
مجتذب القطبMicroData Instrument IncPMP107
نظام Neurolog (Bioamplifier)Digitimer، Ltdنظام
A / Dمحول كامبريدج للتصميم الإلكترونيMicro1401
برنامج معالجة البياناتكامبريدج للتصميم الإلكترونيSpike2 الإصدار 6
سلك فضيللأدوات الدقيقة العالميةEP12
أنابيب زجاجية أدواتالدقة العالمية1B150-4
حامل قطبكهربائي World Precision InstrumentsMEH3SBW
HeatingBath GrantGR150
تشريح المجهرLeicaZoom2000
تشريح المجهرالعالم الدقة الأدواتPZMIII-BS
ولاعة السجائرأيNA
أدوات جراحيةالعالم أدوات الدقةNA
دبابيس الحشراتمحلية الصنع من 0.1 مم من أسلاك الفولاذ المقاومللصدأ NA
مناورثلاثي الاتجاهاتأدوات الدقة العالميةKITF-R
RatsأيNAيمكن استخدام أي سلالة / جنس.
Neurolog

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Al-Chaer, E. D., Traub, R. J. Biological basis of visceral pain: recent developments. Pain. 96 (3), 221-225 (2002).
  2. Christianson, J. A., Traub, R. J., Davis, B. M. Differences in spinal distribution and neurochemical phenotype of colonic afferents in mouse and rat. J Comp Neurol. 494 (2), 246-259 (2006).
  3. Wynn, G., Rong, W., Xiang, Z., Burnstock, G. Purinergic mechanisms contribute to mechanosensory transduction in the rat colorectum. Gastroenterology. 125 (5), 1398-1409 (2003).
  4. Dong, L., et al. Impairments of the Primary Afferent Nerves in a Rat Model of Diabetic Visceral Hyposensitivity. Mol Pain. 11, (2016).
  5. Lynn, P. A., Blackshaw, L. A. In vitro recordings of afferent fibres with receptive fields in the serosa, muscle and mucosa of rat colon. J Physiol. 518 (Pt 1), 271-282 (1999).
  6. Page, A. J., et al. Different contributions of ASIC channels 1a, 2, and 3 in gastrointestinal mechanosensory function. Gut. 54 (10), 1408-1415 (2005).
  7. Hockley, J. R., et al. P2Y Receptors Sensitize Mouse and Human Colonic Nociceptors. J Neurosci. 36 (8), 2364-2376 (2016).
  8. Peiris, M., et al. Human visceral afferent recordings: preliminary report. Gut. 60 (2), 204-208 (2011).
  9. Feng, B., Gebhart, G. F. Characterization of silent afferents in the pelvic and splanchnic innervations of the mouse colorectum. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 300 (1), G170-G180 (2011).
  10. Feng, B., et al. Activation of guanylate cyclase-C attenuates stretch responses and sensitization of mouse colorectal afferents. J Neurosci. 33 (23), 9831-9839 (2013).
  11. Feng, B., Gebhart, G. F. In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings. J Vis Exp. (95), e52310(2015).
  12. Nullens, S., et al. In Vitro Recording of Mesenteric Afferent Nerve Activity in Mouse Jejunal and Colonic Segments. J Vis Exp. (116), (2016).
  13. Rong, W., Hillsley, K., Davis, J. B., Hicks, G., Winchester, W. J., Grundy, D. Jejunalafferent nerve sensitivity in wild-type and TRPV1 knockout mice. J Physiol. 560 (Pt 3), 867-881 (2004).
  14. Brierley, S. M., et al. Differential chemosensory function and receptor expression of splanchnic and pelvic colonic afferents in mice). J Physiol. 567 (Pt 1), 267-281 (2005).
  15. Brierley, S. M., Jones, R. C. 3rd, Gebhart, G. F., Blackshaw, L. A. Splanchnic and pelvic mechanosensory afferents signal different qualities of colonic stimuli in mice. Gastroenterology. 127 (1), 166-178 (2004).
  16. La, J. H., Schwartz, E. S., Gebhart, G. F. Differences in the expression of transient receptor potential channel V1, transient receptor potential channel A1 and mechanosensitive two pore-domain K+ channels between the lumbar splanchnic and pelvic nerve innervations of mouse urinary bladder and colon. Neuroscience. 186, 179-187 (2001).
  17. Wang, G., Tang, B., Traub, R. J. Differential processing of noxious colonic input by thoracolumbar and lumbosacral dorsal horn neurons in the rat. J Neurophysiol. 94 (6), 3788-3794 (2005).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة