يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

في فيفو كشف وتحليل م ع سومويليشن البروتين في الخلايا البشرية

6.8K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/56096

⸱

نوفمبر 2, 2017

 ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, Eye and ENT Hospital of Fudan University, 2Shanghai Key Laboratory of Visual Impairment and Restoration, Fudan University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

يتم مترافق البروتينات الأسرة الصغيرة المتصلة ubiquitin المعدل (سومو) للمخلفات يسين من البروتينات المستهدفة لتنظيم مختلف العمليات الخلوية. وتصف هذه الورقة وضع بروتوكول للكشف عن البروتين الشبكية (الميزانية العادية) سومويلاتيون في ظل الظروف الداخلية والخارجية في الخلايا البشرية.

الملخص

تعديلات بوستترانسلاشونال للبروتينات حاسمة بالنسبة للتنظيم السليم لتوصيل الإشارة داخل الخلايا. بين هذه التعديلات، الصغيرة المتصلة ubiquitin المعدل (سومو) هو بروتين ubiquitin مثل تساهمي المرتبط ببقايا يسين من مجموعة متنوعة من البروتينات المستهدفة لتنظيم العمليات الخلوية، مثل النسخ الجيني وإصلاح الحمض النووي والبروتين التفاعل والتدهور والنقل سوبسيلولار وتوصيل الإشارة. ويستند النهج الأكثر شيوعاً للكشف عن البروتين سومويليشن التعبير وتنقية البروتينات المعلمة المؤتلف في البكتيريا، مما يسمح في المختبر بيوكيميائية فعل وبسيطة وملائمة لمعالجة ميكانيكية الأسئلة. ومع ذلك، نظراً لتعقد عملية سومويلاتيون في فيفو، أنها أكثر تحديا لكشف وتحليل البروتين سومويلاتيون في الخلايا، وخاصة عندما تكون تحت الظروف الذاتية. كشف دراسة حديثة أجراها أصحاب هذه الورقة أن الشبكية الذاتية (الميزانية العادية) البروتين، القامع ورم أمر حيوي لتنظيم السلبية لتطور دورة الخلية، سومويلاتيد على وجه التحديد في المرحلة G1 المبكر. وتصف هذه الورقة وضع بروتوكول لكشف وتحليل "الميزانية العادية سومويليشن" في ظل الظروف الداخلية والخارجية على حد سواء في الخلايا البشرية. هذا البروتوكول مناسبة للتحقيق الشكلية والوظيفية في السومو-تعديل الميزانية العادية، فضلا عن العديد من استهداف سومو البروتينات الأخرى، في الخلايا البشرية.

المقدمة

مراقبة دقيقة لتطور دورة الخلية في الخلايا حقيقية النواة يستند إلى شبكة تنظيمية ضيقة، مما يضمن أن أحداث معينة تجري طريقة مرتبة1،2. واحد من اللاعبين الرئيسيين في هذه الشبكة هو البروتين الشبكية (الميزانية العادية)،1،القامع الورم المستنسخة الأولى3. البروتين Rb يعتقد أن منظم سلبية لتطور دورة الخلية، لا سيما بالنسبة G0/G1 S المرحلة الانتقالية، والورم النمو4،5. فشل الدالة Rb أما مباشرة يؤدي إلى خبيثة اللاصقة الأكثر شيوعاً في الأطفال، والشبكية، أو يساهم في تطوير العديد من أنواع أخرى من السرطان5. وعلاوة على ذلك، تشارك في العديد من المسارات الخلوية بما في ذلك الخلية التمايز، الكروماتين يعيد البناء، والمبرمج بوساطة الميتوكوندريا3،،من67الميزانية العادية.

تعديلات بوستترانسلاشونال تلعب دوراً محوريا في تنظيم الميزانية العادية وظيفة8،9. الفسفرة واحد مثل هذا التعديل، وأنه يؤدي عادة إلى المنظمة الممولة من الميزانية العادية. في هادئة G0 الخلايا، الممولة من الميزانية العادية بنشاط مع مستوى منخفض الفسفرة. كما خلايا التقدم من خلال مرحلة G0/G1، الميزانية العادية التتابع فرط--فوسفوريلاتيد سلسلة من مؤنزم cyclin تعتمد على البروتين (كدكس) وسيكلينس، مثل cyclin E/CDK2 و cyclin د/CDK4/6، الذي يعطل Rb والقضاء على قدرتها على قمع دورة الخلية المتعلقة بالجينات التعبير4،10. يمكن أيضا تعديل الميزانية العادية بمعدل المتصلة ubiquitin الصغيرة (سومو)11،،من1213.

سومو هو بروتين ubiquitin مثل تساهمي المرتبط بمجموعة متنوعة من البروتينات المستهدفة. من الأهمية بمكان للعمليات الخلوية المتنوعة، بما في ذلك تنظيم دورة الخلية، والنسخ، والبروتين الخلوي التعريب وتدهور، والنقل والحمض النووي الإصلاح14،،من1516، 17 , 18-مسار التصريف "سومو" يتكون من الإنزيم تفعيل E1 سومو ديميريك SAE1/UBA2، واحد E2 التصريف الإنزيم Ubc9 ومتعددة E3 ligases والبروتياز سومو على حدة. عموما، يجب معالجة الوليدة سومو البروتينات بروتيوليتيكالي لتوليد شكل ناضج. تنشيط بواسطة هيتيروديمير E1 سومو ناضجة وثم نقل إلى E2 الإنزيم Ubc9. أخيرا، هو تساهمي مترافق جليكاين ج--المحطة الطرفية من السومو إلى يسين المستهدفة من الركازة، ومما ييسر هذه العملية عادة ب E3 ligases. يمكن إزالة البروتين السومو من الركازة معدلة من البروتياز محددة. وقد كشفت دراسة سابقة بواضعي هذه الورقة أن "سومويلاتيون م ع" الزيادات الملزمة بأن CDK2، مما يؤدي إلى فرط الفسفرة في المرحلة G1 المبكر، هي عملية ضرورية ل تقدم دورة الخلية13. كما أثبتنا أن فقدان "سومويليشن م ع" أسباب تكاثر خلية انخفض. وعلاوة على ذلك، أنه اتضح مؤخرا أن يحمي سومويليشن Rb البروتين Rb من proteasomal دوران، مما يزيد من مستوى الميزانية العادية البروتين في خلايا19. ولذلك، سومويليشن دوراً هاما في وظيفة الميزانية العادية في مختلف العمليات الخلوية. لمزيد من الدراسة نتيجة الوظيفية والفسيولوجية أهمية "سومويليشن الميزانية العادية"، من المهم تطوير وسيلة فعالة لتحليل حالة السومو من الميزانية العادية في الخلايا البشرية أو أنسجة المريض.

سومويليشن عملية ديناميكية للغاية، وعكسها. وبالتالي، من الصعب عادة لكشف البروتينات سومو تعديل الظروف الذاتية تماما. وتعرض هذه الورقة طريقة لاكتشاف الذاتية "م ع سومويليشن". وعلاوة على ذلك، فإنه يوضح كيفية الكشف عن خارجية "سومويلاتيون م ع" م ع البرية من نوع و الطفرات السومو التي تفتقر إلى11. على وجه الخصوص، وصف جاكوبس et al. أسلوب لزيادة تعديل سومو الركازة معين على وجه التحديد بتوجه الانصهار Ubc9 سومويلاتيون (UFDS)20. استناداً إلى هذا الأسلوب، يصف هذا البروتوكول كيفية تحليل سومويلاتيون القسري "من الميزانية العادية" وآثارها الفنية. نظراً لأن مئات ركائز سومو قد وصفت سابقا وتم تحديد أكثر من ركائز سومو المفترضة من العديد من الاختبارات المستندة إلى البروتين، يمكن تطبيق هذا البروتوكول على تحليل السومو-تعديل هذه البروتينات في الخلايا البشرية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1-"الكشف عن سومويلاتيون م ع الذاتية" في مرحلة مبكرة G1

  1. الخلية المزامنة الثقافة ودورة الخلية.
    1. HEK293 الحفاظ على الخلايا في النمو المتوسطة التي تحتوي على دولبيكو ' s التعديل النسر المتوسطة (دميم) وتستكمل مع 1% بكتيريا القلم و 10% الجنيني البقري المصل (FBS) في 37 درجة مئوية و 5% CO 2 في حاضنة.
      2. مزامنة
    2. الخلايا HEK293 في مرحلة G0.
      1. عدد الخلايا HEK293 باستخدام ~1.5 x 10 هيموسيتوميتير والبذور 7 خلايا في 15 سم طبق مع 25 مل النمو المتوسط ل 24 ساعة قبل العلاج. بعد التوصل إلى مجموعة من 70% إلى 80%، أسبيراتي المتوسطة وغسل الخلايا مرتين مع 5 مل بريوارميد مخزنة الفوسفات المالحة (PBS).
      2. إضافة 25 مل دميم التي تحتوي على 1% البنسلين والستربتوميسين واحتضان الخلايا في 37 درجة مئوية ل 72 h. تغسل الخلايا خارج اللوحة باستخدام برنامج تلفزيوني المثلج مل 3. نقل الخلايا في أنبوب مل 5 جديدة-
      3. رهنا بجزء صغير من خلايا تحليل دورة الخلية بالتدفق الخلوي (الخطوة 1، 2)؛ وجمع غالبية الخلايا المتبقية بالطرد المركزي في 200 غ س لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، وثم تخزينها في الثلاجة الترا-انخفاض درجة حرارة حتى التحليل من سومويليشن م ع.
    3. للحصول على المرحلة G1 الخلايا، في نهاية عملية المزامنة G0، إزالة دميم وإضافة المتوسطة النمو مرة أخرى جديدة، مما يسمح للخلايا HEK293 لإعادة إدخال دورة الخلية. ثم جمع الخلايا في مراحل مختلفة من G1 (G1 المبكر: 30 دقيقة؛ G1: ح 2) لدورة الخلية تحليل وكذلك سومو الاعتداء.
      4. مزامنة
    4. الخلايا HEK293 إلى المرحلة S باستخدام الأسلوب كتلة thymidine مزدوجة. الخلايا
      1. HEK293 تنمو خلايا إلى كونفلوينسي نسبة 50% والمياه والصرف الصحي مع برنامج تلفزيوني بريوارميد. ثم أضف المتوسطة النمو وتستكمل مع thymidine 2.5 ملم ح 18 (الخانة الأولى)-
      2. إزالة المتوسطة المحتوية على thymidine ومن ثم تغسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني بريوارميد. إضافة المتوسطة النمو الطازجة ح 14 بالإفراج عن الخلايا.
      3. تجاهل المتوسطة مع ماصة وإضافة النمو المتوسطة وتستكمل مع thymidine 2.5 ملم لآخر ح 18 (الخانة الثانية) قبل إجراء تحليل لدورة الخلية و "الميزانية العادية سومويليشن".
    5. التزامن G2/M، لوحة ~1.5 × 10 7 HEK293 الخلايا إلى طبق 15 سم مع 25 مل النمو المتوسط ح 24. قم بإضافة نوكودازولي إلى المتوسط حتى يتم الحصول على تركيز نهائي من 400 نانوغرام/مليلتر. وأخيراً، احتضان الخلايا ح 16 قبل إجراء تحليل دورة الخلية و "سومويلاتيون م ع".
  2. تحليل دورة الخلية بالتدفق الخلوي-
    1. إعادة تعليق HEK293 متزامنة في برنامج تلفزيوني، ومن ثم إصلاحها تعليق خلية مستخدماً المثلج 70% إيثانول ح 2 4 درجة مئوية. لاحظ أنه للتقليل إلى أدنى حد تقسيم الخلية، إضافة تعليق خلية dropwise إلى الإيثانول 100% المثلج للحصول على تركيز نهائي ل إيثانول 70% بينما بلطف فورتيكسينج.
    2. الطرد المركزي الخلايا لمدة 5 دقائق في 500 x ز، ثم بعناية تجاهل المادة طافية وغسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني. كرر هذه الخطوة للطرد المركزي-
    3. إضافة 500 ميليلتر برنامج تلفزيوني يحتوي على 50 ميكروغرام/مل الحمض النووي وصمة عار يوديد propidium، 0.1% تريتون X-100 و 1 ميكروغرام/مل رناسي A في الخلايا، ومزيج جيد. احتضان الخلايا لمدة 15 دقيقة في 37 درجة مئوية.
    4. تخزين العينات في 4 درجات مئوية حتى التحليل عن طريق التدفق الخلوي-
  3. إيمونوبريسيبيتيشن الذاتية Rb البروتين. ليساتيس
    1. تحضير HEK293 الخلية.
      1. الخلايا HEK293 متزامنة بلطف إعادة تعليق لهم في 1 مل إيمونوبريسيبيتيشن راديو المثلج المقايسة (ريبا) تحلل المخزن المؤقت (الجدول 1) التي تتضمن طازجة إضافة 20 مم ن-اثيلماليميدي، مثبطات إيسوبيبتيداسي التي يمكن أن كتلة البروتياز السومو واستقرار يصرف السومو.
      2. كذلك تجانسه الخلايا على الجليد بتجانس دونس أو سونيكيشن أو ببساطة يمر عبر 10 مرات من خلال إبرة ز 21 يعلق على حقنه 2 مل. ثم احتضان الخلايا على الجليد للحد الأدنى 5
        ملاحظة: الصوديوم المنظفات أنيونى دوديسيل كبريتات (الحزب الديمقراطي الصربي) في المخزن المؤقت للمعهد الملكي أمر حاسم لتحديد لاحقة من الميزانية العادية-سومو، كما أنها يمكن أن تقضي على الإشارة غير محدد سومو مشتقة من التفاعل غير التساهمية بين البروتين الميزانية العادية وأخرى سومو-الأنواع غير العادية-
    2. الطرد المركزي ليساتيس الخلية في ز س 18,000 لمدة 30 دقيقة على 4 درجة مئوية. نقل سوبيرناتانتس إلى 1.5 مل الصغير-الطرد المركزي أنابيب جديدة.
      ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا. ويمكن تخزين البروتينات في-80 درجة مئوية لمدة 6 أشهر على الأقل.
    3. لإعداد عنصر تحكم الإدخال لكل عينة لوصمة عار الغربية لاحقاً، حفظ جزء صغير من المادة طافية الموصوفة أعلاه بأنبوب جديد ومخزن في-80 درجة مئوية.
    4. إلى supernatants أعلاه، أضف ميكروغرام 1 من الماوس غير محددة غلوبيولين مناعي G (IgG) من نفس الأنواع وايستب كجسم Rb [مونوكلونل]، و 20 ميليلتر من الملاط A/G-سيفاروسي البروتين 50%. ثم احتضانها ح 1 في 4 درجات مئوية مع تناوب لطيف.
    5. الطرد المركزي هذه العينات في 3,000 س ز لمدة 3 دقائق على 4 ° "جيم بعناية" جمع supernatants دون إزعاج الخرز، وتحويلها إلى 1.5 مل الصغير-الطرد المركزي أنابيب جديدة. لكل من العينات، إضافة 5 ميليلتر م ع جسم الأولية وميليلتر 40 50% بروتين الملاط A/G-سيفاروسي. ثم احتضانها بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية مع تناوب لطيف.
    6. جمع الخرز بالطرد المركزي في 3,000 س ز لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية، وإزالة المادة طافية بعناية قبل بيبيتينج. لاحظ أنه لتفادي فقدان حبة، لا نضح الجاف الخرز.
      7. أغسل
    7. الخرز أربع مرات مع 1 مل من المخزن المؤقت ريبا. كل مرة، ومزج الأنابيب جيدا بالتناوب عليها في 4 درجات مئوية عن 15 دقيقة جمع الخرز بانخفاض سرعة الطرد المركزي في س 3,000 ز لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية وتجاهل ثم سوبيرناتانتس-
    8. بعد إزالة سوبيرناتانتس من الغسيل النهائي، إعادة تعليق الخرز في 30 ميليلتر 1 × الصوديوم دوديسيل كبريتات-polyacrylamide هلام استشراد (الحزب الديمقراطي الصربي صفحة) تحميل المخزن المؤقت (الجدول 1)، ومزيج جيد.
      1. إينكوباتي كتلة الأنابيب عند 100 درجة مئوية في حرارة للحد الأدنى 10 العينات في 12,000 س ز لمدة 1 دقيقة بيليه الخرز الطرد المركزي. عناية جمع supernatants دون إزعاج الخرز، وتحويلها إلى 1.5 مل الصغير-الطرد المركزي أنابيب.
    9. الغربية وتحليل العينات من 4% إلى 20% التدرج الحزب الديمقراطي الصربي صفحة جل لطخة أو تخزينها في-20 درجة مئوية لاستخدامها في وقت لاحق.

2. تحليل لمعلم 6XHis "سومويليشن م ع الخارجية" في "الخلايا البشرية"

  1. خلية الثقافة وتعداء- طبق
    1. البذور ~ 6 × 10 6 HEK293 الخلايا في 10 سم واحتضانها ل 24 ساعة في المتوسط النمو تحت ظروف ثقافة الخلية العادية للحصول على خلايا المتلاقية 75-85%. قبل تعداء، إزالة المتوسطة النمو وإضافة 6 مل من المصل انخفاض بريوارميد المتوسطة (انظر الجدول للمواد) ثم ضع الأطباق العودة إلى الحاضنة.
    2. الإنزيم سومويلاتيون التأسيسي "للميزانية العادية"، إضافة 15 ميكروغرام في كل معلم 6XHis Rb-Ubc9-WT والميزانية العادية-Ubc9-C93S، Ubc9-WT ووالبلازميدات Ubc9-C93S في 500 ميليلتر المصل انخفاض المتوسط في أنابيب 1.5 مل مايكرو--أجهزة الطرد المركزي، على التوالي.
      1. لتحليل السومو-تصريف البرية نوع الميزانية العادية ولها متحولة معيبة سومويلاتيون، خلط 10 ميكروغرام لأي معلم 6XHis Rb-WT أو K720R م ع بلازميد جنبا إلى جنب مع التجارة والنقل-SUMO1 (10 ميكروغرام) خفضت في 500 ميليلتر المتوسطة المصل في 1.5 مل مايكرو--أجهزة الطرد المركزي 13-الأنابيب-
    3. وفي الوقت نفسه، في أنبوب منفصل، مزيج 50 ميليلتر تعداء كاشف (انظر الجدول للمواد) خفضت في 500 ميليلتر المتوسطة المصل، واحتضان في درجة حرارة الغرفة للحد الأدنى 5
    4. تماما الجمع بين أنابيب منفصلة اثنين المذكورة أعلاه، واحتضان في درجة حرارة الغرفة 15 دقيقة إضافة تعداء لمجمعات الكاشف/بلازميد إلى الخلايا وتواصل الثقافة 8 h الساعة 5% CO 2 و 37 درجة مئوية
    5. استبدال المتوسطة المصل انخفاض متوسط النمو، واحتضان الخلايا تحت ظروف طبيعية الثقافة ح 48 بعد تعداء-
  2. النيكل تقارب هدم البروتين Rb معلم 6XHis.
    1. Transfected الخلايا HEK293 واستخراج البروتينات الكلية كقسم وصف 1.3.1.
      2. °
    2. الطرد المركزي ليساتيس الخلية في ز س 18,000 لمدة 30 دقيقة في 4 "جيم بعناية" جمع في supernatants وتحويلها إلى أنابيب نظيفة.
      ملاحظة: يمكن تجميد البروتين عند هذه النقطة لأكثر من 6 أشهر في-80 درجة مئوية.
    3. لإعداد عنصر تحكم الإدخال لكل عينة لوصمة عار الغربية لاحقاً، قم بحفظ جزء صغير من سوبيرناتانتس الموصوفة أعلاه إلى أنبوب جديد ومخزن في-80 درجة مئوية.
    4. يغسل 25 ميليلتر من 50% نيكل (ني-جاتا) حمض نيتروتراياكتيك [اغروس] الخرز مع المخزن المؤقت ريبا مرتين في أنبوب مايكرو--أجهزة الطرد مركزي 1.5 مل لكل عينة. جمع الخرز بالطرد المركزي في 3,000 س ز لمدة 3 دقائق على 4 درجة مئوية.
    5. ايميدازول إضافة 1 م لكل نموذج للحصول على تركيز نهائي 10 ملم. ثم إضافة كل عينة إلى الأنبوب الذي يحتوي على الخرز [اغروس] ني-جاتا استعداد.
    6. احتضان الخرز وليساتيس ح 2 في 4 درجات مئوية مع تناوب لطيف. تدور الخرز في 3,000 س ز لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية، وإزالة بعناية في supernatants بيبيتينج. لتجنب فقدان حبة، لا نضح الجاف الخرز.
      7. أغسل
    7. الخرز مع 1 مل من يغسل المخزن المؤقت الذي يحتوي على 20 مم ايميدازول (الجدول 1). كل مرة، ومزج الأنابيب جيدا بالتناوب في 4 درجات مئوية عن 15 دقيقة جمع الخرز بالغزل في 3,000 س ز لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية، وتجاهل سوبيرناتانتس-
    8. بعد الغسيل النهائي، إضافة 30 ميليلتر من شطف العازلة التي تحتوي على 250 ملم ايميدازول (الجدول 1) لكل عينة ونفض الغبار إلى المزيج. ثم احتضانها لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية الوتي البروتينات.
      9. مزيج
    9. كل عينة مع 6 × الحزب الديمقراطي الصربي صفحة تحميل المخزن المؤقت (الجدول 1). ثم احتضان هذه الأنابيب عند 100 درجة مئوية في كتلة حرارة للحد الأدنى 10
    10. الطرد المركزي في س 12,000 ز لمدة 1 دقيقة بيليه الخرز. عناية جمع supernatants دون إزعاج الخرز، ونقل العينات إلى 1.5 مل أنابيب صغيرة-أجهزة الطرد المركزي. العينات التي يمكن تحليلها بواسطة لطخة غربية أو تخزينها في-20 درجة مئوية لاستخدامها في وقت لاحق.

3. لطخة الغربية

  1. تحميل إيمونوبريسيبيتيشن أو هدم العينات التي تم الحصول عليها من الخطوات السابقة إلى 4-20% التدرج الحزب الديمقراطي الصربي صفحة المواد الهلامية. إجراء التفريد في 120 الخامس لمدة 90 دقيقة لفصل البروتينات.
  2. نقل البروتينات من الجل إلى غشاء ثنائي الفلوريد (PVDF) الفينيليدن من اليكتروبلوتينج في 300 mA لمدة 90 دقيقة في 4 درجات مئوية باستخدام أسلوب نقل الدبابات. كتلة الغشاء PVDF في المخزن المؤقت كتلة تحتوي على الحليب الخالي (الجدول 1) 5% ح 1 في درجة حرارة الغرفة-
  3. إينكوباتي الغشاء بجسم الأولية في جسم تمييع مخزن يحتوي على 3% من ألبومين المصل البقري (BSA) (الجدول 1) بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. للأجسام المضادة الأولية، استخدام تركيز عامل 0.5 ميكروغرام/مل (الأجسام المضادة-SUMO1)، أو إضعاف 1:2000 (الأجسام المضادة العادية المضادة ومكافحة Tubulin)، أو 1:5,000 (مكافحة-التجارة والنقل والأجسام المضادة له)-
  4. يغسل الغشاء 3 x لمدة 10 دقائق في كل مرة باستخدام 1 × تريس مخزنة المالحة مع المخزن المؤقت توين (تبسة) (الجدول 1). احتضان الغشاء مع الأنواع 1:5,000 أجسام مضادة محددة الثانوي مترافق الفجل البيروكسيديز HRP المخفف في المخزن المؤقت كتلة تحتوي على الحليب الخالي من 5 في المائة (الجدول 1). يغسل الغشاء 3 x لمدة 10 دقائق في كل مرة باستخدام المخزن المؤقت x TBST 1-
  5. احتضان الغشاء مع تشيميلومينيسسينسي المحسنة (القامة) يعمل الحل. تغطي الغشاء مع غلاف بلاستيكي وتعريضه للأشعة السينية الفيلم تبعاً لقوة إشارة-

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

للكشف عن "سومويليشن م ع" الذاتية أثناء تقدم دورة الخلية، مزامنة هذه الدراسة أولاً خلايا HEK293 في خمس مراحل مختلفة من دورة الخلية (G0 المبكر G1، G1, S و G2/M) كما هو موضح في قسم البروتوكول في هذه الورقة. وأكد جودة المزامنة باستخدام الحمض النووي وصمة عار مع يوديد propidium يليها تحليل التدفق الخلوي (الشكل 1). بعد ذلك، جمع الخلايا وتفكيك قبل يشوه ريبا المخزن المؤقت. السومو مثبطات البروتياز، N-اثيلماليميدي، أضيفت إلى تركيز 20 مم للحفاظ على إشارة سومو الأصلية خلا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

وتصف هذه الورقة وضع بروتوكول لكشف وتحليل سومويلاتيون الذاتية "للميزانية العادية" في الخلايا البشرية. كما أن هذا الأسلوب هو تركز تحديداً على البروتين Rb الذاتية دون أي تناوب الإشارات العالمية المتصلة سومو، أنها أداة مهمة للتحقيق في تعديل الميزانية العادية-سومو الظروف الفسيولوجية طبيعية تماما.

ولتحقيق هذا الهدف، من المهم أن نضع في اعتبارنا أن: 1) على الرغم من أن سومو تضم أربعة إيسوفورمس (SUMO1-4، كل مرمزة بواسطة جينات مختلفة) بالمقارنة مع أوبيكويتينيشن، جميع أنواع سومو وفيرة أقل بكثير؛ 2) بالنسب...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

وأيد هذه الدراسة المنح من العلم والتكنولوجيا لجنة شانغهاي (المنحة رقم 14411961800) ومؤسسة العلوم الطبيعية الصينية الوطنية (المنحة رقم 81300805).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific11995065
Opti-MEM ثيرمو فيشر 31985070
سيروم الأبقار الجنينية (FBS)ثيرمو فيشر العلمي26140079
البنسلين - الستربتومايسينثيرمو فيشر العلمي15140122
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)ثيرمو فيشر العلمي10010023
التربسين-EDTAثيرمو فيشر العلمي25200056
ثيميدينسيجماT9250
نوكودازولسيجماM1404
بروبيديوم يوديدثيرمو فيشر العلميP3566
تريتون X-100 & nbsp ؛AMRESCO694
RNase A ثيرمو فيشر العلميEN0531
N-إيثيل ماليميدسيجماE3876   ؛
كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS)بديل AMRESCOM107
Nonidet P-40 (NP-40)AMRESCOM158
Roche5892970001
Mouse Immunobulin G (IgG)SantaCruz Biotechnologysc-2025
تقنية إشارات الخلايابالأجسام المضادة# 9309
البروتين A / G-Sepharose الخرزسانتا كروز التكنولوجيا الحيويةSC-2003
Lipofectamine-2000  ثيرمو فيشر11668019
حمض نيتريلوتري أسيتيك النيكل (Ni-NTA) حبات الاغاروزQiagen30230
ImidazoleSigmaI0250
4٪ -20٪ Gradient SDS-PAGE GelBIO-RAD4561096
غشاء بولي فينيلدين ثنائي فلوريد (PVDF)ميليبورIPVH00010
توين -20أمريسكوالأجسام المضادة M147
TubulinAbmartM30109
SUMO1 الجسم المضادThermo Fisher Scientific33-2044
GFP الجسم المضادAbmartM20004
الفجل بيروكسيداز (HRP) الجسم المضاد الثانويمختبرات جاكسون للأبحاثالمناعية 715-035-150
طقم التلألؤ الكيميائي المعزز (ECL)ثيرمو فيشر علمي32106
السينتفوليكمثبط البروتياز Rb العلمي

المراجع

  1. Bertoli, C., Skotheim, J. M., de Bruin, R. A. Control of cell cycle transcription during G1 and S phases. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (8), 518-528 (2013).
  2. Massague, J. G1 cell-cycle control and cancer. Nature. 432 (7015), 298-306 (2004).
  3. Weinberg, R. A. The retinoblastoma protein and cell cycle control. Cell. 81 (3), 323-330 (1995).
  4. Giacinti, C., Giordano, A. RB and cell cycle progression. Oncogene. 25 (38), 5220-5227 (2006).
  5. Burkhart, D. L., Sage, J. Cellular mechanisms of tumour suppression by the retinoblastoma gene. Nat Rev Cancer. 8 (9), 671-682 (2008).
  6. Ferreira, R., Naguibneva, I., Pritchard, L. L., Ait-Si-Ali, S., Harel-Bellan, A. The Rb/chromatin connection and epigenetic control: opinion. Oncogene. 20 (24), 3128-3133 (2001).
  7. Hilgendorf, K. I., et al. The retinoblastoma protein induces apoptosis directly at the mitochondria. Genes Dev. 27 (9), 1003-1015 (2013).
  8. Munro, S., Carr, S. M., La Thangue, N. B. Diversity within the pRb pathway: is there a code of conduct. Oncogene. 31 (40), 4343-4352 (2012).
  9. Macdonald, J. I., Dick, F. A. Posttranslational modifications of the retinoblastoma tumor suppressor protein as determinants of function. Genes Cancer. 3 (11-12), 619-633 (2012).
  10. Ezhevsky, S. A., et al. Hypo-phosphorylation of the retinoblastoma protein (pRb) by cyclin D:Cdk4/6 complexes results in active pRb. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (20), 10699-10704 (1997).
  11. Ledl, A., Schmidt, D., Muller, S. Viral oncoproteins E1A and E7 and cellular LxCxE proteins repress SUMO modification of the retinoblastoma tumor suppressor. Oncogene. 24 (23), 3810-3818 (2005).
  12. Li, T., et al. Expression of SUMO-2/3 induced senescence through p53- and pRB-mediated pathways. J Biol Chem. 281 (47), 36221-36227 (2006).
  13. Meng, F., Qian, J., Yue, H., Li, X., Xue, K. SUMOylation of Rb enhances its binding with CDK2 and phosphorylation at early G1 phase. Cell Cycle. 15 (13), 1724-1732 (2016).
  14. Geiss-Friedlander, R., Melchior, F. Concepts in sumoylation: a decade on. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (12), 947-956 (2007).
  15. Flotho, A., Melchior, F. Sumoylation: a regulatory protein modification in health and disease. Annu Rev Biochem. 82, 357-385 (2013).
  16. Eifler, K., Vertegaal, A. C. SUMOylation-Mediated Regulation of Cell Cycle Progression and Cancer. Trends Biochem Sci. 40 (12), 779-793 (2015).
  17. Wilkinson, K. A., Henley, J. M. Mechanisms, regulation and consequences of protein SUMOylation. Biochem J. 428 (2), 133-145 (2010).
  18. Gill, G. SUMO and ubiquitin in the nucleus: different functions, similar mechanisms. Genes Dev. 18 (17), 2046-2059 (2004).
  19. Sharma, P., Kuehn, M. R. SENP1-modulated sumoylation regulates retinoblastoma protein (RB) and Lamin A/C interaction and stabilization. Oncogene. 35 (50), 6429-6438 (2016).
  20. Jakobs, A., et al. Ubc9 fusion-directed SUMOylation (UFDS): a method to analyze function of protein SUMOylation. Nat Methods. 4 (3), 245-250 (2007).
  21. Gareau, J. R., Lima, C. D. The SUMO pathway: emerging mechanisms that shape specificity, conjugation and recognition. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (12), 861-871 (2010).
  22. Bernier-Villamor, V., Sampson, D. A., Matunis, M. J., Lima, C. D. Structural basis for E2-mediated SUMO conjugation revealed by a complex between ubiquitin-conjugating enzyme Ubc9 and RanGAP1. Cell. 108 (3), 345-356 (2002).
  23. Saitoh, H., Hinchey, J. Functional heterogeneity of small ubiquitin-related protein modifiers SUMO-1 versus SUMO-2/3. J Biol Chem. 275 (9), 6252-6258 (2000).
  24. Ayaydin, F., Dasso, M. Distinct in vivo dynamics of vertebrate SUMO paralogues. Mol Biol Cell. 15 (12), 5208-5218 (2004).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

Rb Rb SUMO HEK293 G1
في فيفو كشف وتحليل م ع سومويليشن البروتين في الخلايا البشرية
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.